引用本文： 党亚洁, 李潇, 郑明睿, 刘海霞, 周霞, 金先桥. 锝99m标记抗曲霉单克隆抗体的制备及在小鼠体内的分布. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(4): 351-355. doi: 10.7507/1671-6205.2016083 复制
烟曲霉(Aspergillus fumigatus，Af)是一种腐生丝状真菌，其孢子很小，极易被吸入到呼吸道内，可以引起从无症状定植到过敏性疾病和侵袭性感染等肺部多种疾病[1-3]。早期精确诊断是及时应用抗真菌药物治疗、改善临床预后、降低死亡率的前提。然而，曲霉的检测仍是临床工作中面临的一大难题。目前临床上检测曲霉感染通常依靠痰培养和血培养，但是痰培养容易污染，血培养阳性的几率很小[4]。因此，及时开发出快速、特异、无创且易于操作的检测技术是目前检测曲霉诊断研究需要解决的问题。
Mab-WF-AF-1是一种商业化的鼠抗曲霉单克隆抗体，它由烟曲霉菌胞壁提取物免疫小鼠制备而成[5]。该抗体特异性识别曲霉菌属，如烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉，与曲霉菌胞壁及隔膜强烈反应。此抗体特异性较强，与常见的真菌生物等没有交叉反应[5]。国外研究发现该抗体在应用免疫组化技术检测曲霉感染中有可靠的诊断效果[6]。国内学者周晓谦等[7]、李原等[8]用免疫组化方法，Mab-WF-AF-1作为一抗，检测曲霉性鼻窦炎及以曲霉为主的鼻窦真菌球感染，也验证了该抗体在鉴定曲霉中具有较好的特异性。
放射性核素显像技术已广泛用于医学领域，该技术敏感性高，特异性强，无创伤，准确性好，在肿瘤、炎症的检测和治疗以及脏器功能评价等许多方面显示良好的应用价值[9]。本研究采用放射性核素锝99m(99mTc)标记抗曲霉的单克隆抗体，探索标记物的标记率和稳定性，以及标记后免疫活性，并观察它在正常小鼠体内的生物分布特性，以期为应用锝标记的抗曲霉单抗检测曲霉感染奠定实验基础。
材料与方法
一 材料
1．实验动物：昆明小鼠，雌性，体重(25±1) g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。实验前1周适应性饲养。
2．主要试剂：Na99TcmO4淋洗液(上海欣科医药公司)，抗曲霉单克隆抗体WF-AF-1(英国AbD Serotec公司)，NHS-MAG3粉末(上海中科院)，Sephadex G-30柱(美国Amersham公司)，Whatman 1号薄层层析纸(英国Whatman公司)，其余试剂为国产分析纯试剂。
3．菌株：烟曲霉菌株来源于临床上烟曲霉感染患者临床痰液标本，经菌种鉴定后的保存菌株。白假丝酵母菌和金黄色葡萄菌为上海市第一人民医院检验科赠送。
二 方法
1．烟曲霉孢子悬液的制备：参考文献[10-11]的方法，将烟曲霉菌株接种于PDA培养基上，37 ℃培养5 d，用含0.1%的吐温20的生理盐水10 mL冲洗培养基，收集菌液，用8层无菌纱布过滤以除去菌丝，血球计数板上计数，生理盐水调整孢子悬液浓度为1×107 cfu/mL，保存于4 ℃冰箱备用。
2．标记物的制备：参照文献[12-13]的标记方法，抗体先与NHS-MAG3偶联，再标记99mTc。偶联前将鼠抗曲霉的单克隆抗体Mab-WF-AF-1置于超滤离心管中，离心去除叠氮化钠。取10 μg蛋白溶于50 μL 0.3 mol/L HEPES缓冲液(pH值8~8.5)，加入双功能联接剂NHS-MAG3粉末，混匀后室温反应1 h，或4 ℃反应过夜。将所得的偶联物溶液转移到微量超滤离心柱中，加入0.25 mol/L醋酸铵，4 ℃离心机离心10 000 r/min，5 min，离心后弃下管液体，去除游离NHS-MAG3，重复1次，最后用0.25 mol/L醋酸铵将终体积调到60 μL。上述溶液中加入20 μL的50 mg/mL酒石酸缓冲液(保证醋酸铵和酒石酸溶液的体积比为3∶1)，加入74 MBq的新鲜淋洗的99mTcO4，震荡后加入8 μL SnCl2溶液，摇匀后静置反应1 h，完成标记。用薄层层析法检测标记率和放化纯度，并检测标记物在PBS和血清中的稳定性。
