引用本文： 王小军, 刘华. 红芪多糖-1 对人肺腺癌 A549 细胞氧化应激的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2017, 16(2): 127-131. doi: 10.7507/1671-6205.201608025 复制
肺癌的发病率近年来明显增高，尤其是女性肺癌发病率增长迅速，甚至超过了男性，临床工作中发现女性患者的病理类型以腺癌为主[1]。细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种。肿瘤的发生，一方面认为可能与细胞增殖的失控相关，而另一方面认为与细胞凋亡受到抑制相关。研究发现，诱导肿瘤细胞的凋亡是防治肿瘤的有效手段[2-5]。氧自由基（ROS）对细胞的损伤作用不仅与它在细胞内的浓度相关，还与细胞内 ROS/ 内源性的抗氧化物质的平衡相关。细胞内的抗氧化酶保护系统主要包括谷胱甘肽（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、硫氧还蛋白还原酶（TrxR）等。氧化/还原平衡失调对细胞增殖、凋亡的调控影响重大。红芪多糖（hedysarum polysaccharides，HPS）是中药豆科植物多序岩黄芪的干燥根的主要提取成分，主产于甘肃地区[6]。研究发现，HPS 有着特殊的生物活性，具有抗癌、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、增强免疫力等功效[7]。前期研究发现 HPS 作用于肺腺癌 A549 细胞，可抑制其增殖，诱导凋亡[8]，但具体机制尚未完全阐明。本课题组在既往研究的基础上，以人肺腺癌 A549 细胞为研究对象，通过 MTT 法、流式细胞术（FCM）法、比色法、化学荧光法探讨红芪多糖 HPS-1 抗肿瘤的可能机制。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 CO2 孵育箱（HERAcell150, Thermo 公司），超净工作台（中国 sw-cj-2f）；光学倒置显微镜（日本OLYMPUS CKX41+DP21），酶标仪（美国 Bio-rad），流式细胞仪（BD FACSVerse），低温离心机（Centrifuge 5427R）。
1.1.2 试剂 DMEM 低糖培养基（Sigma 公司），胎牛血清（杭州四季青公司 141010），胰蛋白酶（HyClone 公司 J130020），噻唑蓝（MTT，Sigma 公司 303H0531），二甲基亚砜（DMSO，100 ml，Sigma 公司，302A0327），十二烷基磺酸钠（SDS，Sigma 公司，325E037）。Annexin V-FITC/PI 试剂盒为 BD Pharmingen 公司产品。ROS、GSH、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、T-AOC、TrxR 以及脂肪酸过氧化代谢产物丙二醛（MDA）活性检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。人肺腺癌 A549 细胞为本实验室保存。
1.2 细胞培养及细胞克隆形成实验
胎牛血清（10%）与青链霉素（100 U/ml）混合适量 DMEM 低糖培养液，在 37.0 ℃、CO2 体积分数为 5% 的恒温、恒湿培养箱中培养，隔天换液。贴壁生长良好的人肺腺癌 A549 细胞经 0.25% 胰蛋白酶消化、传代。细胞实验均选用对数增长期且状态良好的 A549 细胞。参照王亚丽等[9] 的实验方法，将增长旺盛的 A549 细胞消化后，接种于 60 mm×15 mm 培养皿中，接种数为 40 万/皿，不同时间点消化细胞，通过细胞计数法，统计克隆形成细胞数，描绘 A549 细胞生长曲线。
空白组为无细胞接种组，对照组培养基中无药物干预，其余处理步骤同实验组。
1.3 MTT 法检测 HPS-1 对 A549 细胞增殖的抑制作用
少量高浓度 HPS-1 加入低糖 DMEM 完全培养基中并及时混匀，终浓度分别为 50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。实验在 4 块 96 孔板进行，每组设 5 个复孔，每孔加入的完全培养基为 100 μl，每孔细胞数控制在 8×103 个，实验重复 3 次。细胞贴壁 16 h 后给药，24 h、48 h 两个时间点分别加入 20 μL（5 g/L）MTT，6 h 后每孔加入 SDS（10%，mol/V）150 μl 每孔，37 ℃ 过夜，取出 96 孔板用酶标仪于 570 nm 波长处检测每孔的吸光度（OD）值。细胞增殖抑制率= [1–（实验药物组OD 值/正常对照组OD 值） ]%。
