引用本文： 刘宏, 范晓枝, 田新强, 李冰. 急性呼吸窘迫综合征大鼠血小板 MKK3磷酸化水平变化初探. 中国呼吸与危重监护杂志, 2017, 16(1): 60-63. doi: 10.7507/1671-6205.201608019 复制
作为临床常见急危重病症之一的急性呼吸窘迫综合征（ARDS），因严重威胁人类健康，近五十年来一直是医学界研究的热点之一，但迄今为止其具体的发病机制仍不十分清楚。本课题组在既往研究中发现，ARDS 时血小板被激活并可能在 ARDS 发病中起重要作用[1]。近年来，有关丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路的研究备受关注。本研究在既往研究基础上，探讨 ARDS 时血小板中 MAPKs 信号通路的变化，进而探讨 ARDS 时血小板活化的信号通路和 ARDS 发病的分子机制。
1 材料与方法
1.1 ARDS 动物模型制备
取体重 250～400 g 的健康 SD 大鼠 30 只，随机分为 5 组，每组 6 只。实验组（OA 组）4 组，尾静脉注射油酸（分析纯，天津市风船化学试剂公司产品）0.25 ml/kg 制备 ARDS 模型。对照组（NS组）1 组，尾静脉注射等量生理盐水。在 OA 组注射油酸后 2、6、24、72 h，对照组注射生理盐水后 2 h，处死动物，取样检测。
1.2 检测指标
1.2.1 大鼠肺湿/干重比值 大鼠处死后，立即开胸取肺做大体观察，称肺重并计算肺系数（肺系数=肺重/体重×100%）。右肺称重后置 80 ℃ 烤箱内烘干至恒重，计算肺湿/干重比值。
1.2.2 肺部病理学检查 左肺置 10% 福尔马林溶液中固定 1 周后，按常规病理学方法切片，HE 染色，光镜观察。
1.2.3 血小板内 MKK3 磷酸化水平 用 Western blot 技术检测血小板内丝裂原活化蛋白激酶激酶 3（MKK3）磷酸化水平。在注射油酸后各时间点，从动物腹主动脉采血（10±1）ml，分离血小板，提取血小板蛋白。用考马斯亮蓝测血小板蛋白浓度，按预定的量取制备好的蛋白样品，加入等量的 5 × 的加样缓冲液混匀，94 ℃ 加热 5 min，蛋白每孔加样 30 μg，行 SDS-PAGE 电泳（5% 浓缩胶/10% 分离胶），然后将蛋白转移至 PVDF 膜（160 mA，2 h），转印后的 PVDF 膜用 TBS 漂洗后，置于 10% 脱脂奶粉抗体封闭液室温摇床封闭 2 h；按 1∶1 000 比例用 TBS 缓冲液稀释一抗（兔抗鼠），室温下在摇床上孵育 30 min 后，置于 4 ℃ 冰箱中孵育过夜；次日从 4 ℃ 冰箱拿出后，室温下摇床上再孵育 30 min；用含 0.05% Tween-20 的缓冲液（TBST）洗膜（10 min×3 次）；按 1∶2 000 比例用 TBS 缓冲液稀释二抗（羊抗兔），室温下孵育 2 h；用 TBST 洗膜（10 min×3 次）；用 BIO-RAD GelDocTM XR+成像系统进行化学发光法显色成像；应用扫描系统的分析软件（ImageLab，Bio-Rad 公司）测定目标蛋白灰度值。根据蛋白印迹条带的灰度值，分别计算每个蛋白的磷酸化比值（pJNK 磷酸化灰度/JNK 总蛋白灰度）。
1.3 统计学方法
实验数据均用均数 ± 标准差（ ）表示，应用 Graphpad Prism 统计学专用软件对各实验数据进行分析，各组间比较采用单因素方差分析，对差异显著者用 Newman-Kuelsq 检验进行两两比较，同组数据不同时间点的比较采用配对t 检验。检验水准 α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动物全身状况
