引用本文： 高航, 殷俊, 包勇. 非小细胞肺癌患者中外周血浆K-ras基因突变的研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(5): 458-460. doi: 10.7507/1671-6205.2016107 复制
肺癌的发病率及病死率在我国居于各恶性肿瘤之首，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占75%~80%[1]。目前针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的靶向治疗在NSCLC患者中的治疗取得了较好的疗效。有研究表明，EGFR突变是引起NSCLC对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)敏感的主要机制[2-3]。但在临床治疗中发现，有部分患者对EGFR-TKI产生耐药，进一步研究发现，K-ras突变是患者对EGFR-TKI产生耐药的机制之一，因此需要根据K-ras基因突变检测结果调整NSCLC患者的治疗方案[4-7]。目前检测K-ras基因突变的标本主要来自肺癌组织，但通过获取每位患者的肺癌组织进行K-ras突变的治疗前检查比较困难，且难以重复动态监测，而外周血浆中游离DNA大多为肿瘤细胞的坏死、凋亡或肿瘤细胞主动释放，故在理论上能够实现对肿瘤基因状态的实时动态监测。多项研究显示K-ras基因突变因区域、种族不同而不同[8-10]。本研究通过对242例四川地区NSCLC患者的外周血浆中的游离DNA及肺癌组织应用突变富集液相芯片技术检测K-ras基因突变进行对比，探讨检测外周血浆中的K-ras基因突变在四川地区NSCLC患者中的可行性及准确性。
对象与方法
一 对象
选取我院2013年1月至2015年8月病理确诊的四川地区NSCLC患者242例，且242例患者均为四川地区原住人口。其中男163例，年龄55~78岁，平均年龄(61.2±13.3)岁；女79例，年龄50~80岁，平均年龄(66.7±15.3)岁；包括腺癌150例，鳞癌71例，其他类型肺癌21例。
二 方法
1．提取DNA：收集NSCLC患者治疗前静脉血4 mL，于4 ℃静置2 h后离心，2 500 r/min 10 min，留取血浆至新离心管中，再次离心10 min，留取血浆约1 mL加入蛋白酶K(20 g/L)15 μL、10％十二烷基磺酸钠50 μL，水浴(60 ℃)2 h后进行酚-氯仿-异戊醇抽提，酒精沉淀过夜，次日离心，洗盐，将沉淀溶于适量三羟甲基氨基甲烷盐酸盐及乙二胺四乙酸的混合物中，-20 ℃保存备用。
取NSCLC组织样本30 mg，加入裂解液、蛋白酶K，水浴(水温保持在60 ℃)，3~6 h，再行酚-氯仿-异戊醇提取DNA，于-20 ℃保存待检。
2．PCR扩增DNA：引物设计：参考K-ras基因的核酸序列(NM-033360.2)。K-ras上游引物：5′-AGGCCTGCTGTGACTGA-3′；K-ras下游引物：5′-CCTCTATIGITGGATCATATrCGT-3′。将提取的DNA置于PCR反应体系中扩增，PCR反应条件：95 ℃ 15 min、94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。
3．微球杂交反应：微球杂交体系由22 μL杂交预混液和3 μL LDR反应产物组成，杂交体系配制完成后置于PCR扩增仪上45 ℃ 10 min后，加入75 μL SA-PE，继续保持45℃孵育15 min。Luminex 100仪器读数。
三 统计学处理
应用SPSS 17.0软件进行数据分析，K-ras基因突变在外周血浆与肺癌组织中的检出率用χ2检验进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义；外周血浆游离DNA中的K-ras基因突变检出率与肺癌组织中的检出率的相关性使用Kappa检验进行分析，其评价标准为：Kappa值≥0.75时表示两结果一致性较好，0.40＜Kappa值＜0.75时表示一致性中等，0＜Kappa值≤0.40时一致性较差，Kappa值＜0时一致程度比机遇造成的还差。
结果
