引用本文： 李静, 刘晓琴, 杨业, 柳斌. LncRNA KCNQ1OT1在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(5): 453-457. doi: 10.7507/1671-6205.2016106 复制
肺癌在全球范围内新发病例数已超过120万/年，成为导致肿瘤相关死亡的重要原因。随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到肺癌的发生、发展和转移是多基因、多阶段、多因素共同参与的复杂过程，涉及多种分子机制[1-2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类长度大于200个碱基的非编码RNA。已证实LncRNA在癌症的发生发展中发挥重要作用，与多种癌症的生物学过程有关，比如癌症的发生发展、浸润和转移过程[3-5]。虽然基因组分析发现了大量的LncRNA，但目前只对少部分LncRNA进行了研究，其中研究较多的是HOTAIR和MALAT-1。这些LncRNA具有作为肿瘤诊断、预后分子标志物的潜力，其表达水平与多种肿瘤的临床病理特征及预后相关[6-9]。前期通过基因芯片发现LncRNA KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1 overlapping transcript 1, KCNQ1OT1)在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株中高表达，近年来的研究发现LncRNA KCNQ1重叠转录物1 (KCNQ1OT1)参与调节多种肿瘤的发生发展[10]，然而关于LncRNA KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1 overlapping transcritp 1, KCNQ1OT1)在NSCLC中的作用国内外尚未见相关报道。本研究通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，QRT-PCR)方法检测LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者肺癌组织及其对应的正常肺组织标本中的表达情况，并对患者的临床病理特征进行分析，揭示LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC中的可能作用，为寻找NSCLC患者临床预后的靶基因提供依据。
对象与方法
一 对象
收集2011年1月至2013年12月期间在四川省肿瘤医院行根治性或姑息性切除术的89例NSCLC癌组织及癌旁组织(癌旁组织距离癌组织达5 cm以上)，同时收集患者个人信息和详细临床资料。所有组织均经病理学确诊为NSCLC，手术切除的新鲜标本立即放入液氮中冻存，所有患者术前均未行放化疗。患者的性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、淋巴结是否转移及病理类型等方面的临床资料均收集完整。其中男49例，女40例；平均年龄(50.0±9.2)岁，年龄＜50岁42例，年龄≥50岁47例；临床分期Ⅰ期23例，Ⅱ期30例，Ⅲ期20例，Ⅳ期16例；鳞癌及其他类型20例，腺癌69例。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。
二 方法
1．随访：全部89例患者出院后均随访，以电话和复查的方式进行。随访内容包括一般情况、临床症状及影像学检查。随访起点为确诊日期，末次随访时间为2016年6月25日，至随访截止日，存活35例，死亡54例，无失访病例。随访时间18~66个月。
2．QRT-PCR分析LncRNA KCNQ1OT1的表达：收集NSCLC组织及癌旁组织50~100 mg，在液氮中磨成粉末后，加入1 mL Trizol液研磨(样品总体积不超过所用Trizol体积的10%)，分别移入去RNA酶的EP管中，提取总RNA。取上述准备的RNA，逆转录反应参照AMV逆转录试剂盒说明，在20 μL体系中加2 μg总RNA进行cDNA的合成。QRT-PCR采用2 × SYBR Green PCR Master Mix，取适量cDNA作为模板，引物浓度0.4 μmol/L，15 μL体系进行扩增，每个待测样本设置3个平行样。以U6 snRNA作为内参。PCR反应在实时定量PCR反应仪上进行。3次独立试验后得到的数据采用公式RQ=2-ΔΔCt的方法进行分析，其中ΔΔCt=(待测样品的目的基因Ct的平均值－待测样本的管家基因Ct的平均值)-(对照样品的目的基因Ct的平均值－对照样本的管家基因Ct的平均值)。将2-ΔΔCt=1作为分界值，CIP2A表达值＞1为高表达，CIP2A表达值＜1为低表达。