3．标记抗体免疫活性测定：(1)体外结合实验：取1×107 cfu/mL的烟曲霉孢子1 mL，加入10 μL标记物(含0.1 μg蛋白)。4 ℃下振荡反应10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h，6 000 r/min离心10 min，弃上层溶液，然后用0.9%的Nacl溶液洗3次，γ计数器检测各管沉淀物的放射性计数，计算结合率。每个时间点3个复管。(2)对比实验：1×107 cfu/mL的金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌悬液各取1 mL，与10 μL标记物4 ℃反应1 h，如上方法计算结合率。两种菌各3个复管。(3)竞争抑制实验：3个复管，每管取1 mL，1×107 cfu/mL的烟曲霉孢子，加入50倍过量的未标记抗体。4 ℃下振荡反应1 h；继续加入10 μL标记物，孵育1 h。如上方法检测各管放射性计数，计算结合率。
4．正常小鼠体内生物分布：雌性昆明小鼠尾静脉注射3.7 MBq标记物，注射后40 min、2 h、4 h、7 h眼球采血处死小鼠，取心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠，各器官称重后测放射性计数，经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)。
三 统计学处理
数据处理使用SPSS 19.0统计软件包。计量数据用x±s表示。组间均数比较采用Student t检验，相关性采用Pearson’s相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 标记率
薄层层析法测定标记率，原点为标记产物，前沿为游离锝，99mTc胶体含量很少，在原点，可以忽略。结果如图 1所示，60 min时标记率达到(98.2±0.7)%。由于标记效率达到95%以上，不需要进一步纯化。
图1
99mTc标记的抗曲霉单克隆抗体Mab-WF-AF-1(99mTc-WF-AF-1)的标记效率
二 稳定性
标记产物的稳定性结果见图 2。稳定性实验表明99mTc-WF-AF-1在PBS和血清中保持较好的稳定性。
图2
99mTc-WF-AF-1在PBS和血清中的稳定性
三 体外实验
1．体外结合实验：标记物在各个时间与烟曲霉孢子的结合率如图 3所示。标记物与烟曲霉孢子混合后迅速结合，在1 h左右达到峰值(10.32±0.21)%，之后随时间的延长略有下降，但基本稳定在9%以上。
图3
99mTc-WF-AF-1在各个孵育时间的结合率
2．对比试验：标记物与金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌的结合率显著低于其与烟曲霉孢子的结合率[(1.88±0.45)%和(1.67±0.29)%比(10.32±0.21)%，P＜0.05]，结果见图 4。对比实验表明抗体标记后仍然特异地与烟曲霉孢子抗原结合。
图4
99mTc-WF-AF-1在体外与烟曲霉孢子、白假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌孵育1 h的结合率
*
3．竞争抑制实验：加入过量的未标记抗体与烟曲霉孢子孵育后，再加入的标记产物与烟曲霉孢子的结合明显受到抑制[(2.57±0.36)%比(10.32±0.21)%，P＜0.05]，进一步证实了标记抗体仍然保持良好的免疫活性。结果见图 5。
图5
与过量未标记抗体孵育1 h后99mTc-WF-AF-1与烟曲霉孢子的结合率
四 生物分布
99mTc-WF-A-F-1在健康小鼠体内生物分布结果见图 6。随时间的延长血池放射性逐渐降低，注射后40 min放射性摄取在小鼠体内为2.51 %ID/g，7 h时降为0.53 %ID/g左右。肝脾肾对标记物的摄取始终较高，提示标记物可能主要通过网状内皮系统和肾脏代谢。
图6
99mTc-WF-AF-1在正常小鼠体内的生物分布
讨论
烟曲霉的孢子直径很小，约为2～3 μm，极易被吸入到下呼吸道。正常人吸入的孢子很快被机体清除，并不会引起感染或者过敏性炎症。在免疫缺陷或者宿主防御功能受损的患者，烟曲霉孢子易定植于其气道内引起气道黏膜多种免疫功能状态的改变，甚至发芽引起感染性疾病。流行病学研究表明，由黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉和土曲霉引起的肺部疾病在不断增加[14-15]。我们前期研究发现，烟曲霉暴露能够上调表皮生长因子(EGF)和黏蛋白MUC5AC的表达[16]，加重气道炎症反应和气道重塑[17]，前列腺素D2及相关受体CRTH2在烟曲霉引起的哮喘加重中发挥重要作用[18]，并且气道高反应性及嗜酸粒细胞炎症的加重与血清总IgE水平密切相关[19]。
