引用本文： 丁永杰, 张本炎, 李敏. 辛伐他汀早期与后期干预野百合碱诱导肺动脉高压大鼠的研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2017, 16(1): 64-70. doi: 10.7507/1671-6205.201606049 复制
肺动脉高压是一类以各种肺内或肺外疾病引起的，以肺动脉压力和肺血管阻力进行性升高为特征，最终导致右心功能受损、甚至死亡的严重疾病，对人类健康造成了严重危害[1]。动脉型肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是肺动脉高压最常见的类型。据美国国立卫生研究院登记资料显示，特发性肺动脉高压（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）患者平均生存年限仅 2.8 年，而结缔组织相关 PAH 则更差[2]。目前虽已有多种 PAH 靶向药物及联合治疗模式先后问世，但相关药物价格昂贵，使用不便，预后仍不尽理想[3]，3 年病死率仍维持在 20%～40%[4]。越来越多的研究发现，严重 PAH 具有类似肿瘤的不可逆的生长特征[5–6]，治疗非常棘手。PAH 发病机制目前尚不明确，但血管收缩、血管重构和原位血栓形成被认为是 PAH 发生、发展的重要病理生理基础；血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和血小板等细胞均参与其病理过程[7]。这些结果促使我们考虑目前 PAH 治疗“时机”是否恰当，当前药物选择的“靶点”是否正确。推测如在血管内皮细胞发生破坏之前对血管内皮细胞实施干预保护，可能阻断 PAH 的病理进程，延缓、减轻、甚至避免肺血管重构的发生。
他汀类药物目前被广泛用于调脂治疗。由于其具有的抗炎、抗氧化、抗增殖、促凋亡等药理作用，被认为具有内皮保护功能。动物实验研究发现他汀类药物可改善 PAH 动物模型的血流动力学状态，并减轻血管重构[8–9]。临床研究也发现在西地那非基础上联合他汀类药物较西地那非单药治疗可获得更明显的临床疗效，且使用相当安全，预示着他汀类药物在 PAH 中良好的应用前景[10]。但在上述所有研究中，他汀类均作为治疗性药物，在已经存在肺动脉高压的动物或患者上使用。而他汀类是否可作为预防性药物，在发生血管内皮细胞破坏之初即血管重构前应用，是否可获得更大的效果，目前所完成的研究不能很好地回答。因此，我们设计此实验，在野百合碱（MCT）诱导 PAH（MCT-PAH）大鼠模型的两个阶段，即血管重构形成前后，给予他汀类药物，观察大鼠一般情况、血流动力学参数及肺血管病理形态学变化，为今后制订更合理的给药方式提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 6 周龄 SPF 级雄性 SD 大鼠，体重 174～202 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，在上海瑞金医院动物实验室寄养，室温保持在（23±1）℃，明暗 12 h 交替，饲料及饮水由动物实验室提供。动物饲养符合《上海市实验动物管理办法》。
1.1.2 主要仪器 PE-50 聚乙烯导管（美国健康医疗器械国际公司）、三通旋塞（上海百特医疗用品贸易有限公司）、PowerLab 8/30 多导生理记录仪及其配套的压力换能器（澳大利亚埃德仪器国际贸易公司）、Image-pro plus 6.0 图像分析系统（美国 Media Cybernetics 公司）
1.1.3 主要试剂 MCT（上海纯优生物科技有限公司）、辛伐他汀片（杭州默沙东制药有限公司）。
1.2 实验分组和处理