实验组大鼠在注射油酸后 2 ～ 3 min 即开始出现呼吸困难，呼吸幅度增大，瘫软无力，活动减少，行走时呈爬行步态，进饮食减少。24 h 后动物一般状态好转；至 72 h，活动基本恢复正常。对照组无异常变化。
2.2 动物肺系数和肺湿/干重比值
动物肺系数和肺湿/干重比值变化见表 1。从表中可见，注射油酸后 2～24 h，实验组动物肺重、肺系数和肺湿/干重比值均有不同程度增加，以 2 h 最严重。对照组上述各项均无异常变化。
表1
各组动物肺系数和肺湿/干重比值（n=6，
）
2.3 肺组织病理学
肉眼观察见对照组大鼠肺脏大小正常，表面光滑，粉红色，纹理清晰；而 2 ～24 h 实验组双肺体积增大且重量增加，表面从鲜红色逐渐变为深红色、紫红色花斑状；72 h 实验组肺肿胀消失并有轻度萎缩，弹性差，外观呈灰白色（图 1）。
图1
肺组织肉眼观察 a. 对照组； b. OA 2 h 组； c. OA 6 h 组； d. OA 24 h 组； e. OA 72 h 组
光镜下，对照组肺组织结构清晰，肺泡腔内无液体渗出及细胞浸润（图 2a）；2～6 h 实验组肺泡内可见多量染色粉红均一的液体渗出，轻重不一的肺泡和肺间质出血、炎细胞浸润、小血管扩张和充血；6 h 实验组肺泡内有透明膜形成；24 h 实验组肺泡内液体渗出减轻，肺泡、肺间隔出血和炎细胞浸润加重，肺组织实变，肺组织正常结构消失；72 h实验组肺泡腔液体渗出吸收，肺泡腔萎陷；肺泡隔增厚，胶原纤维组织增生，微血栓形成（图 2b～2f）。
图2
肺组织病理像 a. 对照组：肺组织结构清晰，肺泡腔内无液体渗出和细胞浸润（HE ×200）； b. OA 2 h 组：肺泡内有多量粉红色液体渗出，肺泡隔有出血，小血管充血（HE×200）； c. OA 6 h 组：肺泡腔内大量粉红色液体渗出，形成透明膜（HE ×200）；d. OA 24 h 组：肺泡腔和肺间质有大量出血和炎细胞浸润，肺组织实变（HE×200）； e. OA 72 h 组：肺泡腔萎陷，肺泡隔增厚，胶原纤维组织增生（HE ×200）； f. OA 72 h 组：肺泡腔缩小，肺微血栓形成（HE ×400）
2.4 血小板内 MKK3 磷酸化水平
各组动物血小板 MKK3 磷酸化水平见图 3。与对照组比较，6～72 h 实验组大鼠血小板内蛋白激酶 MKK3 磷酸化水平明显增高（P＜0.05），其中 6 h 组为对照组的 2.4 倍（0.50±0.09vs. 0.21±0.05）；24 h 组表达量最高（0.78±0.06），为对照组的 3.7 倍；72 h 组稍有回落（0.75±0.13），但仍明显高于对照组。
图3
各组大鼠血小板 MKK3 磷酸化水平
3 讨论
ARDS 是临床各科常见急危重病症，早期阶段或轻症曾被称为急性肺损伤（ALI）。在美国，每年发病约 20 万例，死亡率接近 50%[2]。它可由感染、创伤、有害气体或液体吸入等多种病因引起，但详细发病机制尚不清楚。
血小板是血液系统的有形成分之一，主要功能是止血，防止创伤后血液的大量丢失。近年科学界对血小板的功能特性有了不少新的发现，了解到血小板在呼吸系统生理和病理生理的分子和细胞生物学中起重要作用[3]。除参与止血及血栓形成外，血小板还参与免疫、炎症、动脉硬化、血管生成、淋巴管发育、肿瘤生长及转移等病理过程[4-7]。血小板能表达多种免疫受体（如 CD14、TLRs、FcR、CD40 等），释放大量接近活化的细胞因子（如 IL-1β、MCP-1、TGF-β、CD40L、RANTES 等）。这些受体、细胞因子共同参与，使血小板吸引白细胞到血管损伤点，释放炎性因子，产生微颗粒物质，诱发凝血酶的生成。研究已证明这些过程对脓毒症、动脉粥样硬化、肝炎、急性肺损伤、血管再狭窄和移植排斥反应等疾患的发病过程至关重要[5]。