本实验制备的99mTc-WF-AF-1标记效率达到95%以上，因此不需要进一步纯化。室温下在PBS液和血清中的稳定性较好。标记物在体外与金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌的结合实验表明，标记抗体能特异地与烟曲霉孢子结合，抗体经过标记后仍然保持较高的免疫活性。竞争抑制实验进一步证实了标记抗体与曲霉孢子结合的特异性，为进一步研究标记物在体内特异检测烟曲霉的可行性奠定了基础。生物分布实验表明，标记物主要分布在肝、脾、肾和血液，胃肠摄取较少。随时间的延长血池放射性逐渐降低，注射后40 min放射性摄取在小鼠体内为2.51 %ID/g，7 h时降为0.53 %ID/g。注射后1 h到7 h肾脏的摄取从9.24 %ID/g降到2.64 %ID/g。肝脾放射性浓聚的原因可能为网状内皮系统对抗原抗体复合物的吞噬[20-22]所致。
Mab-WF-AF-1是IgM型抗体，分子量较大，约为950 kD，有10个抗原结合位点，与IgG相比有较高的抗原结合力。另外，鼠IgM和IgG的血清半衰期分别为2 d和8 d[23]。因此，推测IgM型抗体优于IgG型。国外有学者认为IgM抗体片段血液清除比完整抗体快[24]，也有学者认为分子量大小或许并不是血液清除的主要因素[21]，因为他们发现IgM单体的清除更类似于五聚体的清除，而不像IgG抗体的清除。因此，后续实验需要进一步探究完整抗体、单体、片段的生物分布特征，以及标记物的显像研究，并检测其在动物模型中的应用，如肺曲霉感染、气道曲霉定植等模型。
综上所述，本实验初步探索了99mTc标记Mab-WF-AF-1的制备方法和体外特性，以及在正常小鼠体内的生物分布特点，为今后进一步研究应用放射性核素标记Mab-WF-AF-1检测肺内曲霉感染及放射治疗提供了实验基础，同时也为利用放射核素示踪技术检测其他微生物提供了新思路。
烟曲霉(Aspergillus fumigatus，Af)是一种腐生丝状真菌，其孢子很小，极易被吸入到呼吸道内，可以引起从无症状定植到过敏性疾病和侵袭性感染等肺部多种疾病[1-3]。早期精确诊断是及时应用抗真菌药物治疗、改善临床预后、降低死亡率的前提。然而，曲霉的检测仍是临床工作中面临的一大难题。目前临床上检测曲霉感染通常依靠痰培养和血培养，但是痰培养容易污染，血培养阳性的几率很小[4]。因此，及时开发出快速、特异、无创且易于操作的检测技术是目前检测曲霉诊断研究需要解决的问题。
Mab-WF-AF-1是一种商业化的鼠抗曲霉单克隆抗体，它由烟曲霉菌胞壁提取物免疫小鼠制备而成[5]。该抗体特异性识别曲霉菌属，如烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉，与曲霉菌胞壁及隔膜强烈反应。此抗体特异性较强，与常见的真菌生物等没有交叉反应[5]。国外研究发现该抗体在应用免疫组化技术检测曲霉感染中有可靠的诊断效果[6]。国内学者周晓谦等[7]、李原等[8]用免疫组化方法，Mab-WF-AF-1作为一抗，检测曲霉性鼻窦炎及以曲霉为主的鼻窦真菌球感染，也验证了该抗体在鉴定曲霉中具有较好的特异性。
放射性核素显像技术已广泛用于医学领域，该技术敏感性高，特异性强，无创伤，准确性好，在肿瘤、炎症的检测和治疗以及脏器功能评价等许多方面显示良好的应用价值[9]。本研究采用放射性核素锝99m(99mTc)标记抗曲霉的单克隆抗体，探索标记物的标记率和稳定性，以及标记后免疫活性，并观察它在正常小鼠体内的生物分布特性，以期为应用锝标记的抗曲霉单抗检测曲霉感染奠定实验基础。
材料与方法
一 材料
1．实验动物：昆明小鼠，雌性，体重(25±1) g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。实验前1周适应性饲养。