1.4 FCM 法检测 HPS-1 对 A549 细胞的细胞周期分布及凋亡的影响
培养细胞至培养皿约 80% 时消化，以 4×105 个/培养皿的密度接种于培养皿（60 mm×15 mm）中，细胞贴壁后（16 h）换液，加入含有不同剂量药物的完全培养液，作用 48 h 后消化细胞，1 500 r/min 离心 5 min（离心半径为29.9 cm），弃掉上清液，PBS 缓冲液洗涤 2 次。1 500 r/min 再次离心 5 min，后收集细胞，缓缓加入适量 –20 ℃ 提前预冷的 70% 酒精溶液，1 500 r/min 离心 5 min 后，PBS 缓冲液洗涤 2 次，收集细胞，按 Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒操作步骤操作，30 min 后上流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡率情况。
1.5 化学荧光法检测 HPS-1 对 A549 细胞 ROS 的影响
ROS 包括超氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物和羟化物，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。本实验采用 DCFH-DA 探针检测细胞内 ROS 水平。DCFH-DA 进入细胞后被酯酶水解为 DCFH，活性氧存在时 DCFH 被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质 DCF，在 530 nm 波长处有强大波峰，其强度与细胞内活性氧水平成正比。
培养细胞至培养皿约 80% 时消化，以 1×105 个/培养皿的密度接种于培养皿 24 孔板中，细胞贴壁后（16 h）换液，加入含有不同剂量药物的完全培养液，作用 12 h、24 h 后，加入终浓度 10 μmol/L 的 DCFH-DA 于培养基，37 ℃ 孵育 60 min 后消化细胞，PBS 洗涤 2 次，制成单细胞悬液，于 530 nm 波长处检测各孔OD 值。
1.6 比色法检测 HPS-1 干预 A549 细胞后上清液中 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 的表达量
培养细胞至培养皿约 80% 时消化，以 4×105 个/培养皿的密度接种于培养皿（60 mm×15 mm） 中，细胞贴壁后（16 h）换液，加入含有不同剂量药物的完全培养液，作用 12 h、24 h 后，收集各组标本上清液，按照各试剂盒说明进行后续操作，依次加入各试剂，震荡混匀后，静置 10 min，双蒸水调零，1 cm 光径，不同波长 [MDA（532 nm），T-AOC（520 nm），T-SOD（550 nm），GSH（420 nm），TrxR（490 nm） ] 处测各组上清液OD 值。
1.7 统计学方法
采用 IBM 公司 SPSS 21.0 统计学软件进行后续统计分析，计量资料符合正态分布及方差齐性时，数据结果以均数±标准差（ ）表示，两个样本均数的比较采用t 检验，多样本均数的比较采用方差分析，以 α=0.05 为检验水准，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 A549 细胞生长曲线
采用细胞计数法，接种等量细胞数于 4 个培养皿中，分别于 15、24、48、64 h 时间点各随机消化 1 个培养皿中细胞，计数后绘制 A549 细胞生长曲线，为后续增殖及凋亡实验药物干预时间的选取提供参考。克隆形成实验结果见图 1。
图1
正常人肺腺癌 A549 细胞生长曲线
2.2 MTT 实验结果
选取低、中、高浓度 HPS-1（50、100、200 mg/L）作用于 A549 细胞，药物干预 24 h、48 h 后各组细胞依据OD 数据可知，各实验组与对照组比较表现为增殖抑制作用（P<0.05），各组细胞活力与时间、HPS-1 剂量相关（P<0.05），而与时间剂量无交互作用（P>0.05）。结果见表 1。
表1
MTT 实验结果（n=5，
）
2.3 HPS-1 对 A549 细胞凋亡的影响