近年研究发现，在生理状态和在 ARDS 时，血小板、血小板前体与肺有多个级别的交互活动，血小板在 ARDS 时发生活化并可能在 ARDS 发病中起重要作用[3,8-9]，但血小板活化的具体机制和信号传导通路仍不清楚。MAPKs 信号通路是细胞跨膜信号转导过程中具有至关重要作用的信号转导系统，由一大群丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成。该信号通路存在于许多细胞内，在细胞外刺激信号向细胞及其核内转导并引起细胞发生生物学反应的过程中起重要作用。在高等哺乳类动物的细胞内主要有 3 条并行的三级联的 MAPKs 信号通路：细胞外调节的蛋白激酶（ERKs）信号通路，c-Jun 氨基末端蛋白激酶（JNKs）信号通路，以及 p38 蛋白激酶（p38 kinase，p38 MAPK）信号通路。不同的细胞外刺激使用的通路不同，通过各条通路的相互调控而介导不同的细胞生物学反应。
MKK3 是 MAPKs 信号转导通路系统中 p38 MAPK 通路上第二级联的一个重要蛋白激酶，它是 p38 MAPK 的上游蛋白激酶，可特异性地激活 p38 MAPK[10]。目前有关 ARDS 时血液循环中血小板内 MKK 3 -p38 MAPK 信号转导通路的研究报道罕见。本研究结果显示，6 ～72 h 实验组动物血液循环中血小板内 MKK3 磷酸化水平明显增高，在 24 h 组表达量最高（P＜0.05）。实验结果说明，ARDS 时有血小板内 MKK3-p38 MAPK 信号转导通路的启动；该信号转导通路的启动可能与血小板的活化有关。MAPKs 信号通路是一个十分复杂的信号转导系统，本研究只是对 ARDS 时血小板中 MAPKs 信号通路变化的初步探索，今后还需要做大量的实验研究来进行深入探讨。
作为临床常见急危重病症之一的急性呼吸窘迫综合征（ARDS），因严重威胁人类健康，近五十年来一直是医学界研究的热点之一，但迄今为止其具体的发病机制仍不十分清楚。本课题组在既往研究中发现，ARDS 时血小板被激活并可能在 ARDS 发病中起重要作用[1]。近年来，有关丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路的研究备受关注。本研究在既往研究基础上，探讨 ARDS 时血小板中 MAPKs 信号通路的变化，进而探讨 ARDS 时血小板活化的信号通路和 ARDS 发病的分子机制。
1 材料与方法
1.1 ARDS 动物模型制备
取体重 250～400 g 的健康 SD 大鼠 30 只，随机分为 5 组，每组 6 只。实验组（OA 组）4 组，尾静脉注射油酸（分析纯，天津市风船化学试剂公司产品）0.25 ml/kg 制备 ARDS 模型。对照组（NS组）1 组，尾静脉注射等量生理盐水。在 OA 组注射油酸后 2、6、24、72 h，对照组注射生理盐水后 2 h，处死动物，取样检测。
1.2 检测指标
1.2.1 大鼠肺湿/干重比值 大鼠处死后，立即开胸取肺做大体观察，称肺重并计算肺系数（肺系数=肺重/体重×100%）。右肺称重后置 80 ℃ 烤箱内烘干至恒重，计算肺湿/干重比值。
1.2.2 肺部病理学检查 左肺置 10% 福尔马林溶液中固定 1 周后，按常规病理学方法切片，HE 染色，光镜观察。
