引用本文： 索良源, 于泓波, 张锦. M3受体亚型介导内毒素诱导兔离体肺动脉舒张反应的研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(5): 506-510. doi: 10.7507/1671-6205.2016116 复制
内毒素休克(endotoxic shock, ES)的发生、发展是一个连续演变和复杂的过程，虽然目前对其发病机制的研究已深入到细胞、亚微结构和分子水平，但还未能充分阐明其发病特点与具体机制[1]。而血管反应性改变是内毒素休克的主要病理特征。其中, 肺动脉高压的形成是ES急性肺损伤的早期表现，也是引起死亡的重要原因之一[2]。因此, 探讨防治ES时肺动脉高压的形成及其作用机制已成为该领域重要的研究课题。Attinà等[3]的研究发现M毒蕈碱受体亚型M3介导了肺动脉对乙酰胆碱(ACH)舒张反应。而在内毒素作用下肺动脉的内皮依赖性的肺动脉舒张反应减低[4-5]。而ACH通路是血管张力调节的一条重要通路。但在感染性休克时，肺动脉高压是否是由肺动脉内皮的M3受体内在活性降低使M3受体介导的舒张反应降低所造成的，并没有得到证实。本研究通过观察感染性休克时M3受体活性的改变探讨感染性休克肺动脉血管反应性改变的机制，以解释感染性休克时肺动脉高压的形成机制, 并为临床感染性休克的治疗提供依据。
材料及方法
一 材料
健康成年雄性新西兰大耳白兔，体重2.0~2.5 kg，由中国医科大学盛京医院动物试验室提供。大肠杆菌内毒素E. coli脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美国Sigma公司，型号L2880，用生理盐水稀释成浓度为10%的溶液，-20 ℃保存)；达非那新(美国Sigma公司)；去氧肾上腺素(PE，深圳沃兰德有限公司)；ACH(Sigma公司)；KRB液；RPMI-1640培养液(美国，Gibco公司)；器材：血管环仪器、恒温水浴锅(成都仪器厂), 张力换能器及生理记录仪(Power Lab 4/25T;澳大利亚，ADI公司)。
二 方法
1. 离体肺血管环的制备：试验前动物禁食12 h，将动物放入密闭的1 L容器中用异氟醚以1 mL/kg麻醉后快速行心肺联合取出术，置于4 ℃改良Krebs-Ringer bicarbonate (KRB)液中，分离左肺和右下肺。小心分离肺动脉[二级，内径(ID)1~2 mm]，将血管周围组织清理干净，切成3 mm长的血管环，避免损伤血管内皮。
2. 试验分组:将血管各分为两组正常组(N组，n=45)和内毒素组(L组，n=48)，正常组血管环用RPMI-1640培养液孵育4 h，内毒素组在培养液中加入内毒素4 μg/mL孵育4 h，观察血管张力的变化，张力结果用kg tension/g dw表示，然后分别用达非那新终浓度为100、10、1、0.1和0.01 μmol/L孵育30 min，观察血管张力的变化。注意在培养液中通入95%O2和5%CO2，并保持温度在37 ℃。
3. 血管张力的检测:将预处理的血管环垂直悬挂于两个不锈钢环上，置于含有5 mL KRB (37 ℃)的恒温浴槽中，通入95% O2和5% CO2。一端固定，另一端连上张力换能器。调节血管环张力，从0 g开始，每隔5 min使张力增加0.5 g，直至最适张力1.5 g, 平衡90 min，期间每10 min换一次液，记录平衡后的张力值。检测血管活性，加入终浓度为1 μmol/L的PE，收缩幅度小于300 mg者弃去。待收缩反应曲线至平台后加入终浓度为10 μmol/L ACH, 以检测内皮细胞的完整性，若出现60%以上的舒张反应为内皮细胞完整。用KRB液反复洗脱3~5次，至回到基础张力，平衡30 min。对照组加入生理盐水孵育30 min, 其他组分别加入达非那新终浓度为100、10、1、0.1和0.01 μmol/L孵育30 min，然后用PE 1 μmol/L预收缩血管环，记录预收缩值PEAX, 收缩达平台后加入ACH浓度1、10和100 μmol/L，记录ACH累计浓度血管张力变化。内毒素组进行相同的试验观察血管张力的变化。舒张反应结果用占PE(1 μmol/L)收缩值的百分比表示。