SD 大鼠 24 只，随机分成 4 个实验组：对照组、PAH 组、早期干预组和后期干预组。每组 6 只。PAH 组、早期干预组、后期干预组大鼠予 MCT 50 mg/kg 一次性腹腔注射诱导大鼠形成 PAH，对照组一次性腹腔注射同等体积生理盐水。早期干预组：将辛伐他汀研碎后，生理盐水溶解配制成4 mg/ml 悬液，于 MCT 腹腔注射前 7 d 起每日予辛伐他汀（20 mg/kg）灌胃，造模当日暂停 1 次，造模次日起继续灌胃至第 14 d（d–7～d–1，d1～d14），第15 d 起予以同等体积生理盐水灌胃至第 35 d，共 21 d（d15～d35）。后期干预组：于 MCT 腹腔注射前7 d 起，予同等体积生理盐水灌胃，造模当日暂停1 次，造模次日起继续灌胃至第 14 d（d–7~d–1，d1～d14），造模第 15 d 起，每日予辛伐他汀（20 mg/kg）灌胃至第 35 d，共 14 d（d15～d35）。每日固定时间测量体重，按体重精确计量给药。对照组：于造模前 7 d 天（d–7）起，每日给予同等体积生理盐水灌胃，造模当日暂停灌胃 1 次，造模次日起继续灌胃至第 35 d，共 42 d（d–7～d–1，d1～d35）。
1.3 检测指标
1.3.1 血液动力学 大鼠以 10% 水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手术台上，常规气管插管后，于大鼠颈部做正中切口，暴露右侧颈外静脉和颈总静脉，右颈总静脉下穿入 2 根 2–0 手术线备用，远心端丝线结扎，近心端丝线用止血钳夹持，并使右颈总静脉近心端保持一定张力，以眼科剪于丝线结扎点近心 4 mm 处，向近心端 45° 角斜行剪开血管直径的 1/3，迅速插入 PE-50 导管，缓慢向前推进导管，同时观察生理记录仪显示屏上波形、压力值及导管进入长度，以判断是否进入右心室及肺动脉，如遇阻力，不可硬推，缓慢旋转进入。当出现典型肺动脉压力波形后，稳定 5 min 后记录。
1.3.2 右心室肥厚指数（RVHI） 将完整心肺一同取出，游离心脏，沿房室沟剪去心房及大血管根部，沿后室壁沟将右心室游离壁分离，滤纸吸干水分，用电子天平称量右心室游离壁质量（RV）及左心室加室间隔质量（LV+S），RV/（LV+S）作为 RVHI。
1.3.3 肺组织病理学 右肺中下部肺小动脉近乎上下垂直走向，沿水平面即垂直于肺小动脉走形方向，横断切下厚约 3 mm 肺组织，置入包埋盒，备 HE 染色用。邀请病理科医师，显微镜下双盲阅片，光镜下（×400）观察 HE 染色切片切片，随机选取直径 50～150 μm 范围的肺小动脉 15 支，采用 Image-pro plus 6.0 图像采集处理系统，计算肺小动脉中膜厚度（WT）和血管的外径（ED）。根据公式（WT×2/ED×100%），计算出中膜厚度百分比（WT%）。每张 HE 染色切片随机选取直径 50～150 μm 肺小动脉 10 根，观察小动脉周围炎性细胞浸润情况，按浸润程度记分：0 分（无炎性细胞浸润），1 分（炎性细胞浸润血管壁周围不超过 25%），2 分（炎性细胞浸润血管壁周围 25%～50%），3 分（炎性细胞浸润血管壁周围 50%～75%，4 分（炎性细胞浸润血管壁周围 75% 以上）。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（ ）表示，采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠一般情况
各组所有动物均存活至第 5 周末，无自发性死亡。入组时（0 周）各组大鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）。从造模后第 7 d 起，PAH 组、后期干预组大鼠出现活动迟缓，毛色晦暗，进食减少，呼吸急促，体重增加不明显。在 1、4、5 周时，早期干预组体重较对照组低，差异有统计学意义（P＜0.05），而在 2、3 周时差异无统计学意义（P＞0.05）。早期干预与 PAH 组比较，在 1～5 周时体重差异有统计学意义（P＜0.01）。早期干预组大鼠体重 1 周时高于后期干预组（P＜0.05），在 2～5 周时均显著高于后期干预组大鼠（P＜0.01）。结果见表 1。提示辛伐他汀早期干预较后期干预能更显著地改善 PAH 大鼠呼吸困难相关症状，更接近正常体重增加速度。
表1
各组大鼠不同时点体重变化比较（n=6，g，
）
2.2 mPAP、RVSP 及 RVHI 的改变
