引用本文： 胡博, 栾正刚. 普通肝素改善高迁移率族蛋白 1 介导的血管内皮细胞屏障通透性增加的实验研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2017, 16(1): 29-33. doi: 10.7507/1671-6205.201607045 复制
脓毒症（sepsis）是指由感染引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），涉及失控的全身炎症反应、凝血功能异常、免疫功能障碍、内皮细胞及组织损伤等。全身炎症反应是脓毒症感染性休克的标志之一，血管内皮细胞为炎症反应的调节和放大提供了重要的场所[1]，是脓毒症损伤的靶器官之一[2]。高迁移率族蛋白 1（high-mobility group box-1 protein，HMGB1）作为新的潜在晚期炎症介质，参与了脓毒症的发病过程，可激活血管内皮细胞，介导内皮细胞屏障功能不全，进而导致毛细血管渗漏，介导肺损伤、急性肺水肿等，是内毒素致死效应的重要晚期因子[3]。普通肝素（unfractionated heparin，UFH）是一种复杂的糖胺聚糖，是最常使用的抗凝药物。它可以通过抑制白细胞粘附活化，抑制补体的激活，保护血管内皮细胞免受趋化因子、组胺、细菌内毒素及氧自由基等损伤，以及维持内皮细胞屏障的完整性等[4]，但其机制不完全明晰。本研究旨在探讨 UFH 改善 HMGB1 介导的血管内皮细胞屏障通透性增加的作用及机制。
1 材料与方法
1.1 材料
人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）株购于南京凯基生物科技发展有限公司。0.25% 胰蛋白酶、DMEM 培养液购于 Gibco 公司。肝素钠购于南京新百药业有限公司。人重组 HMGB1（recombinant human high-mobility group box 1，rhHMGB1）购于美国 Proteintech 公司。Transwell 聚碳脂膜购于美国 Costar 公司。ZO-1 抗体（mouse anti-ZO-1 monoclonal antibody），4′, 6- 二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）及异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠 IgG 购于美国 Sigma 公司。核因子 -κB（NF-κB）p65 抗体、BCA 蛋白定量试剂盒、细胞核蛋白抽提试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 内皮细胞培养 经胰蛋白酶消化后种植于培养瓶内，加入 3～5 ml DMEM 完全培养液置于 5% CO2、37 ℃ 条件下细胞培养箱中培养，约 2～3 d 铺满。镜下融合生长至 80%。细胞传代，待细胞融合生长至 80% 时用于实验。
1.2.2 实验分组 将细胞分为 4 组（n = 5 ）：空白对照组（加入等量PBS）、HMGB1 处理组（100 ng/ml）、UFH 对照组（UFH 10 U/ml）、HMGB1 及 UFH 处理组（100 ng/ml HMGB1 + UFH 10 U/ml）。
1.2.3 细胞存活率的检测 将内皮细胞以 1 ×104/孔的浓度接种于 96 孔培养板中，置孵育箱 24 h 后内皮细胞呈单层生长，加入以不同浓度 rhHMGB1 刺激因素，分别为 0 、10、50、100、150 ng/ml 继续孵育 24 h。后每孔加入 20 μl MTT，培养 4 h，加入二甲基亚砜（DMSO）150 ml，充分振荡 10 min，酶标仪测定 490 nm 处各孔的吸光值（OD）。
