引用本文： 高亭, 蒋引娣, 刘小伟, 马玉娟, 何小鹏. 羟基红花黄色素A对Lewis肺癌移植瘤微血管密度及血管内皮生长因子mRNA表达的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(5): 461-464. doi: 10.7507/1671-6205.2016108 复制
肿瘤的生长及转移需要丰富的营养物质，血管生成在其中发挥了重要的作用，当阻断肿瘤的血液供应后肿瘤只能生长到2 mm大小[1]。羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是从红花中提取的一种查尔酮单体，研究显示HSYA能够抑制血管生成，且这种抑制作用与药物剂量有关[2-3]。目前关于HSYA抗肿瘤的研究报道甚少[4]。谢军平等[5]研究表明HSYA能抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长，并能降低小鼠Lewis肺癌移植瘤组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。本研究观察了HSYA对C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤微血管密度(microvessel density，MVD)的影响及VEGF mRNA表达的影响，进一步探讨HSYA对肿瘤血管作用的分子机制。
材料与方法
一 材料
1.细胞株与试验动物：小鼠Lewis肺癌细胞株购自于北京协和医科大学细胞库。C57BL/6雌性小鼠购自于湖南斯莱克达试验动物有限公司，体重18~20 g，周龄6~8周，共60只。
2.药物：HSYA标准品购自于上海顺勃生物工程技术有限公司，纯度≥98%；注射用环磷酰胺(CTX)购自于江苏恒瑞股份有限公司，200 g/支。
3.主要试剂：DMEM培养基、胎牛血清购自于美国Gibco公司，实时荧光定量PCR试剂盒购自于TAKARA公司，VEGF引物由武汉博士德生物有限公司合成。CD34鼠源单克隆抗体(一抗、抗人、小鼠、大鼠)购自于美国Santa Cruz公司。
二 方法
1.细胞培养、药物配置、造模：均参考谢军平等[5]的方法。
2.动物分组与给药：将60只接种有Lewis肺癌细胞C57/BL小鼠随机分为5组，每组12只，分别为对照组、环磷酰胺(CTX)组及HSYA不同剂量组，每组12只。参考谢军平等[5]的方法设定干预剂量。其中，肺癌细胞接种后第2 d开始，对照组小鼠腹腔注射生理盐水，每天2次；CTX组按25 mg/kg注射CTX，使用生理盐水稀释为2 g/L，隔天1次，每次0.2 mL；HSYA组分别按28 mg/L、56 mg/L、112 mg/L注射HSYA，每天接种1次。
3.肿瘤组织MVD计数：用药第22 d处死所有小鼠，剥离肿瘤组织并脱水包埋、切片，检测MVD。参考文献[6]的方法，通过CD34免疫组织化学染色的强弱判断MVD计数。具体方法为：当血管内皮细胞表现为棕褐色，并与周围结缔组织等分界清楚计为一个微血管；与周围组织结构不相连的血管分支结构也可以作为一个微血管。使用100倍光学显微镜，每张组织切片选择3个黄褐色着色最明显的部位，然后切换至400倍视野下，随机计数5个视野内微血管数目，取平均值进行分析。
4.实时荧光定量PCR检测：取28 mg/L HSYA组及对照组肿瘤组织各100 mg，加入1 mL Trizol进行匀浆。根据Trizol试剂说明书提取RNA，逆转录成cDNA后进行定量PCR检测。引物由武汉博士德生物有限公司合成，上游5′-CAGACCAAAGAAA GACAGAACAAAG-3′，下游5′-CTACAGGAATCCCA GAAACAACC-3′，产物为296个碱基对(bp)[6]。退火温度为57.1 ℃，使用LightCycler2.0记录扩增至阈值所需要的循环次数(Ct)，目标基因表达水平之间的差异通过各组内标基因所测CR值表示。反复检测3次，取PCR产物5 mL，用溴化乙锭和1.2%琼脂糖凝胶电泳染色，FluorChem凝胶成像系统进行DNA电泳条带拍照，对扩增结果进行抽样验证。
三 统计学处理