PAH 组大鼠与对照组大鼠比较，mPAP、RVSP、RVHI 均显著升高，差异均具有显著统计学意义（P＜0.01），提示造模成功；早期干预组大鼠与 PAH 组大鼠比较，mPAP、RVSP、RVHI 显著降低（P＜0.01）。早期干预组大鼠与对照组大鼠比较，mPAP、RVSP 差异无统计学意义（P＞0.05），而 RVHI 差异有统计学意义（P＜0.05）。早期干预组与后期干预组间比较，mPAP、RVSP 均显著降低（P＜0.05），而 RVHI 差异无统计学意义（P＞0.05）。后期干预组大鼠与 PAH 组大鼠比较，mPAP、RVSP、RVHI均有显著变化（P均＜0.01）；后期干预组与对照组比较，mPAP、RVSP、RVHI均显著升高（P＜0.01）。结果见表 2和图 1。
表2
各组大鼠 RVSP、mPAP、RVHI、WT%、肺小动脉周围炎症评分的比较（n=6，
）
图1
大鼠 mPAP 的变化 a. 对照组； b. PAH 组； c. 早期干预组； d. 后期干预组
2.3 肺小动脉 WT%
PAH 组肺小动脉中膜明显增厚，WT% 较对照组明显增加（P＜0.01）。早期干预组、后期干预组较对照组 WT% 显著增加（P＜0.01），但较 PAH 组明显降低（P＜0.01）。早期干预组与后期干预组间比较，WT% 显著下降（P＜0.01）。结果见表 2和图 2。
图2
各组大鼠肺小动脉 HE 染色（×400） a. 对照组； b. PAH 组； c. 早期干预组； d. 后期干预组
2.4 肺小动脉周围炎症评分
对照组大鼠肺组织切片 HE 染色发现，肺小动脉周围无明显炎性细胞浸润，血管周围炎症评分低。 PAH 组大鼠肺组织切片可见肺小动脉周围有明显的炎性细胞浸润，血管周围炎症评分高于对照组（P＜0.05）。早期干预与后期干预组肺小动脉周围可见较多炎性细胞浸润，炎症评分高于对照组（P＜0.05），但低于 PAH 组（P＜0.05）。早期干预组与后期干预组间比较，炎症评分差异无统计学意义（P＜0.05）。结果见表 2。
3 讨论
PAH 是由多种病因引起的、预后极差的一类疾病，临床并不少见。以结缔组织疾病为例，PAH 在混合型结缔组织疾病和系统性硬化症中的发病率分别可达到 23%～53% 和 12%～40%，在系统性红斑狼疮中为 4.3%～5.8%，而且随着临床检测技术的提高，其检出率有升高的趋势[11]。PAH起病隐匿，早期易漏诊或误诊，诊断时往往已发生了严重的血管重构，预后不佳。目前研究热点主要集中在对肺血管重构形成后的干预，如临床上使用的前列环素及其类似物、内皮肽 1 拮抗剂、5-酸二酯酶抑制剂等 PAH 靶向药物。这些药物虽可部分改善血流动力学状态，甚至延长生存时间，但仍无法抑制和逆转肺血管重构，致使疾病后期药物效果不佳。另外 PAH 靶向药物价格昂贵，给药方式复杂，使得长期用药及联合用药受到限制。截止目前，PAH 仍是一种无法治愈的“绝症”。近期研究显示，一旦肺血管发生明显的血管重构，相关肺血管细胞往往具有类似肿瘤的生长特征[5–6]，使得治疗非常棘手。因此，预防或减轻血管重构可能改变 PAH 的病理进程，是改善 PAH 患者预后的关键。致病因素，如缺氧、机械剪切力、炎症、毒物等均可使肺血管内皮细胞结构、功能、代谢发生改变，导致血管舒张/收缩因子、促凝/抗凝因子、增殖/凋亡因子等多种血管活性物质失衡，成为肺血管重构的始动因素[12]。若早期通过保护血管内皮细胞，减轻各种致病因素对内皮细胞的影响，理论上可以延缓 PAH 的病理进程。
MCT-PAH 大鼠模型的严重程度及病理过程与人类 PAH 相似，目前被认为是 PAH 经典的动物模型[13]。虽然迄今尚不清楚其确切的机制，但血管内皮细胞损伤被认为起着关键作用[14]。MCT 进入体内后，代谢成为具有生物毒性的吡咯野百合碱，随血流流经肺循环时可直接损伤肺血管内皮细胞。大量动物研究证实，MCT 给药数小时后，肺血管内皮细胞即出现空泡变性，通透性增加，进而发生肺水肿；1 周时非肌型动脉发生肌化，肌型动脉血管平滑肌细胞（VSMC）明显增生肥厚；第 14 d 时可形成 PAH，并持续进展，其严重程度与中膜肌层增生相一致[15–16]，进而出现右心肥大，最终死亡。内皮损伤破坏了内皮细胞的屏障作用以及内皮细胞和平滑肌细胞之间的肌-内皮连接，也破坏了血管内皮和肺循环所产生的血管活性物质之间的平衡以及内皮细胞对平滑肌细胞的调节，从而促使肺血管平滑肌细胞增殖，引起肺血管重构[17]。本研究采用 50 mg/kg MCT 一次性腹腔注射，给药 7 d 后，PAH 组大鼠饮食、活动减少，体重上升缓慢，呼吸急促，提示肺动脉压力可能此时发生改变；而给药 35 d 后，PAH 组大鼠 mPAP、RVSP 及 RVHI 均较对照组显著升高（P＜0.01），证实 MCT 注射 35 d 已产生严重 PAH，造模成功。