1.2.4 内皮细胞通透性实验 人脐内皮细胞种植 Transwell 上层小室上，培养 24 h，待细胞生长融合成单层内皮细胞后，更换无血清培养液饥饿细胞 4 h 进行渗透性研究。取 24 孔培养的细胞随机进行分组，每组 3 孔分别加入上述不同刺激因素，同时加入含有 FITC 标记的葡聚糖（FD40）于 DMEM 中总体积共 100 μl，培养 5 min 后从下室抽取 200 μl 培养液做为基础值，补充下室培养液后继续培养。分别于刺激后 1 、3 、6 、12 及 24 h 分别从下室取 200 μl 培养液进行 FD40 荧光强度测定，并用 50 μl DMEM 培养基给予补充。用荧光分光光度计检测 FITC 的荧光发射强度。各实验组测量值与其基础值的差值为 FD40 的荧光强度，该实验每组均重复 3 次并取平均值。
1.2.5 胞质紧密粘连蛋白 -1（ZO-1）免疫荧光染色 细胞贴壁生长至对数生长期，经 0.25% 胰蛋白酶消化，将细胞悬液以 1 ×105 细胞/孔接种于盖玻片上。至细胞贴壁融合至 80% 后，予不含胎牛血清的 DMEM 液培养 24 h。待细胞同步化后，分别给予 PBS、rhHMGB1、UFH、rhHMGB1+UFH（UFH 提前 15 min）培养 24 h； 4% 多聚甲醛固定 30 min；0.2% Tritonx-100 透化；加入鼠抗人 ZO-1 原代抗体 2 μl 于 0.1% BSA 封闭 1 h；5% 的 BSA 中，4 ℃ 孵育过夜；加入 FITC 标记的羊抗鼠 IgG 100 μl，37 ℃ 避光封闭 1 h，DAPI 染核；50% 甘油封片，荧光显微镜下照相。
1.2.6 蛋白印迹法测定 ZO-1 蛋白表达 细胞培养同前，给予分组刺激后提取蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，根据检测结果，用 RIPA 裂解液调整各标本至相同的蛋白浓度；蛋白变性后经 SDS-PAGE 电泳，转印于 PVDF 膜上；5% BSA 中 4 ℃ 封闭过夜；加入鼠抗 ZO-l 原代抗体（1∶500），4 ℃ 孵育过夜；加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG（1∶5 000） 二抗孵育 2 h；显色后应用 Image J 图像分析软件进行分析，测定每条蛋白电泳带的灰度值，分析蛋白表达情况。
1.2.7 蛋白印迹法测定细胞核内 NF-κB 的含量 细胞予不同刺激培养后，严格按照细胞核蛋白抽提试剂盒说明书操作，提取胞核蛋白；按照 BCA 法定量蛋白浓度；蛋白变性后，经 SDS-PAGE 电泳，转印记于 PVDF 膜；5%BSA 中 4 ℃ 封闭过夜；加入抗 NF-κB p65 抗体 4 ℃ 孵育过夜；次日用 TBST 洗涤后加入相应辣根酶标记的二抗，室温孵育 2 h；洗涤后显色，分析蛋白表达情况。
1.3 统计学方法
使用 SPSS 13.0 专业统计软件进行统计学分析，实验结果用均数 ± 标准差（ ±s）表示，经参数或者非参数方差检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度 HMGB1 刺激下细胞存活率变化
与空白组比较，不同浓度的 rhHMGB1 对内皮细胞存活率均无显著影响（P＞0.05），结果见图 1。
图1
不同浓度 HMGB1 对内皮细胞存活率的影响
2.2 Transwell 法测定内皮细胞通透性
经 rhHMGB1（100 ng/ml）刺激 3 h、6 h，内皮细胞通透性无明显变化（P＞0.05）。但随着刺激时间的延长，rhHMGB1 组内皮细胞屏障通透性开始明显增高，并随着时间的增加而增加，其中第 12 h 及 24 h 与空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。经肝素预处理后与 rhHMGB1 共同培养，于 12 h 及 24 h 内皮细胞通透性低于 HMGB1 处理组（P＜0.05）。结果见表 1。