所有试验数据均采用x±s表示，采用SPSS 17.0软件分析，行ANOVA单因素方差分析，LSD比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 HSYA对小鼠Lewis肺癌移植瘤MVD的影响
观察移植瘤组织切片，黄褐色着染者为CD34标记的血管内皮细胞，可见肿瘤微血管内皮细胞被染成黄褐色。对照组可见较多的被染色的血管，且表现为条索状、空泡状及囊状；随着HSYA干预剂量的减低，被染色成黄褐色的血管逐渐减少，微血管发生萎缩、退化等表现；CTX组未见明显的微血管，血管明显萎缩、消退(图 1)。结果显示：28 mg/L、56 mg/L HSYA组与CTX组肿瘤组织中MVD分别为22.56±2.11、30.01±3.12、16.21±2.40，显著低于对照组的41.10±2.93以及112 mg/L HSYA组的37.66±3.04，差异有统计学意义，差异值分别为(χ2=3.16，P=0.007；χ2=2.82，P=0.010；χ2=4.58，P=0.000)及(χ2=2.45，P=0.016；χ2=1.98，P=0.038；χ2=3.82，P=0.001)；而112 mg/L HSYA组与对照组的MVD比较，差异无统计学意义(χ2=0.56，P=0.61)。
图1
Lewis肺癌移植瘤组织光学显微镜像(免疫组织化学染色×400)
a.对照组；b.112 mg/L HSYA组；c.56 mg/L HSYA组；d.28 mg/L HSYA组；e.CTX组。对照组可见较多的被染色的血管；随着HSYA干预剂量的减低，被染色成黄棕色的血管逐渐减少，微血管发生萎缩、退化等表现；CTX组未见明显的微血管
二 HSYA对Lewis肺癌移植瘤VEGF mRNA表达的影响
对照组与28 mg/L HSYA组肿瘤组织中均发现VEGF mRNA的表达，其扩增的产物大小为296 bp，与理论扩增片段大小一致(图 2)。28 mg/L HSYA组与对照组VEGF扩增荧光表达阈值所需循环Ct值比较，差异无统计学意义，但经过扩增后，28 mg/L HSYA组VEGF mRNA的表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表 1。
图2
肿瘤组织VEGF mRNA实时荧光定量PCR产物凝胶电泳图
1.DNA分子量标准；2.对照组；2.28 mg/L HSYA组
表1
28 mg/L HSYA组和对照组肿瘤组织总RNA中VEGF mRNA扩增的Ct、CR值(x±s)
讨论
既往对肿瘤的研究主要集中在肿瘤细胞本身，而忽略肿瘤间质部分的研究，然而所有的肿瘤都包括实质及间质组织两部分，二者相互作用，共同促进肿瘤的增长。血管是肿瘤间质的重要组成部分之一[7]。当肿瘤新生血管成熟后可直接为肿瘤细胞提供营养物质，促进其快速增殖，从而增加转移的风险，使得肿瘤治疗更加困难[8]。研究指出，肿瘤在生长过程中，当其直径超过1~2 mm时，此时如无新生血管生成，肿瘤将退化缩小，但当新生血管生成并长入后肿瘤的转移和侵袭能力大大加强[9]。肿瘤新生血管的生成为肿瘤的生长、转移及浸润提供了重要的营养条件[10]。通过抗肿瘤治疗能够是肿瘤血管退化，阻断肿瘤养分供应及氧气输送，可以达到治疗肿瘤的目的，许多通过抑制肿瘤新生血管形成的药物已在小鼠移植瘤模型中取得成功[11]。肿瘤血管生成是一个复杂的过程，VEGF是目前所知作用最强、特异性最高的促血管内皮增殖的调控因子，可增加血管通透性、促进纤维蛋白原外渗，导致肿瘤间质水肿，为肿瘤的转移提供条件，VEGF通过与血管内皮特异性抗体结合，具有极强的促血管生成作用，其几乎在人体所有的肿瘤及肿瘤细胞中皆有表达[12]。
Lewis肺癌移植瘤造模时间短及成功率高，是公认最具代表性的肺癌动物模型[13]，广泛应用于抑制肿瘤血管形成的研究。MVD是反映肿瘤微血管生成的定量指标之一，与肿瘤的生长、侵袭、转移及预后密切相关。CD34在反映微血管增生中具有较高的敏感性及特异性，因此常被应用于血管增生的评价中[6]。此外，CD34在大多数肿瘤实质细胞中几乎不被表达，而仅在肿瘤血管内皮细胞中表达，因此使用CD34抗体可以有选择性且清楚地识别血管内皮细胞[6, 14]。