2．主要试剂：Na99TcmO4淋洗液(上海欣科医药公司)，抗曲霉单克隆抗体WF-AF-1(英国AbD Serotec公司)，NHS-MAG3粉末(上海中科院)，Sephadex G-30柱(美国Amersham公司)，Whatman 1号薄层层析纸(英国Whatman公司)，其余试剂为国产分析纯试剂。
3．菌株：烟曲霉菌株来源于临床上烟曲霉感染患者临床痰液标本，经菌种鉴定后的保存菌株。白假丝酵母菌和金黄色葡萄菌为上海市第一人民医院检验科赠送。
二 方法
1．烟曲霉孢子悬液的制备：参考文献[10-11]的方法，将烟曲霉菌株接种于PDA培养基上，37 ℃培养5 d，用含0.1%的吐温20的生理盐水10 mL冲洗培养基，收集菌液，用8层无菌纱布过滤以除去菌丝，血球计数板上计数，生理盐水调整孢子悬液浓度为1×107 cfu/mL，保存于4 ℃冰箱备用。
2．标记物的制备：参照文献[12-13]的标记方法，抗体先与NHS-MAG3偶联，再标记99mTc。偶联前将鼠抗曲霉的单克隆抗体Mab-WF-AF-1置于超滤离心管中，离心去除叠氮化钠。取10 μg蛋白溶于50 μL 0.3 mol/L HEPES缓冲液(pH值8~8.5)，加入双功能联接剂NHS-MAG3粉末，混匀后室温反应1 h，或4 ℃反应过夜。将所得的偶联物溶液转移到微量超滤离心柱中，加入0.25 mol/L醋酸铵，4 ℃离心机离心10 000 r/min，5 min，离心后弃下管液体，去除游离NHS-MAG3，重复1次，最后用0.25 mol/L醋酸铵将终体积调到60 μL。上述溶液中加入20 μL的50 mg/mL酒石酸缓冲液(保证醋酸铵和酒石酸溶液的体积比为3∶1)，加入74 MBq的新鲜淋洗的99mTcO4，震荡后加入8 μL SnCl2溶液，摇匀后静置反应1 h，完成标记。用薄层层析法检测标记率和放化纯度，并检测标记物在PBS和血清中的稳定性。
3．标记抗体免疫活性测定：(1)体外结合实验：取1×107 cfu/mL的烟曲霉孢子1 mL，加入10 μL标记物(含0.1 μg蛋白)。4 ℃下振荡反应10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h，6 000 r/min离心10 min，弃上层溶液，然后用0.9%的Nacl溶液洗3次，γ计数器检测各管沉淀物的放射性计数，计算结合率。每个时间点3个复管。(2)对比实验：1×107 cfu/mL的金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌悬液各取1 mL，与10 μL标记物4 ℃反应1 h，如上方法计算结合率。两种菌各3个复管。(3)竞争抑制实验：3个复管，每管取1 mL，1×107 cfu/mL的烟曲霉孢子，加入50倍过量的未标记抗体。4 ℃下振荡反应1 h；继续加入10 μL标记物，孵育1 h。如上方法检测各管放射性计数，计算结合率。
4．正常小鼠体内生物分布：雌性昆明小鼠尾静脉注射3.7 MBq标记物，注射后40 min、2 h、4 h、7 h眼球采血处死小鼠，取心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠，各器官称重后测放射性计数，经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)。
三 统计学处理
数据处理使用SPSS 19.0统计软件包。计量数据用x±s表示。组间均数比较采用Student t检验，相关性采用Pearson’s相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 标记率
薄层层析法测定标记率，原点为标记产物，前沿为游离锝，99mTc胶体含量很少，在原点，可以忽略。结果如图 1所示，60 min时标记率达到(98.2±0.7)%。由于标记效率达到95%以上，不需要进一步纯化。
图1
99mTc标记的抗曲霉单克隆抗体Mab-WF-AF-1(99mTc-WF-AF-1)的标记效率
二 稳定性
标记产物的稳定性结果见图 2。稳定性实验表明99mTc-WF-AF-1在PBS和血清中保持较好的稳定性。
图2
99mTc-WF-AF-1在PBS和血清中的稳定性
三 体外实验
1．体外结合实验：标记物在各个时间与烟曲霉孢子的结合率如图 3所示。标记物与烟曲霉孢子混合后迅速结合，在1 h左右达到峰值(10.32±0.21)%，之后随时间的延长略有下降，但基本稳定在9%以上。