表1
不同刺激因素对内皮细胞通透性影响
2.3 免疫荧光法测定 ZO-1 表达分布
正常内皮细胞 ZO-1 存在于细胞周边呈环状，线条清晰、连续、光滑、流畅，细胞间连接紧密无明显间隙。100 ng/ml rhHMGB1 刺激 24 h 后，ZO-1 表达呈环线模糊、断裂状、边缘粗糙，细胞间出现了明显的裂隙；密闭环出现明显中断，边缘也变得十分模糊。给予 UFH 预处理后，ZO-1 荧光表达强度较 HMGB1 处理组明显增强，ZO-1 密闭环更连续，线条断裂减少。结果见图 2。
图2
免疫荧光法紧密连接蛋白 ZO-1 表达（IF×400） a．空白对照组； b．HMGB1 处理组； c．UFH 对照组； d．HMGB1 及 UFH 处理组
2.4 Western blot 检测 ZO-1 表达
经 rhHMGB1 处理后，ZO-1 蛋白表达较肝素组及空白对照组减少。经肝素预处理后，ZO-1 表达较 HMGB1 处理组有所增加。结果见图 3。
图3
不同因素刺激 24 h 内皮细胞 ZO-1 蛋白的表达
2.5 Western blot 检测核内 NF-κB 的表达
经 rhHMGB1 处理后，核内 NF-κB p65 蛋白表达较空白对照组增加。经肝素预处理后，核内 NF-κB p65 的含量明显降低，肝素可抑制 HMGB1 介导的 NF-κB 核易位。结果见图 4。
图4
不同因素刺激 24 h 内皮细胞核内 NF-κB p65 的表达
3 讨论
内皮细胞在许多生理功能中发挥重要作用，包括血管张力控制、细胞转运、凝血平衡、水电解质渗透扩散、先天免疫和适应性免疫等[5]。血管内皮细胞间的连接主要有四种类型：紧密连接、粘附连接、缝隙连接和粘合体[6]。脓毒症时，损伤的内皮细胞可大量释放 HMGB1，释放的 HMGB1 可活化内皮细胞中的 NF-κB 并促进其核易位，进而加重全身炎症反应[7]。同时释放的 HMGB1 通过诱导内皮细胞骨架肌动蛋白（F-actin）重组以及 ZO-1 和黏附连接蛋白（VE-cadherin）结构改变和表达变化，导致内皮细胞收缩、细胞间裂隙形成，引发内皮细胞通透性增高。其机制之一是通过糖基化终末产物受体（receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）和 Src- 家族酪氨酸激酶通路发生作用，通过抑制其活性可减轻内皮形态结构损伤并改善其通透性[8]。因此，抑制 HMGB1 的活性并保护血管内皮屏障的完整性对脓毒症来说是一个极具吸引力的治疗策略。近年来对脓毒症的研究表明，人血浆蛋白 Kallistatin、荭草素等均显示出抗 HMGB1 活性，从而抑制脓毒症时一系列炎症反应，提高脓毒症小鼠存活率[4,9]。而 HMGB1 最初是作为肝素结合蛋白而分离出来的，在其氨基末端有肝素结合的共有序列，表现出肝素结合活性[10]；动物及人体试验均证实肝素可抑制脓毒症时凝血级联反应[11]，并具有广泛的抗炎作用[12]。肝素与 HMGB1 结合后，可改变 HMGB1 的构象从而干扰 RAGE/HMGB1 的相互作用，降低 HMGB1 与 RAGE 的亲和力[13-14]，从而抑制 NF-κB 核异位[15]，减轻炎症反应，保护内皮细胞通透性等。
本研究运用 Transwell 细胞渗透性试验测定内皮细胞屏障通透性。实验观察到，随着 rhHMGB1 刺激时间的增加，FD40 渗透的荧光强度逐渐增加，于 12 h 和 24 h 时 HMGB1 处理组与 UFH 对照组和空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），证实了 HMGB1 可诱导内皮细胞屏障通透性增加；而经 UFH 预处理后与 rhHMGB1 共同孵育，12 h 和 24 h 时 FD40 渗透的荧光强度较 UFH 对照组及空白对照组明显降低（P＜0.05），表明经 UFH 预处理后内皮细胞屏障通透性得到了改善，UFH 可改善 HMGB1 所致的内皮细胞屏障通透性增加。