三 统计学处理
运用SPSS软件13.0对肺动脉血管环舒张百分比做出分析。数据以x±s表示，组间比较独立样本t检验，组内比较用方差分析。P＜0.05为有统计学差异。
结果
一 两组血管对ACH舒张反应比较
正常组肺动脉对ACH累计曲线的舒张百分比分别为(0.095±0.034)%，(0.150±0.036)%，(0.445±0.090)%，用内毒素(LPS 4 μg/mL，4 h)处理后分别为(0.044±0.016)%, (0.093±0.029)%, (0.311±0.028)%。内毒素孵育降低了肺动脉对ACH的舒张反应，并且M3受体亚型介导了此舒张反应。结果见表 1。
表1
两组血管对ACH舒张反应百分比的比较(%，n=8, x±s)
二 不同浓度ACH的EC50值
M3受体阻断剂达非那新对不同浓度ACH(1、10和100 μmol/L)反应, 得出的EC50值，正常组为1.483、2.757和2.958，内毒素组为6.015、6.242和6.411。从结果得出相同浓度的ACH内毒素组的EC50值要明显大于正常组。这说明内毒素组M3受体所介导的舒张反应与正常组相比明显降低。结果见表 2。
表2
不同浓度ACH的EC50值
三 不同浓度ACH时M3受体的内在活性a值
M3受体阻断剂达非那新对不同浓度的ACH反应，得出的内在活性a值分别为正常组0.014 6、0.032 3和0.082 5，内毒素组0.012 4、0.024 5和0.055 6。结果见表 3。达非那新浓度取对数绘制的量效曲线图见图 1，从量效曲线可以看出在相同浓度ACH时，内毒素组的最大效能Emax均减低。说明内毒素降低了M3受体内在活性从而使ACH(1、10和100 μmol/L)对肺动脉的舒张反应降低。根据Lineweaver-Burk作图法(图 2)用最小二乘法求得方程直线：NACH1：y=-12.206x+ 68.35;NACH10: y=-4.903 7x+30.595; NACH100: y=-2.181 5x+ 12.119;LACH1:y=-12.167x+80.695;LACH10:y=-6.341 9x+40.759;LACH100:y=-3.329 9x+17.998。从图中可以看出内毒素组在ACH(1、10和100 μmol/L)对肺动脉的舒张反应均低于正常组。这也证实了图 1和表 3中得到的结果。
表3
不同浓度ACH时M3受体的a值
图1
不同浓度达非那新绘制的量效曲线图
图2
Lineweaver-Burk作图法
四 不同浓度的达非那新的直线回归图
从达非那新的量效曲线上可以发现达非那新10、1和0.1 μmol/L位于量效曲线较陡的部分，对这三个剂量进行直线回归作图(图 3)，分别求得相应的斜率为：Knach1=-0.024 4；Knach10=-0.034 8; Knach100=-0.107 7; Klach1=-0.008 8, Klach10=-0.027 5; Klach100=-0.085 5。斜率的绝对值可以体现出达非那新的效能，从结果中可以看出相同浓度的ACH的斜率内毒素组均小于正常组，表明在内毒素组达非那新(M3受体)拮抗剂的效能小于正常组。这也进一步说明内毒素组M3受体内在活性低于正常组。
图3
不同浓度达非那新的直线回归图
讨论