三 统计学处理
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。患者组织标本中LncRNA KCNQ1OT1表达数据以x±s表示，两组间样本均数比较采用t检验。应用χ2检验分析LncRNA KCNQ1OT1表达水平与各临床病理参数的关系；采用Kaplan-Meier生存分析法分析LncRNA KCNQ1OT1表达与NSCLC生存期(overall survival，OS)及无进展生存时间(progression-free survival，PFS)之间的关系；采用Cox比例风险模型分析影响NSCLC预后的因素。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者组织中的表达
采用QRT-PCR检测89例NSCLC癌组织和癌旁组织中LncRNA KCNQ1OT1的表达，结果显示LncRNA KCNQ1OT1在癌组织中的表达为7.266±0.470，较癌旁组织(1.162±0.087)明显增高，差异具有统计学意义(t=11.64，P＜0.001)。结果见图 1。
图1
LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者癌组织及癌旁组织中的表达
二 LncRNA KCNQ1OT1的表达与患者临床病理特征的关系
根据KCNQ1OT1在NSCLC组织中表达情况，以组织中KCNQ1OT1表达倍数的中位数3.742为界值，将89例NSCLC患者分为KCNQ1OT1高表达组(n=49)和KCNQ1OT1低表达组(n=40)，分析KCNQ1OT1表达水平与临床病理特征的关系。LncRNA KCNQ1OT1的表达与患者年龄、性别及病理类型无显著相关性(P＞0.05)，与肿瘤大小(χ2=12.619，P＜0.001)、淋巴结转移(χ2=10.298，P=0.001)、TNM分期(χ2=7.199，P=0.007)及吸烟史(χ2=24.005，P＜0.001)明显相关。
三 LncRNA KCNQ1OT1对患者生存的影响
生存分析提示LncRNA KCNQ1OT1高表达患者的总生存时间显著低于低表达患者(20.0个月比35.0个月，χ2=45.860，P＜0.001)(图 2a)。LncRNA KCNQ1OT1高表达患者的中位PFS显著低于低表达患者(12.0个月比24.0个月，χ2=31.510，P＜0.001)(图 2b)。
图2
LncRNA KCNQ1OT1对患者总生存时间及PFS的影响
Cox回归分析患者的性别、年龄、疾病分期、病理类型及LncRNA KCNQ1OT1表达与患者预后的关系，结果显示疾病分期和LncRNA KCNQ1OT1可作为独立的预后因子，分期越晚的相对危险度越高(RR=3.398，95%CI 2.351~7.876，P=0.001)，LncRNA KCNQ1OT1高表达的相对危险度为低表达者的6.318倍(RR=6.318，95%CI 4.745~12.537，P=0.001)。结果见表 2。
表1
LncRNA KCNQ1OT1的表达与患者临床病理特征的关系(例)
表2
LncRNA KCNQ1OT1表达与NSCLC预后的关系
讨论
肺癌是世界范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一。肺癌预后差的主要原因是肿瘤细胞发生侵袭与转移。诱发及促进肺癌细胞发生侵袭和转移的机制目前尚不十分清楚，早期诊断及转移的肿瘤标记物缺乏是肺癌治疗的重要挑战之一[11]。LncRNA是一类长度大于200个碱基，缺少完整的开放阅读框，无或很少有蛋白编码能力的RNA。研究表明LncRNA在细胞生理和病理活动中发挥重要的作用，并参与包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展过程。其中研究得最广泛的是HOTAIR。研究发现HOTAIR的失调与乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、喉鳞状细胞癌、鼻咽癌、NSCLC及食管癌相关，HOTAIR的失调影响着癌症患者的预后[12-14]。LncRNA与肺癌临床病理特征及预后的分析也逐渐增多，MALAT-1是第一个在肺癌中被研究的LncRNA，它可以作为早期肺腺癌中患者预后的一个独立预后标记物[15-16]。Liu等[17]研究发现HOTAIR在NSCLC样本中高表达，HOTAIR高表达状态与NSCLC淋巴结转移及临床分级相关，此外，HOTAIR高表达的患者预后相对较差。CCAT2被发现在NSCLC组织中显著高表达，CCAT2的高表达水平与肺腺癌相关，提示CCAT2可能是一个肺腺癌特异的LncRNA[18]。GAS5在NSCLC组织中低表达，其表达水平与NSCLC的肿瘤大小及临床分级相关[19]。GAS6-AS1在NSCLC组织中低表达，其表达水平与NSCLC的淋巴结转移及临床分级有关，而且GAS6-AS1是NSCLC患者一个独立的预后标志物[20]。虽然LncRNA与肺癌的研究越来越多，但是数量仍然有限。