内皮细胞间紧密连接表达和分布的改变可导致内皮细胞屏障通透性的增加。细胞间的紧密连接可调节细胞旁扩散，是内皮细胞屏障形成的关键[16]。内皮细胞之间的紧密连接还控制着血管内外物质的交换，防止血管内血液和其他成分的外漏。其中，紧密连接蛋白 ZO-1 可维持细胞与细胞间张力，是血管内皮屏障形成的重要蛋白之一[17]。本研究显示，空白对照组紧密连接蛋白 ZO-1 呈圆环状，完整，线条清晰。经 rhHMGB1（100 ng/ml） 处理后，ZO-1 环明显不连续，密闭环减少及荧光强度明显减弱。而 UFH 预处理组 ZO-1 荧光强度较 HMGB1 处理组明显增强，密闭环明显增多，线条更加清晰连续。运用 Western blot 法检测 ZO-1 蛋白表达时也发现经 UFH 处理后，内皮细胞 ZO-1 的表达较单纯 HMGB1 处理组明显增多（P＜0.05），说明 UFH 可保护 HMGB1 所致的紧密连接蛋白 ZO-1 的破坏，使 ZO-1 表达增多。
NF-κB 是与炎症反应密切相关的核转录因子[18]。现有证据表明 HMGB1 通过 RAGE 可激活 NF-κB、纤溶酶原激活抑制物、Rho 蛋白等，可引起内皮屏障损害而导致通透性增高[19]。UFH 对脓毒症时内皮细胞屏障具有保护作用，其对血管系统的影响的具体机制并未完全明了。我们的研究显示，rhHMGB1 刺激内皮细胞后，NF-κB 发生明显的核易位，细胞核内 NF-κB 表达明显增加；而 UFH 与 rhHMGB1 共同孵育后可抑制 rhHMGB1 的活性，抑制 NF-κB 的核易位，改善内皮细胞紧密连接蛋白 ZO-1 的分布和表达，从而保护内皮细胞屏障通透性。总之，本实验为 UFH 治疗脓毒症微循环障碍的有效性提供了理论依据。
脓毒症（sepsis）是指由感染引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），涉及失控的全身炎症反应、凝血功能异常、免疫功能障碍、内皮细胞及组织损伤等。全身炎症反应是脓毒症感染性休克的标志之一，血管内皮细胞为炎症反应的调节和放大提供了重要的场所[1]，是脓毒症损伤的靶器官之一[2]。高迁移率族蛋白 1（high-mobility group box-1 protein，HMGB1）作为新的潜在晚期炎症介质，参与了脓毒症的发病过程，可激活血管内皮细胞，介导内皮细胞屏障功能不全，进而导致毛细血管渗漏，介导肺损伤、急性肺水肿等，是内毒素致死效应的重要晚期因子[3]。普通肝素（unfractionated heparin，UFH）是一种复杂的糖胺聚糖，是最常使用的抗凝药物。它可以通过抑制白细胞粘附活化，抑制补体的激活，保护血管内皮细胞免受趋化因子、组胺、细菌内毒素及氧自由基等损伤，以及维持内皮细胞屏障的完整性等[4]，但其机制不完全明晰。本研究旨在探讨 UFH 改善 HMGB1 介导的血管内皮细胞屏障通透性增加的作用及机制。
1 材料与方法
1.1 材料