先前的动物研究已发现他汀类药物具有的抗炎、抗氧化、介导细胞凋亡、抑制细胞过度增殖等生物学效应[18]，显示了其在治疗 PAH 方面具有一定的可行性。在抗炎层面，他汀类药物通过抑制细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、E-选择素，抑制炎性细胞渗出、粘附、聚集；并可降低 γ 干扰素介导的 CD40 表达，调节内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的炎症反应[18–20]。在血管内皮细胞层面，他汀类药物通过抑制 Rho/ROCK 信号途径，增加内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）mRNA 的稳定性[21]；同时可通过上调 PI3K 信号，快速活化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶 Akt，促进 eNOS 的表达和活化[22]；此外，他汀类药物还可以解除小窝蛋白-1对eNOS的抑制作用[23]，增加 eNOS 的活性。上述途径使得血管内皮细胞产生的 L-精氨酸在 eNOS 作用下产生 NO，弥散到平滑肌细胞，激活鸟苷酸环化酶，维护正常的血管内皮依赖性的舒缩调控功能，保护血管内膜结构完整性，避免原位血栓形成，维持血管内膜的非增殖状态。他汀类药物可部分上调环氧化酶-2（COX-2）表达，增加前列环素（PGI2）的产生[24]，而 PGI2 具有强大的扩张血管、抑制平滑肌细胞增殖和抑制血小板聚集的作用；他汀类药物也可通过抑制氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）介导的内皮素-1（ET-1）的表达[25]，并影响血管紧张素Ⅱ和其Ⅰ型受体的功能，限制肺血管过度收缩[26]，并抑制肺动脉平滑肌细胞（PASMC）DNA 的合成及增殖。此外，他汀类药物可通过下调血管内皮生长因子（VEGF）或其受体表达[27]，抑或通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK 通路）而抑制血管内皮细胞增殖[28–39]；或可诱导 Rac1 表达，进而增加应激活化蛋白激酶磷酸化，诱导各种细胞凋亡[30]。在血管平滑肌层面，除内皮细胞介导的间接影响外，他汀类药物主要通过 Rho/ROCK 途径直接调节 PASMC 的增生：他汀类药物抑制 Rho GTPase，增加 p27Kipl 的表达，并通过类异戊二烯显著抑制血小板源性生长因子（PDGF）诱导的 VSMC DNA 合成，使细胞周期停滞于 G0～G1 期，从而抑制 VSMC 的增殖和迁徙[31–33]；另外，他汀类药物通过抑制 PASMC 的 GTP-RhoA 合成，抑制由 5-羟色胺介导的有丝分裂和迁移[34]。此外，可通过下调 bcl-2 和 Rho 异戊烯化诱导病态的 VSMC 凋亡[35]，或通过细胞外液钙内流增加细胞溶质的游离 Ca2+ 浓度，随后通过钙依赖的 Caspase-3 诱导 VSMC 凋亡[36]。而在成纤维细胞层面，他汀类药物减少 ET-1 和 PDGF 的生成，抑制成纤维细胞的有丝分裂，阻断外膜的成纤维细胞向内皮细胞移行并转变成类似平滑肌细胞，形成小动脉肌化，并通过降低 MAPK 活性，减少细胞外基质蛋白、弹性蛋白的合成及Ⅰ型胶原的沉积[37]。他汀类药物还可通过抗氧化途径减轻心肌肥厚[38]。他汀类药物可影响 PAH 发生、形成、加重的各个阶段，以及参与血管重构的各类细胞。