红花具有通血活络、散瘀止痛的功效，HSYA作为红花发挥药理作用的中药成分之一，研究显示其具有抗氧化、增加机体免疫、抗感染、抗肿瘤等多种药理功效[15-17]，对心脑血管系统疾病具有良好的治疗效果[18]。张前等[2]通过研究发现HSYA能够有效抑制毛细血管生成，并与浓度具有相关性。Xi等[15]通过研究证实其对裸鼠人胃腺癌BGC-823移植瘤的血管生成有一定的抑制作用。谢军平等[5]研究表明，HSYA随浓度的不同对肺癌移植瘤中VEGF的表达具有不同的抑制作用，其中112 mg/L HSYA对Lewis肺癌移植瘤中VEGF表达的抑制作用较低，因此我们在此基础上主要对抑瘤效果较好的28 mg/L的HSYA进行研究。
研究结果显示CTX组肿瘤组织的MVD最低，表明CTX对血管生成的抑制作用最明显。这可能与CTX既可以杀伤肿瘤细胞，同时又可以抑制肿瘤血管生成的双重作用机制有关[19]。研究结果还显示，与对照组对比，28 mg/L HSYA对肿瘤MVD抑制效果最为显著，其差异有统计学意义，而112 mg/L HSYA组与对照组比较MVD略有降低，但其差异无统计学意义。这可能与112 mg/L的HSYA具有促进血管内皮细胞生长的作用[20]，进而加速肿瘤血管生成有关，而28 mg/L HSYA则表现为抑制血管内皮生长的作用，并随剂量的降低而逐渐增强[3]。实时荧光定量PCR检测结果也显示，28 mg/L HSYA组与对照组肿瘤组织VEGF扩增荧光表达阈值所需循环Ct值比较，差异没有统计学意义，但其VEGF mRNA的表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义。这表明28 mg/L的HSYA能够减少肿瘤组织分泌血管生长因子，减少肿瘤组织血管生成，这与Xi等[15]的研究相一致。
本研究存在一些不足。首先，在导致肿瘤微血管生成过程中，除了VEGF外还存在其他的血管生成刺激因子，如成纤维细胞生长因子等，HSYA是否同样可以抑制这些因子的表达仍需研究。其次，HYSA干预剂量设置较少。从目前的研究结果看，HYSA可能是一把“双刃剑”，112 mg/L的HSYA对移植瘤的MVD无明显影响，但28 mg/L的HSYA对移植瘤的MVD有显著的抑制作用，而最佳的抑制剂量也有待进一步分析。
肿瘤的生长及转移需要丰富的营养物质，血管生成在其中发挥了重要的作用，当阻断肿瘤的血液供应后肿瘤只能生长到2 mm大小[1]。羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是从红花中提取的一种查尔酮单体，研究显示HSYA能够抑制血管生成，且这种抑制作用与药物剂量有关[2-3]。目前关于HSYA抗肿瘤的研究报道甚少[4]。谢军平等[5]研究表明HSYA能抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长，并能降低小鼠Lewis肺癌移植瘤组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。本研究观察了HSYA对C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤微血管密度(microvessel density，MVD)的影响及VEGF mRNA表达的影响，进一步探讨HSYA对肿瘤血管作用的分子机制。
材料与方法
一 材料
1.细胞株与试验动物：小鼠Lewis肺癌细胞株购自于北京协和医科大学细胞库。C57BL/6雌性小鼠购自于湖南斯莱克达试验动物有限公司，体重18~20 g，周龄6~8周，共60只。
2.药物：HSYA标准品购自于上海顺勃生物工程技术有限公司，纯度≥98%；注射用环磷酰胺(CTX)购自于江苏恒瑞股份有限公司，200 g/支。
3.主要试剂：DMEM培养基、胎牛血清购自于美国Gibco公司，实时荧光定量PCR试剂盒购自于TAKARA公司，VEGF引物由武汉博士德生物有限公司合成。CD34鼠源单克隆抗体(一抗、抗人、小鼠、大鼠)购自于美国Santa Cruz公司。
二 方法
1.细胞培养、药物配置、造模：均参考谢军平等[5]的方法。