人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）株购于南京凯基生物科技发展有限公司。0.25% 胰蛋白酶、DMEM 培养液购于 Gibco 公司。肝素钠购于南京新百药业有限公司。人重组 HMGB1（recombinant human high-mobility group box 1，rhHMGB1）购于美国 Proteintech 公司。Transwell 聚碳脂膜购于美国 Costar 公司。ZO-1 抗体（mouse anti-ZO-1 monoclonal antibody），4′, 6- 二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）及异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠 IgG 购于美国 Sigma 公司。核因子 -κB（NF-κB）p65 抗体、BCA 蛋白定量试剂盒、细胞核蛋白抽提试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 内皮细胞培养 经胰蛋白酶消化后种植于培养瓶内，加入 3～5 ml DMEM 完全培养液置于 5% CO2、37 ℃ 条件下细胞培养箱中培养，约 2～3 d 铺满。镜下融合生长至 80%。细胞传代，待细胞融合生长至 80% 时用于实验。
1.2.2 实验分组 将细胞分为 4 组（n = 5 ）：空白对照组（加入等量PBS）、HMGB1 处理组（100 ng/ml）、UFH 对照组（UFH 10 U/ml）、HMGB1 及 UFH 处理组（100 ng/ml HMGB1 + UFH 10 U/ml）。
1.2.3 细胞存活率的检测 将内皮细胞以 1 ×104/孔的浓度接种于 96 孔培养板中，置孵育箱 24 h 后内皮细胞呈单层生长，加入以不同浓度 rhHMGB1 刺激因素，分别为 0 、10、50、100、150 ng/ml 继续孵育 24 h。后每孔加入 20 μl MTT，培养 4 h，加入二甲基亚砜（DMSO）150 ml，充分振荡 10 min，酶标仪测定 490 nm 处各孔的吸光值（OD）。
1.2.4 内皮细胞通透性实验 人脐内皮细胞种植 Transwell 上层小室上，培养 24 h，待细胞生长融合成单层内皮细胞后，更换无血清培养液饥饿细胞 4 h 进行渗透性研究。取 24 孔培养的细胞随机进行分组，每组 3 孔分别加入上述不同刺激因素，同时加入含有 FITC 标记的葡聚糖（FD40）于 DMEM 中总体积共 100 μl，培养 5 min 后从下室抽取 200 μl 培养液做为基础值，补充下室培养液后继续培养。分别于刺激后 1 、3 、6 、12 及 24 h 分别从下室取 200 μl 培养液进行 FD40 荧光强度测定，并用 50 μl DMEM 培养基给予补充。用荧光分光光度计检测 FITC 的荧光发射强度。各实验组测量值与其基础值的差值为 FD40 的荧光强度，该实验每组均重复 3 次并取平均值。
1.2.5 胞质紧密粘连蛋白 -1（ZO-1）免疫荧光染色 细胞贴壁生长至对数生长期，经 0.25% 胰蛋白酶消化，将细胞悬液以 1 ×105 细胞/孔接种于盖玻片上。至细胞贴壁融合至 80% 后，予不含胎牛血清的 DMEM 液培养 24 h。待细胞同步化后，分别给予 PBS、rhHMGB1、UFH、rhHMGB1+UFH（UFH 提前 15 min）培养 24 h； 4% 多聚甲醛固定 30 min；0.2% Tritonx-100 透化；加入鼠抗人 ZO-1 原代抗体 2 μl 于 0.1% BSA 封闭 1 h；5% 的 BSA 中，4 ℃ 孵育过夜；加入 FITC 标记的羊抗鼠 IgG 100 μl，37 ℃ 避光封闭 1 h，DAPI 染核；50% 甘油封片，荧光显微镜下照相。
1.2.6 蛋白印迹法测定 ZO-1 蛋白表达 细胞培养同前，给予分组刺激后提取蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，根据检测结果，用 RIPA 裂解液调整各标本至相同的蛋白浓度；蛋白变性后经 SDS-PAGE 电泳，转印于 PVDF 膜上；5% BSA 中 4 ℃ 封闭过夜；加入鼠抗 ZO-l 原代抗体（1∶500），4 ℃ 孵育过夜；加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG（1∶5 000） 二抗孵育 2 h；显色后应用 Image J 图像分析软件进行分析，测定每条蛋白电泳带的灰度值，分析蛋白表达情况。