选取低、中、高剂量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 细胞 24 h、48 h 后收集细胞，按照 Annexin Ⅴ-FITC/PI 试剂盒说明上机检测。FCM 法检测结果显示，HPS-1 作用于各组细胞 48 h 后，实验组细胞凋亡率（早期+晚期）均较对照组高（P<0.05），说明 HPS-1 对 A549 细胞具有凋亡诱导作用，结果见表 2。
表2
细胞周期及细胞凋亡率结果（n=3，%，
）
2.4 HPS-1 对 A549 细胞 ROS 表达的影响果
选取低、中、高剂量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 细胞 12 h、24 h 后加入（终浓度 10 μmol/L）DCFH-DA 后孵育 60 min，收集细胞后上机检测。检测结果显示，HPS-1 作用于各组细胞 12 h 后，实验组细胞 ROS 含量均较对照组高（P<0.05），且 HPS-1 高剂量组 ROS 较低、中剂量组高（P<0.05）；在 24 h 时间点，HPS-1 高剂量组细胞内 ROS 含量较 12 h 时间点减低（P<0.05），且高于对照组及低、中剂量 HPS-1 组（P<0.05）。说明 HPS-1 对 A549 细胞内 ROS 具有调节作用，且与时间剂量相关。结果见表 3。
表3
各组细胞不同时间点细胞内 ROS 检测结果（n=3，
）
2.5 细胞上清液中 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 含量
选取低、中、高剂量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 细胞 12 h、24 h 后，收集各实验组细胞上清液，严格按照 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 活力检测试剂盒说明操作，各OD 值结果见表 4。高、中、低剂量 HPS-1 对 A549 细胞 T-SOD、T-AOC、GSH、MDA、TrxR 具有调控作用，其中各实验组上清液中 T-SOD、T-AOC、GSH、TrxR 在 HPS-1 干预 A549 细胞 12 h、24 h 后表达出现明显下调（P<0.05），且随着时间推移，下调比例减 低。上清液中 MDA 在 HPS-1 干预 A549 细胞 12 h、24 h 后表达出现明显上调（P<0.05），且随着时间推移上调比例减低。大剂量（200 mg/L）组 T-SOD、T-AOC、GSH、TrxR 表达较低、中剂量组不同时间点下调，差异有统计学意义（P<0.05）。大剂量（200 mg/L）组 MDA 表达较低、中剂量组不同时间点上调，差异有统计学意义（P<0.05）。说明 HPS-1 具有调控 A549 细胞氧化应激的作用，且大剂量 HPS-1 介导作用更明显。
表4
各组上清液氧化应激指标（n=3，
）
3 讨论
中药红芪是多序岩黄芪的干燥根，是甘肃省道地药材。研究发现红芪中提取出的生物活性物质 HPS 具有抗肿瘤作用[9-12]，但其机制目前尚不十分清楚，同时目前尚无关于 HPS-1 对人肺癌 A549 细胞氧化应激的相关研究。课题组前期研究发现红芪多糖作用于人肺腺癌 A549 细胞，通过 HPS 诱导肿瘤细胞凋亡以及促使肿瘤细胞中 Bcl-2/Bax 比例下降，进而可以抑制其增殖，诱导凋亡[9]，但具体机制尚未完全阐明。本课题组在既往研究的基础上，通过细胞分子生物学方法，研究 HPS-1 对人肺腺癌 A549 细胞活力、凋亡、ROS、抗氧化能力以及氧化过程中间代谢产物表达的影响，进一步研究 HPS-1 抗肿瘤的可能机制，为中药抗肿瘤治疗及筛选新的抗癌药物提供理论基础和实验数据支持。
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，单细胞生物以细胞分裂的方式产生新的个体。细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下，严格通过 DNA 复制、RNA 转录和蛋白质合成等复杂反应而进行的分裂系列过程，其中核 DNA 的复制倍增是整个过程的重要特征。本实验通过 MTT 法检测高、中、低剂量 HPS-1 对 A549 细胞增殖的影响，发现 HPS-1 具有抑制 A549 增殖的作用，与李世刚等[12]研究结果一致。