2.动物分组与给药：将60只接种有Lewis肺癌细胞C57/BL小鼠随机分为5组，每组12只，分别为对照组、环磷酰胺(CTX)组及HSYA不同剂量组，每组12只。参考谢军平等[5]的方法设定干预剂量。其中，肺癌细胞接种后第2 d开始，对照组小鼠腹腔注射生理盐水，每天2次；CTX组按25 mg/kg注射CTX，使用生理盐水稀释为2 g/L，隔天1次，每次0.2 mL；HSYA组分别按28 mg/L、56 mg/L、112 mg/L注射HSYA，每天接种1次。
3.肿瘤组织MVD计数：用药第22 d处死所有小鼠，剥离肿瘤组织并脱水包埋、切片，检测MVD。参考文献[6]的方法，通过CD34免疫组织化学染色的强弱判断MVD计数。具体方法为：当血管内皮细胞表现为棕褐色，并与周围结缔组织等分界清楚计为一个微血管；与周围组织结构不相连的血管分支结构也可以作为一个微血管。使用100倍光学显微镜，每张组织切片选择3个黄褐色着色最明显的部位，然后切换至400倍视野下，随机计数5个视野内微血管数目，取平均值进行分析。
4.实时荧光定量PCR检测：取28 mg/L HSYA组及对照组肿瘤组织各100 mg，加入1 mL Trizol进行匀浆。根据Trizol试剂说明书提取RNA，逆转录成cDNA后进行定量PCR检测。引物由武汉博士德生物有限公司合成，上游5′-CAGACCAAAGAAA GACAGAACAAAG-3′，下游5′-CTACAGGAATCCCA GAAACAACC-3′，产物为296个碱基对(bp)[6]。退火温度为57.1 ℃，使用LightCycler2.0记录扩增至阈值所需要的循环次数(Ct)，目标基因表达水平之间的差异通过各组内标基因所测CR值表示。反复检测3次，取PCR产物5 mL，用溴化乙锭和1.2%琼脂糖凝胶电泳染色，FluorChem凝胶成像系统进行DNA电泳条带拍照，对扩增结果进行抽样验证。
三 统计学处理
所有试验数据均采用x±s表示，采用SPSS 17.0软件分析，行ANOVA单因素方差分析，LSD比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 HSYA对小鼠Lewis肺癌移植瘤MVD的影响
观察移植瘤组织切片，黄褐色着染者为CD34标记的血管内皮细胞，可见肿瘤微血管内皮细胞被染成黄褐色。对照组可见较多的被染色的血管，且表现为条索状、空泡状及囊状；随着HSYA干预剂量的减低，被染色成黄褐色的血管逐渐减少，微血管发生萎缩、退化等表现；CTX组未见明显的微血管，血管明显萎缩、消退(图 1)。结果显示：28 mg/L、56 mg/L HSYA组与CTX组肿瘤组织中MVD分别为22.56±2.11、30.01±3.12、16.21±2.40，显著低于对照组的41.10±2.93以及112 mg/L HSYA组的37.66±3.04，差异有统计学意义，差异值分别为(χ2=3.16，P=0.007；χ2=2.82，P=0.010；χ2=4.58，P=0.000)及(χ2=2.45，P=0.016；χ2=1.98，P=0.038；χ2=3.82，P=0.001)；而112 mg/L HSYA组与对照组的MVD比较，差异无统计学意义(χ2=0.56，P=0.61)。
图1
Lewis肺癌移植瘤组织光学显微镜像(免疫组织化学染色×400)
a.对照组；b.112 mg/L HSYA组；c.56 mg/L HSYA组；d.28 mg/L HSYA组；e.CTX组。对照组可见较多的被染色的血管；随着HSYA干预剂量的减低，被染色成黄棕色的血管逐渐减少，微血管发生萎缩、退化等表现；CTX组未见明显的微血管
二 HSYA对Lewis肺癌移植瘤VEGF mRNA表达的影响
对照组与28 mg/L HSYA组肿瘤组织中均发现VEGF mRNA的表达，其扩增的产物大小为296 bp，与理论扩增片段大小一致(图 2)。28 mg/L HSYA组与对照组VEGF扩增荧光表达阈值所需循环Ct值比较，差异无统计学意义，但经过扩增后，28 mg/L HSYA组VEGF mRNA的表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表 1。
图2