综上所述，对于易发生肺血管内皮细胞破坏的 PAH 高危人群（如结缔组织疾病、感染、药物损害、IPAH 家族史等患者），可考虑早期预防性使用辛伐他汀，改善、延缓、甚至避免 PAH 的发生，但这一结论必须通过更大规模的临床研究去进一步证实。
肺动脉高压是一类以各种肺内或肺外疾病引起的，以肺动脉压力和肺血管阻力进行性升高为特征，最终导致右心功能受损、甚至死亡的严重疾病，对人类健康造成了严重危害[1]。动脉型肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是肺动脉高压最常见的类型。据美国国立卫生研究院登记资料显示，特发性肺动脉高压（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）患者平均生存年限仅 2.8 年，而结缔组织相关 PAH 则更差[2]。目前虽已有多种 PAH 靶向药物及联合治疗模式先后问世，但相关药物价格昂贵，使用不便，预后仍不尽理想[3]，3 年病死率仍维持在 20%～40%[4]。越来越多的研究发现，严重 PAH 具有类似肿瘤的不可逆的生长特征[5–6]，治疗非常棘手。PAH 发病机制目前尚不明确，但血管收缩、血管重构和原位血栓形成被认为是 PAH 发生、发展的重要病理生理基础；血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和血小板等细胞均参与其病理过程[7]。这些结果促使我们考虑目前 PAH 治疗“时机”是否恰当，当前药物选择的“靶点”是否正确。推测如在血管内皮细胞发生破坏之前对血管内皮细胞实施干预保护，可能阻断 PAH 的病理进程，延缓、减轻、甚至避免肺血管重构的发生。
他汀类药物目前被广泛用于调脂治疗。由于其具有的抗炎、抗氧化、抗增殖、促凋亡等药理作用，被认为具有内皮保护功能。动物实验研究发现他汀类药物可改善 PAH 动物模型的血流动力学状态，并减轻血管重构[8–9]。临床研究也发现在西地那非基础上联合他汀类药物较西地那非单药治疗可获得更明显的临床疗效，且使用相当安全，预示着他汀类药物在 PAH 中良好的应用前景[10]。但在上述所有研究中，他汀类均作为治疗性药物，在已经存在肺动脉高压的动物或患者上使用。而他汀类是否可作为预防性药物，在发生血管内皮细胞破坏之初即血管重构前应用，是否可获得更大的效果，目前所完成的研究不能很好地回答。因此，我们设计此实验，在野百合碱（MCT）诱导 PAH（MCT-PAH）大鼠模型的两个阶段，即血管重构形成前后，给予他汀类药物，观察大鼠一般情况、血流动力学参数及肺血管病理形态学变化，为今后制订更合理的给药方式提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 6 周龄 SPF 级雄性 SD 大鼠，体重 174～202 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，在上海瑞金医院动物实验室寄养，室温保持在（23±1）℃，明暗 12 h 交替，饲料及饮水由动物实验室提供。动物饲养符合《上海市实验动物管理办法》。
1.1.2 主要仪器 PE-50 聚乙烯导管（美国健康医疗器械国际公司）、三通旋塞（上海百特医疗用品贸易有限公司）、PowerLab 8/30 多导生理记录仪及其配套的压力换能器（澳大利亚埃德仪器国际贸易公司）、Image-pro plus 6.0 图像分析系统（美国 Media Cybernetics 公司）
1.1.3 主要试剂 MCT（上海纯优生物科技有限公司）、辛伐他汀片（杭州默沙东制药有限公司）。
1.2 实验分组和处理
SD 大鼠 24 只，随机分成 4 个实验组：对照组、PAH 组、早期干预组和后期干预组。每组 6 只。PAH 组、早期干预组、后期干预组大鼠予 MCT 50 mg/kg 一次性腹腔注射诱导大鼠形成 PAH，对照组一次性腹腔注射同等体积生理盐水。早期干预组：将辛伐他汀研碎后，生理盐水溶解配制成4 mg/ml 悬液，于 MCT 腹腔注射前 7 d 起每日予辛伐他汀（20 mg/kg）灌胃，造模当日暂停 1 次，造模次日起继续灌胃至第 14 d（d–7～d–1，d1～d14），第15 d 起予以同等体积生理盐水灌胃至第 35 d，共 21 d（d15～d35）。后期干预组：于 MCT 腹腔注射前7 d 起，予同等体积生理盐水灌胃，造模当日暂停1 次，造模次日起继续灌胃至第 14 d（d–7~d–1，d1～d14），造模第 15 d 起，每日予辛伐他汀（20 mg/kg）灌胃至第 35 d，共 14 d（d15～d35）。每日固定时间测量体重，按体重精确计量给药。对照组：于造模前 7 d 天（d–7）起，每日给予同等体积生理盐水灌胃，造模当日暂停灌胃 1 次，造模次日起继续灌胃至第 35 d，共 42 d（d–7～d–1，d1～d35）。