在本组242例NSCLC病例中，肺癌组织中检测出K-ras基因突变者共有12例患者，检出率为4.96%，外周血浆中检出10例K-ras基因突变，检出率为4.13%。结果见表 1。外周血浆游离DNA中的K-ras基因突变检出率与肺癌组织中的检出率具有较好的一致性(Kappa值=0.81)。结果见表 2。
表1
K-ras基因突变在不同组织学类型中的检出率[例(%)]
表2
K-ras基因突变在肺癌组织与外周血浆中的检出例数的比较
讨论
K-ras基因突变是引起NSCLC患者对EGFR-TKI产生耐药的机制之一，有研究发现发生K-ras基因突变的NSCLC患者全部对EGFR-TKI产生耐药，其作用机制尚未完全明确[4-7]。杨帆等[4]对EGFR下游通路研究发现，突变的K-ras替代EGFR激活了下游通路，包括AKT、STAT和Ras/MSPK三条途径，进一步研究发现K-ras变异引起的EGFR-TKI耐药除AKT及STAT通路持续激活外，可能存在其他通路影响。在《2009年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当K-ras基因发生突变，则不建议患者单独使用厄洛替尼(Tarceva/特罗凯/Erlotinib)进行分子靶向治疗。因此，患者治疗前能够明确K-ras基因是否发生突变显得十分重要。
研究发现K-ras基因突变在非亚洲人群中较高，在腺癌患者达到了30%~50%；亚洲国家NSCLC患者K-ras基因的突变率为4%~24%[11-13]。在国内的研究中，罗炜等[11]报道的广东地区肺癌组织中K-ras基因突变率为3.7%；张卉等[12-13]报道的北京地区肺腺癌和肺鳞癌组织中K-ras基因突变率分别为7.8%和5%；衣素琴等[14]报道的江苏地区肺癌组织中K-ras基因突变率为5.03%，在肺腺癌和肺鳞癌患者中的突变率分别为5.30%和4.17%；许春伟等[15]报道的肺癌组织K-ras基因突变率则高达11.28%。其中突出率差异的原因可能是K-ras基因突变也与EGFR基因突变一样，在不同种族或同一种族不同地区中存在差异，因此对多地区样本进行检测分析对临床工作有指导意义[15]。
本研究纳入242例患者主要为四川川中(成都、德阳、绵阳、遂宁、眉山、资阳)汉族患者，也有部分川西凉山彝族自治州与甘孜阿坝藏族自治州的少数民族患者。通过对同一患者的肺癌组织和外周血标本同时进行K-ras基因突变检测，发现肺癌组织中K-ras基因突变检出率为4.96%，外周血浆检出率为4.13%；在不同组织类型中，腺癌K-ras基因突变检出率在肺癌组织和外周血浆分别为5.33%和4.67%；鳞癌K-ras基因突变检出率在肺癌组织和外周血浆分别为2.82%和1.41%；肉瘤样癌的K-ras基因突变检出率较高，在肺癌组织中检出率20.00%，在外周血浆检出率10.00%，且通过对比肺癌组织与外周血浆中的K-ras基因突变发现，两者具有较好的相关性(Kappa值=0.81)，并且两者的检出率并差异无统计学意义，说明可以通过外周血浆游离DNA对四川地区NSCLC患者有无K-ras突变进行检测，以指导其治疗方式的选择。本研究中腺鳞癌患者外周血浆中检出1例K-ras基因突变，而在肺癌组织中未检出，可能与肺癌组织取材有关，由于病灶为非均质性，病灶活检标本可能不携带K-ras突变基因，而循环血DNA可以来自肺癌原发灶，也可以来自转移灶；同时在本组研究中，有3例在肺癌组织中检出K-ras基因突变，但在外周血浆中未检出，可能是因为肺癌携带突变基因部分释放进入血的DNA少于肺癌组织或肺癌组织，如炎性组织释放进入外周血导致DNA稀释导致外周血浆中K-ras突变基因含量过低，扩增次数不足。
本研究采用新型的突变富集液相芯片技术进行肺癌组织及外周血标本的K-ras突变基因检测，相较于实时荧光定量PCR，无需提取样品mRNA, 避免了因mRNA不稳定导致检测结果准确度下降。突变富集液相芯片法灵敏度高，最低可检测出占野生型拷贝数0.1%的突变序列，血浆及各类的组织标本，包括手术切除的巨大肿瘤组织标本和临床常见的微小组织标本如支气管镜活检、胸膜活检、肺穿刺、胸水包埋等都可以满足检测K-ras基因突变的检测要求[16]。
综上所述，检测四川地区NSCLC患者K-ras基因突变发生率与其他地区报道虽不尽相同，但也证实了我国不同地区肺癌患者K-ras突变分布确实存在差异。采用外周血进行K-ras基因检测，标本容易获取，可多次重复检测。本研究表明，四川地区NSCLC患者外周血浆与肺癌组织中K-ras基因突变的检出率具有较好一致性，可以替代肺癌组织进行检测筛查，有利于实现个性化治疗，避免不必要的靶向治疗带来的负担。