1.2.3 血小板内 MKK3 磷酸化水平 用 Western blot 技术检测血小板内丝裂原活化蛋白激酶激酶 3（MKK3）磷酸化水平。在注射油酸后各时间点，从动物腹主动脉采血（10±1）ml，分离血小板，提取血小板蛋白。用考马斯亮蓝测血小板蛋白浓度，按预定的量取制备好的蛋白样品，加入等量的 5 × 的加样缓冲液混匀，94 ℃ 加热 5 min，蛋白每孔加样 30 μg，行 SDS-PAGE 电泳（5% 浓缩胶/10% 分离胶），然后将蛋白转移至 PVDF 膜（160 mA，2 h），转印后的 PVDF 膜用 TBS 漂洗后，置于 10% 脱脂奶粉抗体封闭液室温摇床封闭 2 h；按 1∶1 000 比例用 TBS 缓冲液稀释一抗（兔抗鼠），室温下在摇床上孵育 30 min 后，置于 4 ℃ 冰箱中孵育过夜；次日从 4 ℃ 冰箱拿出后，室温下摇床上再孵育 30 min；用含 0.05% Tween-20 的缓冲液（TBST）洗膜（10 min×3 次）；按 1∶2 000 比例用 TBS 缓冲液稀释二抗（羊抗兔），室温下孵育 2 h；用 TBST 洗膜（10 min×3 次）；用 BIO-RAD GelDocTM XR+成像系统进行化学发光法显色成像；应用扫描系统的分析软件（ImageLab，Bio-Rad 公司）测定目标蛋白灰度值。根据蛋白印迹条带的灰度值，分别计算每个蛋白的磷酸化比值（pJNK 磷酸化灰度/JNK 总蛋白灰度）。
1.3 统计学方法
实验数据均用均数 ± 标准差（ ）表示，应用 Graphpad Prism 统计学专用软件对各实验数据进行分析，各组间比较采用单因素方差分析，对差异显著者用 Newman-Kuelsq 检验进行两两比较，同组数据不同时间点的比较采用配对t 检验。检验水准 α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动物全身状况
实验组大鼠在注射油酸后 2 ～ 3 min 即开始出现呼吸困难，呼吸幅度增大，瘫软无力，活动减少，行走时呈爬行步态，进饮食减少。24 h 后动物一般状态好转；至 72 h，活动基本恢复正常。对照组无异常变化。
2.2 动物肺系数和肺湿/干重比值
动物肺系数和肺湿/干重比值变化见表 1。从表中可见，注射油酸后 2～24 h，实验组动物肺重、肺系数和肺湿/干重比值均有不同程度增加，以 2 h 最严重。对照组上述各项均无异常变化。
表1
各组动物肺系数和肺湿/干重比值（n=6，
）
2.3 肺组织病理学
肉眼观察见对照组大鼠肺脏大小正常，表面光滑，粉红色，纹理清晰；而 2 ～24 h 实验组双肺体积增大且重量增加，表面从鲜红色逐渐变为深红色、紫红色花斑状；72 h 实验组肺肿胀消失并有轻度萎缩，弹性差，外观呈灰白色（图 1）。
图1
肺组织肉眼观察 a. 对照组； b. OA 2 h 组； c. OA 6 h 组； d. OA 24 h 组； e. OA 72 h 组
光镜下，对照组肺组织结构清晰，肺泡腔内无液体渗出及细胞浸润（图 2a）；2～6 h 实验组肺泡内可见多量染色粉红均一的液体渗出，轻重不一的肺泡和肺间质出血、炎细胞浸润、小血管扩张和充血；6 h 实验组肺泡内有透明膜形成；24 h 实验组肺泡内液体渗出减轻，肺泡、肺间隔出血和炎细胞浸润加重，肺组织实变，肺组织正常结构消失；72 h实验组肺泡腔液体渗出吸收，肺泡腔萎陷；肺泡隔增厚，胶原纤维组织增生，微血栓形成（图 2b～2f）。
图2
肺组织病理像 a. 对照组：肺组织结构清晰，肺泡腔内无液体渗出和细胞浸润（HE ×200）； b. OA 2 h 组：肺泡内有多量粉红色液体渗出，肺泡隔有出血，小血管充血（HE×200）； c. OA 6 h 组：肺泡腔内大量粉红色液体渗出，形成透明膜（HE ×200）；d. OA 24 h 组：肺泡腔和肺间质有大量出血和炎细胞浸润，肺组织实变（HE×200）； e. OA 72 h 组：肺泡腔萎陷，肺泡隔增厚，胶原纤维组织增生（HE ×200）； f. OA 72 h 组：肺泡腔缩小，肺微血栓形成（HE ×400）