KCNQ1OT1是一个位于KCNQ1位点的LncRNA基因。印记基因是指仅一方亲本来源的同源基因表达, 而来自另一亲本的不表达。KCNQ1OT1只表达父源等位基因，它的转录物调控位于11号染色体p端15.5着丝粒位置[21]。印记基因的异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种人类疾病[22-23]。关于KCNQ1OT1在肿瘤中的研究目前尚处于起步阶段，近年来的研究发现KCNQ1OT1可促进肝癌的形成[24]，关于KCNQ1OT1在NSCLC中的作用及机制目前国内外尚未见相关报道。本研究采用QRT-PCR法检测NSCLC癌组织及癌旁组织中LncRNA KCNQ1OT1的表达，结合临床资料分析其临床意义。本研究结果发现，与癌旁组织比较，LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC组织中的表达水平明显增高；LncRNA KCNQ1OT1的表达与患者年龄、性别及病理类型无关，与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期及吸烟史明显相关；生存分析提示LncRNA KCNQ1OT1高表达患者的总生存时间和中位PFS低于低表达患者；Cox回归分析发现疾病分期和LncRNA KCNQ1OT1的表达可作为独立的预后不良的标志。
综上所述，LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC癌组织标本中高表达，与患者的预后相关，可能是潜在的肺癌预后预测分子标志物。但由于样本量不大，且缺乏相关分子生物学及实验室数据，关于KCNQ1OT1在非小细胞肺癌中的具体作用及分子机制尚需进一步深入研究。
肺癌在全球范围内新发病例数已超过120万/年，成为导致肿瘤相关死亡的重要原因。随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到肺癌的发生、发展和转移是多基因、多阶段、多因素共同参与的复杂过程，涉及多种分子机制[1-2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类长度大于200个碱基的非编码RNA。已证实LncRNA在癌症的发生发展中发挥重要作用，与多种癌症的生物学过程有关，比如癌症的发生发展、浸润和转移过程[3-5]。虽然基因组分析发现了大量的LncRNA，但目前只对少部分LncRNA进行了研究，其中研究较多的是HOTAIR和MALAT-1。这些LncRNA具有作为肿瘤诊断、预后分子标志物的潜力，其表达水平与多种肿瘤的临床病理特征及预后相关[6-9]。前期通过基因芯片发现LncRNA KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1 overlapping transcript 1, KCNQ1OT1)在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株中高表达，近年来的研究发现LncRNA KCNQ1重叠转录物1 (KCNQ1OT1)参与调节多种肿瘤的发生发展[10]，然而关于LncRNA KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1 overlapping transcritp 1, KCNQ1OT1)在NSCLC中的作用国内外尚未见相关报道。本研究通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，QRT-PCR)方法检测LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者肺癌组织及其对应的正常肺组织标本中的表达情况，并对患者的临床病理特征进行分析，揭示LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC中的可能作用，为寻找NSCLC患者临床预后的靶基因提供依据。