肺癌的发病率及病死率在我国居于各恶性肿瘤之首，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占75%~80%[1]。目前针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的靶向治疗在NSCLC患者中的治疗取得了较好的疗效。有研究表明，EGFR突变是引起NSCLC对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)敏感的主要机制[2-3]。但在临床治疗中发现，有部分患者对EGFR-TKI产生耐药，进一步研究发现，K-ras突变是患者对EGFR-TKI产生耐药的机制之一，因此需要根据K-ras基因突变检测结果调整NSCLC患者的治疗方案[4-7]。目前检测K-ras基因突变的标本主要来自肺癌组织，但通过获取每位患者的肺癌组织进行K-ras突变的治疗前检查比较困难，且难以重复动态监测，而外周血浆中游离DNA大多为肿瘤细胞的坏死、凋亡或肿瘤细胞主动释放，故在理论上能够实现对肿瘤基因状态的实时动态监测。多项研究显示K-ras基因突变因区域、种族不同而不同[8-10]。本研究通过对242例四川地区NSCLC患者的外周血浆中的游离DNA及肺癌组织应用突变富集液相芯片技术检测K-ras基因突变进行对比，探讨检测外周血浆中的K-ras基因突变在四川地区NSCLC患者中的可行性及准确性。
对象与方法
一 对象
选取我院2013年1月至2015年8月病理确诊的四川地区NSCLC患者242例，且242例患者均为四川地区原住人口。其中男163例，年龄55~78岁，平均年龄(61.2±13.3)岁；女79例，年龄50~80岁，平均年龄(66.7±15.3)岁；包括腺癌150例，鳞癌71例，其他类型肺癌21例。
二 方法
1．提取DNA：收集NSCLC患者治疗前静脉血4 mL，于4 ℃静置2 h后离心，2 500 r/min 10 min，留取血浆至新离心管中，再次离心10 min，留取血浆约1 mL加入蛋白酶K(20 g/L)15 μL、10％十二烷基磺酸钠50 μL，水浴(60 ℃)2 h后进行酚-氯仿-异戊醇抽提，酒精沉淀过夜，次日离心，洗盐，将沉淀溶于适量三羟甲基氨基甲烷盐酸盐及乙二胺四乙酸的混合物中，-20 ℃保存备用。
取NSCLC组织样本30 mg，加入裂解液、蛋白酶K，水浴(水温保持在60 ℃)，3~6 h，再行酚-氯仿-异戊醇提取DNA，于-20 ℃保存待检。
2．PCR扩增DNA：引物设计：参考K-ras基因的核酸序列(NM-033360.2)。K-ras上游引物：5′-AGGCCTGCTGTGACTGA-3′；K-ras下游引物：5′-CCTCTATIGITGGATCATATrCGT-3′。将提取的DNA置于PCR反应体系中扩增，PCR反应条件：95 ℃ 15 min、94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。
3．微球杂交反应：微球杂交体系由22 μL杂交预混液和3 μL LDR反应产物组成，杂交体系配制完成后置于PCR扩增仪上45 ℃ 10 min后，加入75 μL SA-PE，继续保持45℃孵育15 min。Luminex 100仪器读数。
三 统计学处理
应用SPSS 17.0软件进行数据分析，K-ras基因突变在外周血浆与肺癌组织中的检出率用χ2检验进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义；外周血浆游离DNA中的K-ras基因突变检出率与肺癌组织中的检出率的相关性使用Kappa检验进行分析，其评价标准为：Kappa值≥0.75时表示两结果一致性较好，0.40＜Kappa值＜0.75时表示一致性中等，0＜Kappa值≤0.40时一致性较差，Kappa值＜0时一致程度比机遇造成的还差。
结果
在本组242例NSCLC病例中，肺癌组织中检测出K-ras基因突变者共有12例患者，检出率为4.96%，外周血浆中检出10例K-ras基因突变，检出率为4.13%。结果见表 1。外周血浆游离DNA中的K-ras基因突变检出率与肺癌组织中的检出率具有较好的一致性(Kappa值=0.81)。结果见表 2。