细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种，是细胞一种生理性、主动性的自杀行为。细胞凋亡的信号传递途径及调控机制复杂。目前认为细胞凋亡的发生主要有两条信号传导途径，一条为死亡受体通路，另一条途径为线粒体信号通路。研究证实细胞内存在复杂的氧化/还原平衡，它对细胞的正常代谢功能、细胞增殖、分化、凋亡的调控具有重要的作用[9,13]。对于需氧的有机生物体而言，ROS 的暴露是连续的不可避免的事件。ROS 的产生和细胞抗氧化能力之间严重的失衡就会导致各种类型的生物大分子的损失，包括 DNA、RNA、蛋白质和脂类，高活性的 ROS 对 DNA、RNA、蛋白质、脂类组分的损伤最终导致细胞凋亡。但是，在生物进化的过程中，细胞为了对抗氧化应激，形成了重要的防御机制。一种是细胞酶系统，包括 SOD、催化酶、谷胱甘肽过氧化物酶，这些酶能直接解除 ROS 对细胞的攻击；另外一种是具有氧化还原活性的氧化还原体系，包括 GST 和硫氧还蛋白（Trx）氧化还原体系。Trx 在细胞凋亡调节中发挥着重要的作用。Trx 及其相关的 TrxR 能显著抑制细胞的凋亡，但其如何调节细胞的凋亡分子机制尚不能清楚，需进一步探究。
ROS 是人体正常的代谢产物，其来源于两方面，一是外源性自由基，二是内源性自由基。正常情况下，人体内的自由基处于不断产生与消除的动态平衡中。细胞膜脂质过氧化被认为是细胞内最主要的氧化损伤，MDA 是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，氧化损伤引起 MDA 生成量的增加，而 MDA 又可进一步激发细胞多方面的损伤。细胞内的抗氧化酶保护系统主要包括 GST、SOD、T-AOC、TrxR 等。我们通过 FCM 法检测 HPS-1 对 A549 细胞凋亡的影响，发现高、中、低剂量 HPS-1 均可诱导 A549 细胞凋亡（P<0.05），且具有浓度、时间依赖性。进一步通过荧光探针植入 A549 细胞、免疫比色法检测 HPS-1 干预后细胞上清液，发现 HPS-1 可促进人肺腺癌 A549 细胞 ROS、MDA 的上调（P<0.05），随着作用时间的延长，上调作用减低；促进 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR 的下调（P<0.05），随着 HPS-1 干预时间的延长，下调作用减低。本实验研究证实了 HPS-1 的抗氧化能力，结果与惠和平等[14] 和刘静等[15] 研究一致；同时通过研究 HPS-1 对肺腺癌 A549 细胞的干预结果发现其抗肿瘤活性作用，提示其抑制 A549 细胞增殖、诱导凋亡可能与调控细胞内氧化/抗氧化平衡机制有关。然而肿瘤细胞凋亡病理生理机制复杂，关于 HPS-1 具体抗肿瘤机制有待进一步研究证实。
肺癌的发病率近年来明显增高，尤其是女性肺癌发病率增长迅速，甚至超过了男性，临床工作中发现女性患者的病理类型以腺癌为主[1]。细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种。肿瘤的发生，一方面认为可能与细胞增殖的失控相关，而另一方面认为与细胞凋亡受到抑制相关。研究发现，诱导肿瘤细胞的凋亡是防治肿瘤的有效手段[2-5]。氧自由基（ROS）对细胞的损伤作用不仅与它在细胞内的浓度相关，还与细胞内 ROS/ 内源性的抗氧化物质的平衡相关。细胞内的抗氧化酶保护系统主要包括谷胱甘肽（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、硫氧还蛋白还原酶（TrxR）等。氧化/还原平衡失调对细胞增殖、凋亡的调控影响重大。红芪多糖（hedysarum polysaccharides，HPS）是中药豆科植物多序岩黄芪的干燥根的主要提取成分，主产于甘肃地区[6]。研究发现，HPS 有着特殊的生物活性，具有抗癌、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、增强免疫力等功效[7]。前期研究发现 HPS 作用于肺腺癌 A549 细胞，可抑制其增殖，诱导凋亡[8]，但具体机制尚未完全阐明。本课题组在既往研究的基础上，以人肺腺癌 A549 细胞为研究对象，通过 MTT 法、流式细胞术（FCM）法、比色法、化学荧光法探讨红芪多糖 HPS-1 抗肿瘤的可能机制。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 CO2 孵育箱（HERAcell150, Thermo 公司），超净工作台（中国 sw-cj-2f）；光学倒置显微镜（日本OLYMPUS CKX41+DP21），酶标仪（美国 Bio-rad），流式细胞仪（BD FACSVerse），低温离心机（Centrifuge 5427R）。