图3
99mTc-WF-AF-1在各个孵育时间的结合率
2．对比试验：标记物与金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌的结合率显著低于其与烟曲霉孢子的结合率[(1.88±0.45)%和(1.67±0.29)%比(10.32±0.21)%，P＜0.05]，结果见图 4。对比实验表明抗体标记后仍然特异地与烟曲霉孢子抗原结合。
图4
99mTc-WF-AF-1在体外与烟曲霉孢子、白假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌孵育1 h的结合率
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3．竞争抑制实验：加入过量的未标记抗体与烟曲霉孢子孵育后，再加入的标记产物与烟曲霉孢子的结合明显受到抑制[(2.57±0.36)%比(10.32±0.21)%，P＜0.05]，进一步证实了标记抗体仍然保持良好的免疫活性。结果见图 5。
图5
与过量未标记抗体孵育1 h后99mTc-WF-AF-1与烟曲霉孢子的结合率
四 生物分布
99mTc-WF-A-F-1在健康小鼠体内生物分布结果见图 6。随时间的延长血池放射性逐渐降低，注射后40 min放射性摄取在小鼠体内为2.51 %ID/g，7 h时降为0.53 %ID/g左右。肝脾肾对标记物的摄取始终较高，提示标记物可能主要通过网状内皮系统和肾脏代谢。
图6
99mTc-WF-AF-1在正常小鼠体内的生物分布
讨论
烟曲霉的孢子直径很小，约为2～3 μm，极易被吸入到下呼吸道。正常人吸入的孢子很快被机体清除，并不会引起感染或者过敏性炎症。在免疫缺陷或者宿主防御功能受损的患者，烟曲霉孢子易定植于其气道内引起气道黏膜多种免疫功能状态的改变，甚至发芽引起感染性疾病。流行病学研究表明，由黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉和土曲霉引起的肺部疾病在不断增加[14-15]。我们前期研究发现，烟曲霉暴露能够上调表皮生长因子(EGF)和黏蛋白MUC5AC的表达[16]，加重气道炎症反应和气道重塑[17]，前列腺素D2及相关受体CRTH2在烟曲霉引起的哮喘加重中发挥重要作用[18]，并且气道高反应性及嗜酸粒细胞炎症的加重与血清总IgE水平密切相关[19]。
本实验制备的99mTc-WF-AF-1标记效率达到95%以上，因此不需要进一步纯化。室温下在PBS液和血清中的稳定性较好。标记物在体外与金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌的结合实验表明，标记抗体能特异地与烟曲霉孢子结合，抗体经过标记后仍然保持较高的免疫活性。竞争抑制实验进一步证实了标记抗体与曲霉孢子结合的特异性，为进一步研究标记物在体内特异检测烟曲霉的可行性奠定了基础。生物分布实验表明，标记物主要分布在肝、脾、肾和血液，胃肠摄取较少。随时间的延长血池放射性逐渐降低，注射后40 min放射性摄取在小鼠体内为2.51 %ID/g，7 h时降为0.53 %ID/g。注射后1 h到7 h肾脏的摄取从9.24 %ID/g降到2.64 %ID/g。肝脾放射性浓聚的原因可能为网状内皮系统对抗原抗体复合物的吞噬[20-22]所致。
Mab-WF-AF-1是IgM型抗体，分子量较大，约为950 kD，有10个抗原结合位点，与IgG相比有较高的抗原结合力。另外，鼠IgM和IgG的血清半衰期分别为2 d和8 d[23]。因此，推测IgM型抗体优于IgG型。国外有学者认为IgM抗体片段血液清除比完整抗体快[24]，也有学者认为分子量大小或许并不是血液清除的主要因素[21]，因为他们发现IgM单体的清除更类似于五聚体的清除，而不像IgG抗体的清除。因此，后续实验需要进一步探究完整抗体、单体、片段的生物分布特征，以及标记物的显像研究，并检测其在动物模型中的应用，如肺曲霉感染、气道曲霉定植等模型。
综上所述，本实验初步探索了99mTc标记Mab-WF-AF-1的制备方法和体外特性，以及在正常小鼠体内的生物分布特点，为今后进一步研究应用放射性核素标记Mab-WF-AF-1检测肺内曲霉感染及放射治疗提供了实验基础，同时也为利用放射核素示踪技术检测其他微生物提供了新思路。