表1
K-ras基因突变在不同组织学类型中的检出率[例(%)]
表2
K-ras基因突变在肺癌组织与外周血浆中的检出例数的比较
讨论
K-ras基因突变是引起NSCLC患者对EGFR-TKI产生耐药的机制之一，有研究发现发生K-ras基因突变的NSCLC患者全部对EGFR-TKI产生耐药，其作用机制尚未完全明确[4-7]。杨帆等[4]对EGFR下游通路研究发现，突变的K-ras替代EGFR激活了下游通路，包括AKT、STAT和Ras/MSPK三条途径，进一步研究发现K-ras变异引起的EGFR-TKI耐药除AKT及STAT通路持续激活外，可能存在其他通路影响。在《2009年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当K-ras基因发生突变，则不建议患者单独使用厄洛替尼(Tarceva/特罗凯/Erlotinib)进行分子靶向治疗。因此，患者治疗前能够明确K-ras基因是否发生突变显得十分重要。
研究发现K-ras基因突变在非亚洲人群中较高，在腺癌患者达到了30%~50%；亚洲国家NSCLC患者K-ras基因的突变率为4%~24%[11-13]。在国内的研究中，罗炜等[11]报道的广东地区肺癌组织中K-ras基因突变率为3.7%；张卉等[12-13]报道的北京地区肺腺癌和肺鳞癌组织中K-ras基因突变率分别为7.8%和5%；衣素琴等[14]报道的江苏地区肺癌组织中K-ras基因突变率为5.03%，在肺腺癌和肺鳞癌患者中的突变率分别为5.30%和4.17%；许春伟等[15]报道的肺癌组织K-ras基因突变率则高达11.28%。其中突出率差异的原因可能是K-ras基因突变也与EGFR基因突变一样，在不同种族或同一种族不同地区中存在差异，因此对多地区样本进行检测分析对临床工作有指导意义[15]。
本研究纳入242例患者主要为四川川中(成都、德阳、绵阳、遂宁、眉山、资阳)汉族患者，也有部分川西凉山彝族自治州与甘孜阿坝藏族自治州的少数民族患者。通过对同一患者的肺癌组织和外周血标本同时进行K-ras基因突变检测，发现肺癌组织中K-ras基因突变检出率为4.96%，外周血浆检出率为4.13%；在不同组织类型中，腺癌K-ras基因突变检出率在肺癌组织和外周血浆分别为5.33%和4.67%；鳞癌K-ras基因突变检出率在肺癌组织和外周血浆分别为2.82%和1.41%；肉瘤样癌的K-ras基因突变检出率较高，在肺癌组织中检出率20.00%，在外周血浆检出率10.00%，且通过对比肺癌组织与外周血浆中的K-ras基因突变发现，两者具有较好的相关性(Kappa值=0.81)，并且两者的检出率并差异无统计学意义，说明可以通过外周血浆游离DNA对四川地区NSCLC患者有无K-ras突变进行检测，以指导其治疗方式的选择。本研究中腺鳞癌患者外周血浆中检出1例K-ras基因突变，而在肺癌组织中未检出，可能与肺癌组织取材有关，由于病灶为非均质性，病灶活检标本可能不携带K-ras突变基因，而循环血DNA可以来自肺癌原发灶，也可以来自转移灶；同时在本组研究中，有3例在肺癌组织中检出K-ras基因突变，但在外周血浆中未检出，可能是因为肺癌携带突变基因部分释放进入血的DNA少于肺癌组织或肺癌组织，如炎性组织释放进入外周血导致DNA稀释导致外周血浆中K-ras突变基因含量过低，扩增次数不足。
本研究采用新型的突变富集液相芯片技术进行肺癌组织及外周血标本的K-ras突变基因检测，相较于实时荧光定量PCR，无需提取样品mRNA, 避免了因mRNA不稳定导致检测结果准确度下降。突变富集液相芯片法灵敏度高，最低可检测出占野生型拷贝数0.1%的突变序列，血浆及各类的组织标本，包括手术切除的巨大肿瘤组织标本和临床常见的微小组织标本如支气管镜活检、胸膜活检、肺穿刺、胸水包埋等都可以满足检测K-ras基因突变的检测要求[16]。
综上所述，检测四川地区NSCLC患者K-ras基因突变发生率与其他地区报道虽不尽相同，但也证实了我国不同地区肺癌患者K-ras突变分布确实存在差异。采用外周血进行K-ras基因检测，标本容易获取，可多次重复检测。本研究表明，四川地区NSCLC患者外周血浆与肺癌组织中K-ras基因突变的检出率具有较好一致性，可以替代肺癌组织进行检测筛查，有利于实现个性化治疗，避免不必要的靶向治疗带来的负担。