1.3 检测指标
1.3.1 血液动力学 大鼠以 10% 水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手术台上，常规气管插管后，于大鼠颈部做正中切口，暴露右侧颈外静脉和颈总静脉，右颈总静脉下穿入 2 根 2–0 手术线备用，远心端丝线结扎，近心端丝线用止血钳夹持，并使右颈总静脉近心端保持一定张力，以眼科剪于丝线结扎点近心 4 mm 处，向近心端 45° 角斜行剪开血管直径的 1/3，迅速插入 PE-50 导管，缓慢向前推进导管，同时观察生理记录仪显示屏上波形、压力值及导管进入长度，以判断是否进入右心室及肺动脉，如遇阻力，不可硬推，缓慢旋转进入。当出现典型肺动脉压力波形后，稳定 5 min 后记录。
1.3.2 右心室肥厚指数（RVHI） 将完整心肺一同取出，游离心脏，沿房室沟剪去心房及大血管根部，沿后室壁沟将右心室游离壁分离，滤纸吸干水分，用电子天平称量右心室游离壁质量（RV）及左心室加室间隔质量（LV+S），RV/（LV+S）作为 RVHI。
1.3.3 肺组织病理学 右肺中下部肺小动脉近乎上下垂直走向，沿水平面即垂直于肺小动脉走形方向，横断切下厚约 3 mm 肺组织，置入包埋盒，备 HE 染色用。邀请病理科医师，显微镜下双盲阅片，光镜下（×400）观察 HE 染色切片切片，随机选取直径 50～150 μm 范围的肺小动脉 15 支，采用 Image-pro plus 6.0 图像采集处理系统，计算肺小动脉中膜厚度（WT）和血管的外径（ED）。根据公式（WT×2/ED×100%），计算出中膜厚度百分比（WT%）。每张 HE 染色切片随机选取直径 50～150 μm 肺小动脉 10 根，观察小动脉周围炎性细胞浸润情况，按浸润程度记分：0 分（无炎性细胞浸润），1 分（炎性细胞浸润血管壁周围不超过 25%），2 分（炎性细胞浸润血管壁周围 25%～50%），3 分（炎性细胞浸润血管壁周围 50%～75%，4 分（炎性细胞浸润血管壁周围 75% 以上）。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（ ）表示，采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠一般情况
各组所有动物均存活至第 5 周末，无自发性死亡。入组时（0 周）各组大鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）。从造模后第 7 d 起，PAH 组、后期干预组大鼠出现活动迟缓，毛色晦暗，进食减少，呼吸急促，体重增加不明显。在 1、4、5 周时，早期干预组体重较对照组低，差异有统计学意义（P＜0.05），而在 2、3 周时差异无统计学意义（P＞0.05）。早期干预与 PAH 组比较，在 1～5 周时体重差异有统计学意义（P＜0.01）。早期干预组大鼠体重 1 周时高于后期干预组（P＜0.05），在 2～5 周时均显著高于后期干预组大鼠（P＜0.01）。结果见表 1。提示辛伐他汀早期干预较后期干预能更显著地改善 PAH 大鼠呼吸困难相关症状，更接近正常体重增加速度。
表1
各组大鼠不同时点体重变化比较（n=6，g，
）
2.2 mPAP、RVSP 及 RVHI 的改变