肿瘤组织VEGF mRNA实时荧光定量PCR产物凝胶电泳图
1.DNA分子量标准；2.对照组；2.28 mg/L HSYA组
表1
28 mg/L HSYA组和对照组肿瘤组织总RNA中VEGF mRNA扩增的Ct、CR值(x±s)
讨论
既往对肿瘤的研究主要集中在肿瘤细胞本身，而忽略肿瘤间质部分的研究，然而所有的肿瘤都包括实质及间质组织两部分，二者相互作用，共同促进肿瘤的增长。血管是肿瘤间质的重要组成部分之一[7]。当肿瘤新生血管成熟后可直接为肿瘤细胞提供营养物质，促进其快速增殖，从而增加转移的风险，使得肿瘤治疗更加困难[8]。研究指出，肿瘤在生长过程中，当其直径超过1~2 mm时，此时如无新生血管生成，肿瘤将退化缩小，但当新生血管生成并长入后肿瘤的转移和侵袭能力大大加强[9]。肿瘤新生血管的生成为肿瘤的生长、转移及浸润提供了重要的营养条件[10]。通过抗肿瘤治疗能够是肿瘤血管退化，阻断肿瘤养分供应及氧气输送，可以达到治疗肿瘤的目的，许多通过抑制肿瘤新生血管形成的药物已在小鼠移植瘤模型中取得成功[11]。肿瘤血管生成是一个复杂的过程，VEGF是目前所知作用最强、特异性最高的促血管内皮增殖的调控因子，可增加血管通透性、促进纤维蛋白原外渗，导致肿瘤间质水肿，为肿瘤的转移提供条件，VEGF通过与血管内皮特异性抗体结合，具有极强的促血管生成作用，其几乎在人体所有的肿瘤及肿瘤细胞中皆有表达[12]。
Lewis肺癌移植瘤造模时间短及成功率高，是公认最具代表性的肺癌动物模型[13]，广泛应用于抑制肿瘤血管形成的研究。MVD是反映肿瘤微血管生成的定量指标之一，与肿瘤的生长、侵袭、转移及预后密切相关。CD34在反映微血管增生中具有较高的敏感性及特异性，因此常被应用于血管增生的评价中[6]。此外，CD34在大多数肿瘤实质细胞中几乎不被表达，而仅在肿瘤血管内皮细胞中表达，因此使用CD34抗体可以有选择性且清楚地识别血管内皮细胞[6, 14]。
红花具有通血活络、散瘀止痛的功效，HSYA作为红花发挥药理作用的中药成分之一，研究显示其具有抗氧化、增加机体免疫、抗感染、抗肿瘤等多种药理功效[15-17]，对心脑血管系统疾病具有良好的治疗效果[18]。张前等[2]通过研究发现HSYA能够有效抑制毛细血管生成，并与浓度具有相关性。Xi等[15]通过研究证实其对裸鼠人胃腺癌BGC-823移植瘤的血管生成有一定的抑制作用。谢军平等[5]研究表明，HSYA随浓度的不同对肺癌移植瘤中VEGF的表达具有不同的抑制作用，其中112 mg/L HSYA对Lewis肺癌移植瘤中VEGF表达的抑制作用较低，因此我们在此基础上主要对抑瘤效果较好的28 mg/L的HSYA进行研究。
研究结果显示CTX组肿瘤组织的MVD最低，表明CTX对血管生成的抑制作用最明显。这可能与CTX既可以杀伤肿瘤细胞，同时又可以抑制肿瘤血管生成的双重作用机制有关[19]。研究结果还显示，与对照组对比，28 mg/L HSYA对肿瘤MVD抑制效果最为显著，其差异有统计学意义，而112 mg/L HSYA组与对照组比较MVD略有降低，但其差异无统计学意义。这可能与112 mg/L的HSYA具有促进血管内皮细胞生长的作用[20]，进而加速肿瘤血管生成有关，而28 mg/L HSYA则表现为抑制血管内皮生长的作用，并随剂量的降低而逐渐增强[3]。实时荧光定量PCR检测结果也显示，28 mg/L HSYA组与对照组肿瘤组织VEGF扩增荧光表达阈值所需循环Ct值比较，差异没有统计学意义，但其VEGF mRNA的表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义。这表明28 mg/L的HSYA能够减少肿瘤组织分泌血管生长因子，减少肿瘤组织血管生成，这与Xi等[15]的研究相一致。
本研究存在一些不足。首先，在导致肿瘤微血管生成过程中，除了VEGF外还存在其他的血管生成刺激因子，如成纤维细胞生长因子等，HSYA是否同样可以抑制这些因子的表达仍需研究。其次，HYSA干预剂量设置较少。从目前的研究结果看，HYSA可能是一把“双刃剑”，112 mg/L的HSYA对移植瘤的MVD无明显影响，但28 mg/L的HSYA对移植瘤的MVD有显著的抑制作用，而最佳的抑制剂量也有待进一步分析。