2.4 血小板内 MKK3 磷酸化水平
各组动物血小板 MKK3 磷酸化水平见图 3。与对照组比较，6～72 h 实验组大鼠血小板内蛋白激酶 MKK3 磷酸化水平明显增高（P＜0.05），其中 6 h 组为对照组的 2.4 倍（0.50±0.09vs. 0.21±0.05）；24 h 组表达量最高（0.78±0.06），为对照组的 3.7 倍；72 h 组稍有回落（0.75±0.13），但仍明显高于对照组。
图3
各组大鼠血小板 MKK3 磷酸化水平
3 讨论
ARDS 是临床各科常见急危重病症，早期阶段或轻症曾被称为急性肺损伤（ALI）。在美国，每年发病约 20 万例，死亡率接近 50%[2]。它可由感染、创伤、有害气体或液体吸入等多种病因引起，但详细发病机制尚不清楚。
血小板是血液系统的有形成分之一，主要功能是止血，防止创伤后血液的大量丢失。近年科学界对血小板的功能特性有了不少新的发现，了解到血小板在呼吸系统生理和病理生理的分子和细胞生物学中起重要作用[3]。除参与止血及血栓形成外，血小板还参与免疫、炎症、动脉硬化、血管生成、淋巴管发育、肿瘤生长及转移等病理过程[4-7]。血小板能表达多种免疫受体（如 CD14、TLRs、FcR、CD40 等），释放大量接近活化的细胞因子（如 IL-1β、MCP-1、TGF-β、CD40L、RANTES 等）。这些受体、细胞因子共同参与，使血小板吸引白细胞到血管损伤点，释放炎性因子，产生微颗粒物质，诱发凝血酶的生成。研究已证明这些过程对脓毒症、动脉粥样硬化、肝炎、急性肺损伤、血管再狭窄和移植排斥反应等疾患的发病过程至关重要[5]。
近年研究发现，在生理状态和在 ARDS 时，血小板、血小板前体与肺有多个级别的交互活动，血小板在 ARDS 时发生活化并可能在 ARDS 发病中起重要作用[3,8-9]，但血小板活化的具体机制和信号传导通路仍不清楚。MAPKs 信号通路是细胞跨膜信号转导过程中具有至关重要作用的信号转导系统，由一大群丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成。该信号通路存在于许多细胞内，在细胞外刺激信号向细胞及其核内转导并引起细胞发生生物学反应的过程中起重要作用。在高等哺乳类动物的细胞内主要有 3 条并行的三级联的 MAPKs 信号通路：细胞外调节的蛋白激酶（ERKs）信号通路，c-Jun 氨基末端蛋白激酶（JNKs）信号通路，以及 p38 蛋白激酶（p38 kinase，p38 MAPK）信号通路。不同的细胞外刺激使用的通路不同，通过各条通路的相互调控而介导不同的细胞生物学反应。
MKK3 是 MAPKs 信号转导通路系统中 p38 MAPK 通路上第二级联的一个重要蛋白激酶，它是 p38 MAPK 的上游蛋白激酶，可特异性地激活 p38 MAPK[10]。目前有关 ARDS 时血液循环中血小板内 MKK 3 -p38 MAPK 信号转导通路的研究报道罕见。本研究结果显示，6 ～72 h 实验组动物血液循环中血小板内 MKK3 磷酸化水平明显增高，在 24 h 组表达量最高（P＜0.05）。实验结果说明，ARDS 时有血小板内 MKK3-p38 MAPK 信号转导通路的启动；该信号转导通路的启动可能与血小板的活化有关。MAPKs 信号通路是一个十分复杂的信号转导系统，本研究只是对 ARDS 时血小板中 MAPKs 信号通路变化的初步探索，今后还需要做大量的实验研究来进行深入探讨。