PAH 组大鼠与对照组大鼠比较，mPAP、RVSP、RVHI 均显著升高，差异均具有显著统计学意义（P＜0.01），提示造模成功；早期干预组大鼠与 PAH 组大鼠比较，mPAP、RVSP、RVHI 显著降低（P＜0.01）。早期干预组大鼠与对照组大鼠比较，mPAP、RVSP 差异无统计学意义（P＞0.05），而 RVHI 差异有统计学意义（P＜0.05）。早期干预组与后期干预组间比较，mPAP、RVSP 均显著降低（P＜0.05），而 RVHI 差异无统计学意义（P＞0.05）。后期干预组大鼠与 PAH 组大鼠比较，mPAP、RVSP、RVHI均有显著变化（P均＜0.01）；后期干预组与对照组比较，mPAP、RVSP、RVHI均显著升高（P＜0.01）。结果见表 2和图 1。
表2
各组大鼠 RVSP、mPAP、RVHI、WT%、肺小动脉周围炎症评分的比较（n=6，
）
图1
大鼠 mPAP 的变化 a. 对照组； b. PAH 组； c. 早期干预组； d. 后期干预组
2.3 肺小动脉 WT%
PAH 组肺小动脉中膜明显增厚，WT% 较对照组明显增加（P＜0.01）。早期干预组、后期干预组较对照组 WT% 显著增加（P＜0.01），但较 PAH 组明显降低（P＜0.01）。早期干预组与后期干预组间比较，WT% 显著下降（P＜0.01）。结果见表 2和图 2。
图2
各组大鼠肺小动脉 HE 染色（×400） a. 对照组； b. PAH 组； c. 早期干预组； d. 后期干预组
2.4 肺小动脉周围炎症评分
对照组大鼠肺组织切片 HE 染色发现，肺小动脉周围无明显炎性细胞浸润，血管周围炎症评分低。 PAH 组大鼠肺组织切片可见肺小动脉周围有明显的炎性细胞浸润，血管周围炎症评分高于对照组（P＜0.05）。早期干预与后期干预组肺小动脉周围可见较多炎性细胞浸润，炎症评分高于对照组（P＜0.05），但低于 PAH 组（P＜0.05）。早期干预组与后期干预组间比较，炎症评分差异无统计学意义（P＜0.05）。结果见表 2。
3 讨论
PAH 是由多种病因引起的、预后极差的一类疾病，临床并不少见。以结缔组织疾病为例，PAH 在混合型结缔组织疾病和系统性硬化症中的发病率分别可达到 23%～53% 和 12%～40%，在系统性红斑狼疮中为 4.3%～5.8%，而且随着临床检测技术的提高，其检出率有升高的趋势[11]。PAH起病隐匿，早期易漏诊或误诊，诊断时往往已发生了严重的血管重构，预后不佳。目前研究热点主要集中在对肺血管重构形成后的干预，如临床上使用的前列环素及其类似物、内皮肽 1 拮抗剂、5-酸二酯酶抑制剂等 PAH 靶向药物。这些药物虽可部分改善血流动力学状态，甚至延长生存时间，但仍无法抑制和逆转肺血管重构，致使疾病后期药物效果不佳。另外 PAH 靶向药物价格昂贵，给药方式复杂，使得长期用药及联合用药受到限制。截止目前，PAH 仍是一种无法治愈的“绝症”。近期研究显示，一旦肺血管发生明显的血管重构，相关肺血管细胞往往具有类似肿瘤的生长特征[5–6]，使得治疗非常棘手。因此，预防或减轻血管重构可能改变 PAH 的病理进程，是改善 PAH 患者预后的关键。致病因素，如缺氧、机械剪切力、炎症、毒物等均可使肺血管内皮细胞结构、功能、代谢发生改变，导致血管舒张/收缩因子、促凝/抗凝因子、增殖/凋亡因子等多种血管活性物质失衡，成为肺血管重构的始动因素[12]。若早期通过保护血管内皮细胞，减轻各种致病因素对内皮细胞的影响，理论上可以延缓 PAH 的病理进程。
MCT-PAH 大鼠模型的严重程度及病理过程与人类 PAH 相似，目前被认为是 PAH 经典的动物模型[13]。虽然迄今尚不清楚其确切的机制，但血管内皮细胞损伤被认为起着关键作用[14]。MCT 进入体内后，代谢成为具有生物毒性的吡咯野百合碱，随血流流经肺循环时可直接损伤肺血管内皮细胞。大量动物研究证实，MCT 给药数小时后，肺血管内皮细胞即出现空泡变性，通透性增加，进而发生肺水肿；1 周时非肌型动脉发生肌化，肌型动脉血管平滑肌细胞（VSMC）明显增生肥厚；第 14 d 时可形成 PAH，并持续进展，其严重程度与中膜肌层增生相一致[15–16]，进而出现右心肥大，最终死亡。内皮损伤破坏了内皮细胞的屏障作用以及内皮细胞和平滑肌细胞之间的肌-内皮连接，也破坏了血管内皮和肺循环所产生的血管活性物质之间的平衡以及内皮细胞对平滑肌细胞的调节，从而促使肺血管平滑肌细胞增殖，引起肺血管重构[17]。本研究采用 50 mg/kg MCT 一次性腹腔注射，给药 7 d 后，PAH 组大鼠饮食、活动减少，体重上升缓慢，呼吸急促，提示肺动脉压力可能此时发生改变；而给药 35 d 后，PAH 组大鼠 mPAP、RVSP 及 RVHI 均较对照组显著升高（P＜0.01），证实 MCT 注射 35 d 已产生严重 PAH，造模成功。