感染性休克在临床上主要表现为体循环阻力下降，肺循环阻力增高。肺脏是最易受累的器官，休克时表现为高压、高阻[6-7]。感染性休克诱发急性肺损伤的发病机制复杂且尚未完全明确，探讨其可能的发病机制有利于寻求有效的治疗措施[8]。感染性休克后肺动脉内皮细胞结构受到破坏，内皮依赖性舒张反应受到抑制[2]，内毒素损伤血管内皮细胞后，抑制iNOS的表达，引起内皮源性NO的减少，使血管收缩性增强[9]。从而导致了肺动脉高压。已有研究证实，在ACH诱发的血管调节机制中，当ACH作用于血管平滑肌上的M受体时产生收缩反应，当ACH作用于血管内皮上的M受体时，则产生内皮源性血管舒张因子NO, 从而使血管舒张[10]。内毒素休克后，ACH大量释放，但内皮细胞中的M受体数量减少，影响NO的生成，ACH对肺血管内皮依赖性舒张抑制；同时，内毒素致肺血管平滑肌上M受体密度上调，ACH转而通过直接刺激血管平滑肌上的M受体产生血管收缩作用，使肺循环阻力的增高[11]。毒蕈碱型乙酰胆碱受体家族是由五个(M1-M5)亚型组成。存在于大多数血管床中，毒蕈碱受体激活通过血管内皮细胞释放血管扩张剂导致血管舒张[12]。Attinà等[3]的研究发现M3受体亚型介导了肺动脉对ACH的舒张反应。佟冬怡等[10]在兔肺动脉离体试验中发现，应用大剂量长托宁能逆转内毒素休克兔肺动脉对ACH的舒张反应的降低。长托宁是一种新型抗胆碱能药物，其选择性阻断M1、M3受体。所以感染性休克时肺动脉高压有可能是由于内毒素造成肺动脉内皮的M3受体内在活性降低从而使M3受体介导的舒张反应降低造成的。本研究通过观察感染性休克时M3受体活性的改变探讨感染性休克肺动脉血管反应性改变的机制，以解释感染性休克时肺动脉高压的形成机制, 并为临床感染性休克的治疗提供依据。
本研究结果显示，内毒素减弱了肺动脉对ACH的舒张反应，而对PE的收缩反应没有影响，这表明我们的内毒素孵育模型是成功的。从表 1可以知道，内毒素使肺动脉对ACH的舒张反应显著降低，在加入M3受体特异性阻断剂达非那新(100、10、1和0.1 μmol/L)后正常组和内毒素组肺动脉对ACH的舒张反应均降低，表明M3受体亚型介导了内毒素使ACH舒张反应的降低。但从图 1结果可知，相同浓度的ACH下对内毒素组产生的舒张反应低于正常组。并且从图 2和图 3还可以知道，在内毒素的作用下M3受体的亲和力明显降低。根据达非那新对不同浓度ACH(1、10和100 μmol/L)反应得出的EC50值，从EC50值得知相同浓度的ACH下内毒素组的EC50值要明显大于正常组。这说明内毒素组M3受体亲和力与正常组相比明显降低。而造成亲和力变化主要有两方面原因：一方面是受体的数量发生了变化，一方面是受体的内在活性发生了变化。M3受体是一种蛋白质，其合成需要一定时间，本试验中内毒素仅仅作用了4 h，所以数量上的变化可能性极小。从表 3可以发现，M3受体在内毒素作用下其内在活性a值显著降低。因此推断内毒素可以使M3受体的内在活性显著降低，从而引起肺动脉在内毒素作用下ACH反应的降低并导致肺动脉高压。
综上所述，M3受体亚型介导了内毒素时肺动脉舒张反应减低，并且内毒素使M3受体亚型内在活性的减低可能是肺动脉舒张反应降低的作用机制之一。感染性休克时肺动脉高压其机制与M3受体活性改变使肺动脉舒张反应降低有关。