1.2.7 蛋白印迹法测定细胞核内 NF-κB 的含量 细胞予不同刺激培养后，严格按照细胞核蛋白抽提试剂盒说明书操作，提取胞核蛋白；按照 BCA 法定量蛋白浓度；蛋白变性后，经 SDS-PAGE 电泳，转印记于 PVDF 膜；5%BSA 中 4 ℃ 封闭过夜；加入抗 NF-κB p65 抗体 4 ℃ 孵育过夜；次日用 TBST 洗涤后加入相应辣根酶标记的二抗，室温孵育 2 h；洗涤后显色，分析蛋白表达情况。
1.3 统计学方法
使用 SPSS 13.0 专业统计软件进行统计学分析，实验结果用均数 ± 标准差（ ±s）表示，经参数或者非参数方差检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度 HMGB1 刺激下细胞存活率变化
与空白组比较，不同浓度的 rhHMGB1 对内皮细胞存活率均无显著影响（P＞0.05），结果见图 1。
图1
不同浓度 HMGB1 对内皮细胞存活率的影响
2.2 Transwell 法测定内皮细胞通透性
经 rhHMGB1（100 ng/ml）刺激 3 h、6 h，内皮细胞通透性无明显变化（P＞0.05）。但随着刺激时间的延长，rhHMGB1 组内皮细胞屏障通透性开始明显增高，并随着时间的增加而增加，其中第 12 h 及 24 h 与空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。经肝素预处理后与 rhHMGB1 共同培养，于 12 h 及 24 h 内皮细胞通透性低于 HMGB1 处理组（P＜0.05）。结果见表 1。
表1
不同刺激因素对内皮细胞通透性影响
2.3 免疫荧光法测定 ZO-1 表达分布
正常内皮细胞 ZO-1 存在于细胞周边呈环状，线条清晰、连续、光滑、流畅，细胞间连接紧密无明显间隙。100 ng/ml rhHMGB1 刺激 24 h 后，ZO-1 表达呈环线模糊、断裂状、边缘粗糙，细胞间出现了明显的裂隙；密闭环出现明显中断，边缘也变得十分模糊。给予 UFH 预处理后，ZO-1 荧光表达强度较 HMGB1 处理组明显增强，ZO-1 密闭环更连续，线条断裂减少。结果见图 2。
图2
免疫荧光法紧密连接蛋白 ZO-1 表达（IF×400） a．空白对照组； b．HMGB1 处理组； c．UFH 对照组； d．HMGB1 及 UFH 处理组
2.4 Western blot 检测 ZO-1 表达
经 rhHMGB1 处理后，ZO-1 蛋白表达较肝素组及空白对照组减少。经肝素预处理后，ZO-1 表达较 HMGB1 处理组有所增加。结果见图 3。
图3
不同因素刺激 24 h 内皮细胞 ZO-1 蛋白的表达
2.5 Western blot 检测核内 NF-κB 的表达
经 rhHMGB1 处理后，核内 NF-κB p65 蛋白表达较空白对照组增加。经肝素预处理后，核内 NF-κB p65 的含量明显降低，肝素可抑制 HMGB1 介导的 NF-κB 核易位。结果见图 4。
图4
不同因素刺激 24 h 内皮细胞核内 NF-κB p65 的表达
3 讨论