对象与方法
一 对象
收集2011年1月至2013年12月期间在四川省肿瘤医院行根治性或姑息性切除术的89例NSCLC癌组织及癌旁组织(癌旁组织距离癌组织达5 cm以上)，同时收集患者个人信息和详细临床资料。所有组织均经病理学确诊为NSCLC，手术切除的新鲜标本立即放入液氮中冻存，所有患者术前均未行放化疗。患者的性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、淋巴结是否转移及病理类型等方面的临床资料均收集完整。其中男49例，女40例；平均年龄(50.0±9.2)岁，年龄＜50岁42例，年龄≥50岁47例；临床分期Ⅰ期23例，Ⅱ期30例，Ⅲ期20例，Ⅳ期16例；鳞癌及其他类型20例，腺癌69例。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。
二 方法
1．随访：全部89例患者出院后均随访，以电话和复查的方式进行。随访内容包括一般情况、临床症状及影像学检查。随访起点为确诊日期，末次随访时间为2016年6月25日，至随访截止日，存活35例，死亡54例，无失访病例。随访时间18~66个月。
2．QRT-PCR分析LncRNA KCNQ1OT1的表达：收集NSCLC组织及癌旁组织50~100 mg，在液氮中磨成粉末后，加入1 mL Trizol液研磨(样品总体积不超过所用Trizol体积的10%)，分别移入去RNA酶的EP管中，提取总RNA。取上述准备的RNA，逆转录反应参照AMV逆转录试剂盒说明，在20 μL体系中加2 μg总RNA进行cDNA的合成。QRT-PCR采用2 × SYBR Green PCR Master Mix，取适量cDNA作为模板，引物浓度0.4 μmol/L，15 μL体系进行扩增，每个待测样本设置3个平行样。以U6 snRNA作为内参。PCR反应在实时定量PCR反应仪上进行。3次独立试验后得到的数据采用公式RQ=2-ΔΔCt的方法进行分析，其中ΔΔCt=(待测样品的目的基因Ct的平均值－待测样本的管家基因Ct的平均值)-(对照样品的目的基因Ct的平均值－对照样本的管家基因Ct的平均值)。将2-ΔΔCt=1作为分界值，CIP2A表达值＞1为高表达，CIP2A表达值＜1为低表达。
三 统计学处理
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。患者组织标本中LncRNA KCNQ1OT1表达数据以x±s表示，两组间样本均数比较采用t检验。应用χ2检验分析LncRNA KCNQ1OT1表达水平与各临床病理参数的关系；采用Kaplan-Meier生存分析法分析LncRNA KCNQ1OT1表达与NSCLC生存期(overall survival，OS)及无进展生存时间(progression-free survival，PFS)之间的关系；采用Cox比例风险模型分析影响NSCLC预后的因素。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者组织中的表达
采用QRT-PCR检测89例NSCLC癌组织和癌旁组织中LncRNA KCNQ1OT1的表达，结果显示LncRNA KCNQ1OT1在癌组织中的表达为7.266±0.470，较癌旁组织(1.162±0.087)明显增高，差异具有统计学意义(t=11.64，P＜0.001)。结果见图 1。
图1
LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者癌组织及癌旁组织中的表达
二 LncRNA KCNQ1OT1的表达与患者临床病理特征的关系
根据KCNQ1OT1在NSCLC组织中表达情况，以组织中KCNQ1OT1表达倍数的中位数3.742为界值，将89例NSCLC患者分为KCNQ1OT1高表达组(n=49)和KCNQ1OT1低表达组(n=40)，分析KCNQ1OT1表达水平与临床病理特征的关系。LncRNA KCNQ1OT1的表达与患者年龄、性别及病理类型无显著相关性(P＞0.05)，与肿瘤大小(χ2=12.619，P＜0.001)、淋巴结转移(χ2=10.298，P=0.001)、TNM分期(χ2=7.199，P=0.007)及吸烟史(χ2=24.005，P＜0.001)明显相关。
三 LncRNA KCNQ1OT1对患者生存的影响