1.1.2 试剂 DMEM 低糖培养基（Sigma 公司），胎牛血清（杭州四季青公司 141010），胰蛋白酶（HyClone 公司 J130020），噻唑蓝（MTT，Sigma 公司 303H0531），二甲基亚砜（DMSO，100 ml，Sigma 公司，302A0327），十二烷基磺酸钠（SDS，Sigma 公司，325E037）。Annexin V-FITC/PI 试剂盒为 BD Pharmingen 公司产品。ROS、GSH、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、T-AOC、TrxR 以及脂肪酸过氧化代谢产物丙二醛（MDA）活性检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。人肺腺癌 A549 细胞为本实验室保存。
1.2 细胞培养及细胞克隆形成实验
胎牛血清（10%）与青链霉素（100 U/ml）混合适量 DMEM 低糖培养液，在 37.0 ℃、CO2 体积分数为 5% 的恒温、恒湿培养箱中培养，隔天换液。贴壁生长良好的人肺腺癌 A549 细胞经 0.25% 胰蛋白酶消化、传代。细胞实验均选用对数增长期且状态良好的 A549 细胞。参照王亚丽等[9] 的实验方法，将增长旺盛的 A549 细胞消化后，接种于 60 mm×15 mm 培养皿中，接种数为 40 万/皿，不同时间点消化细胞，通过细胞计数法，统计克隆形成细胞数，描绘 A549 细胞生长曲线。
空白组为无细胞接种组，对照组培养基中无药物干预，其余处理步骤同实验组。
1.3 MTT 法检测 HPS-1 对 A549 细胞增殖的抑制作用
少量高浓度 HPS-1 加入低糖 DMEM 完全培养基中并及时混匀，终浓度分别为 50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。实验在 4 块 96 孔板进行，每组设 5 个复孔，每孔加入的完全培养基为 100 μl，每孔细胞数控制在 8×103 个，实验重复 3 次。细胞贴壁 16 h 后给药，24 h、48 h 两个时间点分别加入 20 μL（5 g/L）MTT，6 h 后每孔加入 SDS（10%，mol/V）150 μl 每孔，37 ℃ 过夜，取出 96 孔板用酶标仪于 570 nm 波长处检测每孔的吸光度（OD）值。细胞增殖抑制率= [1–（实验药物组OD 值/正常对照组OD 值） ]%。
1.4 FCM 法检测 HPS-1 对 A549 细胞的细胞周期分布及凋亡的影响
培养细胞至培养皿约 80% 时消化，以 4×105 个/培养皿的密度接种于培养皿（60 mm×15 mm）中，细胞贴壁后（16 h）换液，加入含有不同剂量药物的完全培养液，作用 48 h 后消化细胞，1 500 r/min 离心 5 min（离心半径为29.9 cm），弃掉上清液，PBS 缓冲液洗涤 2 次。1 500 r/min 再次离心 5 min，后收集细胞，缓缓加入适量 –20 ℃ 提前预冷的 70% 酒精溶液，1 500 r/min 离心 5 min 后，PBS 缓冲液洗涤 2 次，收集细胞，按 Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒操作步骤操作，30 min 后上流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡率情况。
1.5 化学荧光法检测 HPS-1 对 A549 细胞 ROS 的影响
ROS 包括超氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物和羟化物，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。本实验采用 DCFH-DA 探针检测细胞内 ROS 水平。DCFH-DA 进入细胞后被酯酶水解为 DCFH，活性氧存在时 DCFH 被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质 DCF，在 530 nm 波长处有强大波峰，其强度与细胞内活性氧水平成正比。
培养细胞至培养皿约 80% 时消化，以 1×105 个/培养皿的密度接种于培养皿 24 孔板中，细胞贴壁后（16 h）换液，加入含有不同剂量药物的完全培养液，作用 12 h、24 h 后，加入终浓度 10 μmol/L 的 DCFH-DA 于培养基，37 ℃ 孵育 60 min 后消化细胞，PBS 洗涤 2 次，制成单细胞悬液，于 530 nm 波长处检测各孔OD 值。
1.6 比色法检测 HPS-1 干预 A549 细胞后上清液中 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 的表达量