内皮细胞在许多生理功能中发挥重要作用，包括血管张力控制、细胞转运、凝血平衡、水电解质渗透扩散、先天免疫和适应性免疫等[5]。血管内皮细胞间的连接主要有四种类型：紧密连接、粘附连接、缝隙连接和粘合体[6]。脓毒症时，损伤的内皮细胞可大量释放 HMGB1，释放的 HMGB1 可活化内皮细胞中的 NF-κB 并促进其核易位，进而加重全身炎症反应[7]。同时释放的 HMGB1 通过诱导内皮细胞骨架肌动蛋白（F-actin）重组以及 ZO-1 和黏附连接蛋白（VE-cadherin）结构改变和表达变化，导致内皮细胞收缩、细胞间裂隙形成，引发内皮细胞通透性增高。其机制之一是通过糖基化终末产物受体（receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）和 Src- 家族酪氨酸激酶通路发生作用，通过抑制其活性可减轻内皮形态结构损伤并改善其通透性[8]。因此，抑制 HMGB1 的活性并保护血管内皮屏障的完整性对脓毒症来说是一个极具吸引力的治疗策略。近年来对脓毒症的研究表明，人血浆蛋白 Kallistatin、荭草素等均显示出抗 HMGB1 活性，从而抑制脓毒症时一系列炎症反应，提高脓毒症小鼠存活率[4,9]。而 HMGB1 最初是作为肝素结合蛋白而分离出来的，在其氨基末端有肝素结合的共有序列，表现出肝素结合活性[10]；动物及人体试验均证实肝素可抑制脓毒症时凝血级联反应[11]，并具有广泛的抗炎作用[12]。肝素与 HMGB1 结合后，可改变 HMGB1 的构象从而干扰 RAGE/HMGB1 的相互作用，降低 HMGB1 与 RAGE 的亲和力[13-14]，从而抑制 NF-κB 核异位[15]，减轻炎症反应，保护内皮细胞通透性等。
本研究运用 Transwell 细胞渗透性试验测定内皮细胞屏障通透性。实验观察到，随着 rhHMGB1 刺激时间的增加，FD40 渗透的荧光强度逐渐增加，于 12 h 和 24 h 时 HMGB1 处理组与 UFH 对照组和空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），证实了 HMGB1 可诱导内皮细胞屏障通透性增加；而经 UFH 预处理后与 rhHMGB1 共同孵育，12 h 和 24 h 时 FD40 渗透的荧光强度较 UFH 对照组及空白对照组明显降低（P＜0.05），表明经 UFH 预处理后内皮细胞屏障通透性得到了改善，UFH 可改善 HMGB1 所致的内皮细胞屏障通透性增加。
内皮细胞间紧密连接表达和分布的改变可导致内皮细胞屏障通透性的增加。细胞间的紧密连接可调节细胞旁扩散，是内皮细胞屏障形成的关键[16]。内皮细胞之间的紧密连接还控制着血管内外物质的交换，防止血管内血液和其他成分的外漏。其中，紧密连接蛋白 ZO-1 可维持细胞与细胞间张力，是血管内皮屏障形成的重要蛋白之一[17]。本研究显示，空白对照组紧密连接蛋白 ZO-1 呈圆环状，完整，线条清晰。经 rhHMGB1（100 ng/ml） 处理后，ZO-1 环明显不连续，密闭环减少及荧光强度明显减弱。而 UFH 预处理组 ZO-1 荧光强度较 HMGB1 处理组明显增强，密闭环明显增多，线条更加清晰连续。运用 Western blot 法检测 ZO-1 蛋白表达时也发现经 UFH 处理后，内皮细胞 ZO-1 的表达较单纯 HMGB1 处理组明显增多（P＜0.05），说明 UFH 可保护 HMGB1 所致的紧密连接蛋白 ZO-1 的破坏，使 ZO-1 表达增多。
NF-κB 是与炎症反应密切相关的核转录因子[18]。现有证据表明 HMGB1 通过 RAGE 可激活 NF-κB、纤溶酶原激活抑制物、Rho 蛋白等，可引起内皮屏障损害而导致通透性增高[19]。UFH 对脓毒症时内皮细胞屏障具有保护作用，其对血管系统的影响的具体机制并未完全明了。我们的研究显示，rhHMGB1 刺激内皮细胞后，NF-κB 发生明显的核易位，细胞核内 NF-κB 表达明显增加；而 UFH 与 rhHMGB1 共同孵育后可抑制 rhHMGB1 的活性，抑制 NF-κB 的核易位，改善内皮细胞紧密连接蛋白 ZO-1 的分布和表达，从而保护内皮细胞屏障通透性。总之，本实验为 UFH 治疗脓毒症微循环障碍的有效性提供了理论依据。