内毒素休克(endotoxic shock, ES)的发生、发展是一个连续演变和复杂的过程，虽然目前对其发病机制的研究已深入到细胞、亚微结构和分子水平，但还未能充分阐明其发病特点与具体机制[1]。而血管反应性改变是内毒素休克的主要病理特征。其中, 肺动脉高压的形成是ES急性肺损伤的早期表现，也是引起死亡的重要原因之一[2]。因此, 探讨防治ES时肺动脉高压的形成及其作用机制已成为该领域重要的研究课题。Attinà等[3]的研究发现M毒蕈碱受体亚型M3介导了肺动脉对乙酰胆碱(ACH)舒张反应。而在内毒素作用下肺动脉的内皮依赖性的肺动脉舒张反应减低[4-5]。而ACH通路是血管张力调节的一条重要通路。但在感染性休克时，肺动脉高压是否是由肺动脉内皮的M3受体内在活性降低使M3受体介导的舒张反应降低所造成的，并没有得到证实。本研究通过观察感染性休克时M3受体活性的改变探讨感染性休克肺动脉血管反应性改变的机制，以解释感染性休克时肺动脉高压的形成机制, 并为临床感染性休克的治疗提供依据。
材料及方法
一 材料
健康成年雄性新西兰大耳白兔，体重2.0~2.5 kg，由中国医科大学盛京医院动物试验室提供。大肠杆菌内毒素E. coli脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美国Sigma公司，型号L2880，用生理盐水稀释成浓度为10%的溶液，-20 ℃保存)；达非那新(美国Sigma公司)；去氧肾上腺素(PE，深圳沃兰德有限公司)；ACH(Sigma公司)；KRB液；RPMI-1640培养液(美国，Gibco公司)；器材：血管环仪器、恒温水浴锅(成都仪器厂), 张力换能器及生理记录仪(Power Lab 4/25T;澳大利亚，ADI公司)。
二 方法
1. 离体肺血管环的制备：试验前动物禁食12 h，将动物放入密闭的1 L容器中用异氟醚以1 mL/kg麻醉后快速行心肺联合取出术，置于4 ℃改良Krebs-Ringer bicarbonate (KRB)液中，分离左肺和右下肺。小心分离肺动脉[二级，内径(ID)1~2 mm]，将血管周围组织清理干净，切成3 mm长的血管环，避免损伤血管内皮。
2. 试验分组:将血管各分为两组正常组(N组，n=45)和内毒素组(L组，n=48)，正常组血管环用RPMI-1640培养液孵育4 h，内毒素组在培养液中加入内毒素4 μg/mL孵育4 h，观察血管张力的变化，张力结果用kg tension/g dw表示，然后分别用达非那新终浓度为100、10、1、0.1和0.01 μmol/L孵育30 min，观察血管张力的变化。注意在培养液中通入95%O2和5%CO2，并保持温度在37 ℃。
3. 血管张力的检测:将预处理的血管环垂直悬挂于两个不锈钢环上，置于含有5 mL KRB (37 ℃)的恒温浴槽中，通入95% O2和5% CO2。一端固定，另一端连上张力换能器。调节血管环张力，从0 g开始，每隔5 min使张力增加0.5 g，直至最适张力1.5 g, 平衡90 min，期间每10 min换一次液，记录平衡后的张力值。检测血管活性，加入终浓度为1 μmol/L的PE，收缩幅度小于300 mg者弃去。待收缩反应曲线至平台后加入终浓度为10 μmol/L ACH, 以检测内皮细胞的完整性，若出现60%以上的舒张反应为内皮细胞完整。用KRB液反复洗脱3~5次，至回到基础张力，平衡30 min。对照组加入生理盐水孵育30 min, 其他组分别加入达非那新终浓度为100、10、1、0.1和0.01 μmol/L孵育30 min，然后用PE 1 μmol/L预收缩血管环，记录预收缩值PEAX, 收缩达平台后加入ACH浓度1、10和100 μmol/L，记录ACH累计浓度血管张力变化。内毒素组进行相同的试验观察血管张力的变化。舒张反应结果用占PE(1 μmol/L)收缩值的百分比表示。
三 统计学处理
运用SPSS软件13.0对肺动脉血管环舒张百分比做出分析。数据以x±s表示，组间比较独立样本t检验，组内比较用方差分析。P＜0.05为有统计学差异。
结果
一 两组血管对ACH舒张反应比较