培养细胞至培养皿约 80% 时消化，以 4×105 个/培养皿的密度接种于培养皿（60 mm×15 mm） 中，细胞贴壁后（16 h）换液，加入含有不同剂量药物的完全培养液，作用 12 h、24 h 后，收集各组标本上清液，按照各试剂盒说明进行后续操作，依次加入各试剂，震荡混匀后，静置 10 min，双蒸水调零，1 cm 光径，不同波长 [MDA（532 nm），T-AOC（520 nm），T-SOD（550 nm），GSH（420 nm），TrxR（490 nm） ] 处测各组上清液OD 值。
1.7 统计学方法
采用 IBM 公司 SPSS 21.0 统计学软件进行后续统计分析，计量资料符合正态分布及方差齐性时，数据结果以均数±标准差（ ）表示，两个样本均数的比较采用t 检验，多样本均数的比较采用方差分析，以 α=0.05 为检验水准，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 A549 细胞生长曲线
采用细胞计数法，接种等量细胞数于 4 个培养皿中，分别于 15、24、48、64 h 时间点各随机消化 1 个培养皿中细胞，计数后绘制 A549 细胞生长曲线，为后续增殖及凋亡实验药物干预时间的选取提供参考。克隆形成实验结果见图 1。
图1
正常人肺腺癌 A549 细胞生长曲线
2.2 MTT 实验结果
选取低、中、高浓度 HPS-1（50、100、200 mg/L）作用于 A549 细胞，药物干预 24 h、48 h 后各组细胞依据OD 数据可知，各实验组与对照组比较表现为增殖抑制作用（P<0.05），各组细胞活力与时间、HPS-1 剂量相关（P<0.05），而与时间剂量无交互作用（P>0.05）。结果见表 1。
表1
MTT 实验结果（n=5，
）
2.3 HPS-1 对 A549 细胞凋亡的影响
选取低、中、高剂量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 细胞 24 h、48 h 后收集细胞，按照 Annexin Ⅴ-FITC/PI 试剂盒说明上机检测。FCM 法检测结果显示，HPS-1 作用于各组细胞 48 h 后，实验组细胞凋亡率（早期+晚期）均较对照组高（P<0.05），说明 HPS-1 对 A549 细胞具有凋亡诱导作用，结果见表 2。
表2
细胞周期及细胞凋亡率结果（n=3，%，
）
2.4 HPS-1 对 A549 细胞 ROS 表达的影响果
选取低、中、高剂量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 细胞 12 h、24 h 后加入（终浓度 10 μmol/L）DCFH-DA 后孵育 60 min，收集细胞后上机检测。检测结果显示，HPS-1 作用于各组细胞 12 h 后，实验组细胞 ROS 含量均较对照组高（P<0.05），且 HPS-1 高剂量组 ROS 较低、中剂量组高（P<0.05）；在 24 h 时间点，HPS-1 高剂量组细胞内 ROS 含量较 12 h 时间点减低（P<0.05），且高于对照组及低、中剂量 HPS-1 组（P<0.05）。说明 HPS-1 对 A549 细胞内 ROS 具有调节作用，且与时间剂量相关。结果见表 3。
表3
各组细胞不同时间点细胞内 ROS 检测结果（n=3，
）
2.5 细胞上清液中 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 含量
选取低、中、高剂量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 细胞 12 h、24 h 后，收集各实验组细胞上清液，严格按照 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 活力检测试剂盒说明操作，各OD 值结果见表 4。高、中、低剂量 HPS-1 对 A549 细胞 T-SOD、T-AOC、GSH、MDA、TrxR 具有调控作用，其中各实验组上清液中 T-SOD、T-AOC、GSH、TrxR 在 HPS-1 干预 A549 细胞 12 h、24 h 后表达出现明显下调（P<0.05），且随着时间推移，下调比例减 低。上清液中 MDA 在 HPS-1 干预 A549 细胞 12 h、24 h 后表达出现明显上调（P<0.05），且随着时间推移上调比例减低。大剂量（200 mg/L）组 T-SOD、T-AOC、GSH、TrxR 表达较低、中剂量组不同时间点下调，差异有统计学意义（P<0.05）。大剂量（200 mg/L）组 MDA 表达较低、中剂量组不同时间点上调，差异有统计学意义（P<0.05）。说明 HPS-1 具有调控 A549 细胞氧化应激的作用，且大剂量 HPS-1 介导作用更明显。