生存分析提示LncRNA KCNQ1OT1高表达患者的总生存时间显著低于低表达患者(20.0个月比35.0个月，χ2=45.860，P＜0.001)(图 2a)。LncRNA KCNQ1OT1高表达患者的中位PFS显著低于低表达患者(12.0个月比24.0个月，χ2=31.510，P＜0.001)(图 2b)。
图2
LncRNA KCNQ1OT1对患者总生存时间及PFS的影响
Cox回归分析患者的性别、年龄、疾病分期、病理类型及LncRNA KCNQ1OT1表达与患者预后的关系，结果显示疾病分期和LncRNA KCNQ1OT1可作为独立的预后因子，分期越晚的相对危险度越高(RR=3.398，95%CI 2.351~7.876，P=0.001)，LncRNA KCNQ1OT1高表达的相对危险度为低表达者的6.318倍(RR=6.318，95%CI 4.745~12.537，P=0.001)。结果见表 2。
表1
LncRNA KCNQ1OT1的表达与患者临床病理特征的关系(例)
表2
LncRNA KCNQ1OT1表达与NSCLC预后的关系
讨论
肺癌是世界范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一。肺癌预后差的主要原因是肿瘤细胞发生侵袭与转移。诱发及促进肺癌细胞发生侵袭和转移的机制目前尚不十分清楚，早期诊断及转移的肿瘤标记物缺乏是肺癌治疗的重要挑战之一[11]。LncRNA是一类长度大于200个碱基，缺少完整的开放阅读框，无或很少有蛋白编码能力的RNA。研究表明LncRNA在细胞生理和病理活动中发挥重要的作用，并参与包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展过程。其中研究得最广泛的是HOTAIR。研究发现HOTAIR的失调与乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、喉鳞状细胞癌、鼻咽癌、NSCLC及食管癌相关，HOTAIR的失调影响着癌症患者的预后[12-14]。LncRNA与肺癌临床病理特征及预后的分析也逐渐增多，MALAT-1是第一个在肺癌中被研究的LncRNA，它可以作为早期肺腺癌中患者预后的一个独立预后标记物[15-16]。Liu等[17]研究发现HOTAIR在NSCLC样本中高表达，HOTAIR高表达状态与NSCLC淋巴结转移及临床分级相关，此外，HOTAIR高表达的患者预后相对较差。CCAT2被发现在NSCLC组织中显著高表达，CCAT2的高表达水平与肺腺癌相关，提示CCAT2可能是一个肺腺癌特异的LncRNA[18]。GAS5在NSCLC组织中低表达，其表达水平与NSCLC的肿瘤大小及临床分级相关[19]。GAS6-AS1在NSCLC组织中低表达，其表达水平与NSCLC的淋巴结转移及临床分级有关，而且GAS6-AS1是NSCLC患者一个独立的预后标志物[20]。虽然LncRNA与肺癌的研究越来越多，但是数量仍然有限。
KCNQ1OT1是一个位于KCNQ1位点的LncRNA基因。印记基因是指仅一方亲本来源的同源基因表达, 而来自另一亲本的不表达。KCNQ1OT1只表达父源等位基因，它的转录物调控位于11号染色体p端15.5着丝粒位置[21]。印记基因的异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种人类疾病[22-23]。关于KCNQ1OT1在肿瘤中的研究目前尚处于起步阶段，近年来的研究发现KCNQ1OT1可促进肝癌的形成[24]，关于KCNQ1OT1在NSCLC中的作用及机制目前国内外尚未见相关报道。本研究采用QRT-PCR法检测NSCLC癌组织及癌旁组织中LncRNA KCNQ1OT1的表达，结合临床资料分析其临床意义。本研究结果发现，与癌旁组织比较，LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC组织中的表达水平明显增高；LncRNA KCNQ1OT1的表达与患者年龄、性别及病理类型无关，与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期及吸烟史明显相关；生存分析提示LncRNA KCNQ1OT1高表达患者的总生存时间和中位PFS低于低表达患者；Cox回归分析发现疾病分期和LncRNA KCNQ1OT1的表达可作为独立的预后不良的标志。
综上所述，LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC癌组织标本中高表达，与患者的预后相关，可能是潜在的肺癌预后预测分子标志物。但由于样本量不大，且缺乏相关分子生物学及实验室数据，关于KCNQ1OT1在非小细胞肺癌中的具体作用及分子机制尚需进一步深入研究。