先前的动物研究已发现他汀类药物具有的抗炎、抗氧化、介导细胞凋亡、抑制细胞过度增殖等生物学效应[18]，显示了其在治疗 PAH 方面具有一定的可行性。在抗炎层面，他汀类药物通过抑制细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、E-选择素，抑制炎性细胞渗出、粘附、聚集；并可降低 γ 干扰素介导的 CD40 表达，调节内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的炎症反应[18–20]。在血管内皮细胞层面，他汀类药物通过抑制 Rho/ROCK 信号途径，增加内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）mRNA 的稳定性[21]；同时可通过上调 PI3K 信号，快速活化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶 Akt，促进 eNOS 的表达和活化[22]；此外，他汀类药物还可以解除小窝蛋白-1对eNOS的抑制作用[23]，增加 eNOS 的活性。上述途径使得血管内皮细胞产生的 L-精氨酸在 eNOS 作用下产生 NO，弥散到平滑肌细胞，激活鸟苷酸环化酶，维护正常的血管内皮依赖性的舒缩调控功能，保护血管内膜结构完整性，避免原位血栓形成，维持血管内膜的非增殖状态。他汀类药物可部分上调环氧化酶-2（COX-2）表达，增加前列环素（PGI2）的产生[24]，而 PGI2 具有强大的扩张血管、抑制平滑肌细胞增殖和抑制血小板聚集的作用；他汀类药物也可通过抑制氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）介导的内皮素-1（ET-1）的表达[25]，并影响血管紧张素Ⅱ和其Ⅰ型受体的功能，限制肺血管过度收缩[26]，并抑制肺动脉平滑肌细胞（PASMC）DNA 的合成及增殖。此外，他汀类药物可通过下调血管内皮生长因子（VEGF）或其受体表达[27]，抑或通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK 通路）而抑制血管内皮细胞增殖[28–39]；或可诱导 Rac1 表达，进而增加应激活化蛋白激酶磷酸化，诱导各种细胞凋亡[30]。在血管平滑肌层面，除内皮细胞介导的间接影响外，他汀类药物主要通过 Rho/ROCK 途径直接调节 PASMC 的增生：他汀类药物抑制 Rho GTPase，增加 p27Kipl 的表达，并通过类异戊二烯显著抑制血小板源性生长因子（PDGF）诱导的 VSMC DNA 合成，使细胞周期停滞于 G0～G1 期，从而抑制 VSMC 的增殖和迁徙[31–33]；另外，他汀类药物通过抑制 PASMC 的 GTP-RhoA 合成，抑制由 5-羟色胺介导的有丝分裂和迁移[34]。此外，可通过下调 bcl-2 和 Rho 异戊烯化诱导病态的 VSMC 凋亡[35]，或通过细胞外液钙内流增加细胞溶质的游离 Ca2+ 浓度，随后通过钙依赖的 Caspase-3 诱导 VSMC 凋亡[36]。而在成纤维细胞层面，他汀类药物减少 ET-1 和 PDGF 的生成，抑制成纤维细胞的有丝分裂，阻断外膜的成纤维细胞向内皮细胞移行并转变成类似平滑肌细胞，形成小动脉肌化，并通过降低 MAPK 活性，减少细胞外基质蛋白、弹性蛋白的合成及Ⅰ型胶原的沉积[37]。他汀类药物还可通过抗氧化途径减轻心肌肥厚[38]。他汀类药物可影响 PAH 发生、形成、加重的各个阶段，以及参与血管重构的各类细胞。
综上所述，对于易发生肺血管内皮细胞破坏的 PAH 高危人群（如结缔组织疾病、感染、药物损害、IPAH 家族史等患者），可考虑早期预防性使用辛伐他汀，改善、延缓、甚至避免 PAH 的发生，但这一结论必须通过更大规模的临床研究去进一步证实。