表4
各组上清液氧化应激指标（n=3，
）
3 讨论
中药红芪是多序岩黄芪的干燥根，是甘肃省道地药材。研究发现红芪中提取出的生物活性物质 HPS 具有抗肿瘤作用[9-12]，但其机制目前尚不十分清楚，同时目前尚无关于 HPS-1 对人肺癌 A549 细胞氧化应激的相关研究。课题组前期研究发现红芪多糖作用于人肺腺癌 A549 细胞，通过 HPS 诱导肿瘤细胞凋亡以及促使肿瘤细胞中 Bcl-2/Bax 比例下降，进而可以抑制其增殖，诱导凋亡[9]，但具体机制尚未完全阐明。本课题组在既往研究的基础上，通过细胞分子生物学方法，研究 HPS-1 对人肺腺癌 A549 细胞活力、凋亡、ROS、抗氧化能力以及氧化过程中间代谢产物表达的影响，进一步研究 HPS-1 抗肿瘤的可能机制，为中药抗肿瘤治疗及筛选新的抗癌药物提供理论基础和实验数据支持。
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，单细胞生物以细胞分裂的方式产生新的个体。细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下，严格通过 DNA 复制、RNA 转录和蛋白质合成等复杂反应而进行的分裂系列过程，其中核 DNA 的复制倍增是整个过程的重要特征。本实验通过 MTT 法检测高、中、低剂量 HPS-1 对 A549 细胞增殖的影响，发现 HPS-1 具有抑制 A549 增殖的作用，与李世刚等[12]研究结果一致。
细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种，是细胞一种生理性、主动性的自杀行为。细胞凋亡的信号传递途径及调控机制复杂。目前认为细胞凋亡的发生主要有两条信号传导途径，一条为死亡受体通路，另一条途径为线粒体信号通路。研究证实细胞内存在复杂的氧化/还原平衡，它对细胞的正常代谢功能、细胞增殖、分化、凋亡的调控具有重要的作用[9,13]。对于需氧的有机生物体而言，ROS 的暴露是连续的不可避免的事件。ROS 的产生和细胞抗氧化能力之间严重的失衡就会导致各种类型的生物大分子的损失，包括 DNA、RNA、蛋白质和脂类，高活性的 ROS 对 DNA、RNA、蛋白质、脂类组分的损伤最终导致细胞凋亡。但是，在生物进化的过程中，细胞为了对抗氧化应激，形成了重要的防御机制。一种是细胞酶系统，包括 SOD、催化酶、谷胱甘肽过氧化物酶，这些酶能直接解除 ROS 对细胞的攻击；另外一种是具有氧化还原活性的氧化还原体系，包括 GST 和硫氧还蛋白（Trx）氧化还原体系。Trx 在细胞凋亡调节中发挥着重要的作用。Trx 及其相关的 TrxR 能显著抑制细胞的凋亡，但其如何调节细胞的凋亡分子机制尚不能清楚，需进一步探究。
ROS 是人体正常的代谢产物，其来源于两方面，一是外源性自由基，二是内源性自由基。正常情况下，人体内的自由基处于不断产生与消除的动态平衡中。细胞膜脂质过氧化被认为是细胞内最主要的氧化损伤，MDA 是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，氧化损伤引起 MDA 生成量的增加，而 MDA 又可进一步激发细胞多方面的损伤。细胞内的抗氧化酶保护系统主要包括 GST、SOD、T-AOC、TrxR 等。我们通过 FCM 法检测 HPS-1 对 A549 细胞凋亡的影响，发现高、中、低剂量 HPS-1 均可诱导 A549 细胞凋亡（P<0.05），且具有浓度、时间依赖性。进一步通过荧光探针植入 A549 细胞、免疫比色法检测 HPS-1 干预后细胞上清液，发现 HPS-1 可促进人肺腺癌 A549 细胞 ROS、MDA 的上调（P<0.05），随着作用时间的延长，上调作用减低；促进 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR 的下调（P<0.05），随着 HPS-1 干预时间的延长，下调作用减低。本实验研究证实了 HPS-1 的抗氧化能力，结果与惠和平等[14] 和刘静等[15] 研究一致；同时通过研究 HPS-1 对肺腺癌 A549 细胞的干预结果发现其抗肿瘤活性作用，提示其抑制 A549 细胞增殖、诱导凋亡可能与调控细胞内氧化/抗氧化平衡机制有关。然而肿瘤细胞凋亡病理生理机制复杂，关于 HPS-1 具体抗肿瘤机制有待进一步研究证实。