正常组肺动脉对ACH累计曲线的舒张百分比分别为(0.095±0.034)%，(0.150±0.036)%，(0.445±0.090)%，用内毒素(LPS 4 μg/mL，4 h)处理后分别为(0.044±0.016)%, (0.093±0.029)%, (0.311±0.028)%。内毒素孵育降低了肺动脉对ACH的舒张反应，并且M3受体亚型介导了此舒张反应。结果见表 1。
表1
两组血管对ACH舒张反应百分比的比较(%，n=8, x±s)
二 不同浓度ACH的EC50值
M3受体阻断剂达非那新对不同浓度ACH(1、10和100 μmol/L)反应, 得出的EC50值，正常组为1.483、2.757和2.958，内毒素组为6.015、6.242和6.411。从结果得出相同浓度的ACH内毒素组的EC50值要明显大于正常组。这说明内毒素组M3受体所介导的舒张反应与正常组相比明显降低。结果见表 2。
表2
不同浓度ACH的EC50值
三 不同浓度ACH时M3受体的内在活性a值
M3受体阻断剂达非那新对不同浓度的ACH反应，得出的内在活性a值分别为正常组0.014 6、0.032 3和0.082 5，内毒素组0.012 4、0.024 5和0.055 6。结果见表 3。达非那新浓度取对数绘制的量效曲线图见图 1，从量效曲线可以看出在相同浓度ACH时，内毒素组的最大效能Emax均减低。说明内毒素降低了M3受体内在活性从而使ACH(1、10和100 μmol/L)对肺动脉的舒张反应降低。根据Lineweaver-Burk作图法(图 2)用最小二乘法求得方程直线：NACH1：y=-12.206x+ 68.35;NACH10: y=-4.903 7x+30.595; NACH100: y=-2.181 5x+ 12.119;LACH1:y=-12.167x+80.695;LACH10:y=-6.341 9x+40.759;LACH100:y=-3.329 9x+17.998。从图中可以看出内毒素组在ACH(1、10和100 μmol/L)对肺动脉的舒张反应均低于正常组。这也证实了图 1和表 3中得到的结果。
表3
不同浓度ACH时M3受体的a值
图1
不同浓度达非那新绘制的量效曲线图
图2
Lineweaver-Burk作图法
四 不同浓度的达非那新的直线回归图
从达非那新的量效曲线上可以发现达非那新10、1和0.1 μmol/L位于量效曲线较陡的部分，对这三个剂量进行直线回归作图(图 3)，分别求得相应的斜率为：Knach1=-0.024 4；Knach10=-0.034 8; Knach100=-0.107 7; Klach1=-0.008 8, Klach10=-0.027 5; Klach100=-0.085 5。斜率的绝对值可以体现出达非那新的效能，从结果中可以看出相同浓度的ACH的斜率内毒素组均小于正常组，表明在内毒素组达非那新(M3受体)拮抗剂的效能小于正常组。这也进一步说明内毒素组M3受体内在活性低于正常组。
图3
不同浓度达非那新的直线回归图
讨论
感染性休克在临床上主要表现为体循环阻力下降，肺循环阻力增高。肺脏是最易受累的器官，休克时表现为高压、高阻[6-7]。感染性休克诱发急性肺损伤的发病机制复杂且尚未完全明确，探讨其可能的发病机制有利于寻求有效的治疗措施[8]。感染性休克后肺动脉内皮细胞结构受到破坏，内皮依赖性舒张反应受到抑制[2]，内毒素损伤血管内皮细胞后，抑制iNOS的表达，引起内皮源性NO的减少，使血管收缩性增强[9]。从而导致了肺动脉高压。已有研究证实，在ACH诱发的血管调节机制中，当ACH作用于血管平滑肌上的M受体时产生收缩反应，当ACH作用于血管内皮上的M受体时，则产生内皮源性血管舒张因子NO, 从而使血管舒张[10]。内毒素休克后，ACH大量释放，但内皮细胞中的M受体数量减少，影响NO的生成，ACH对肺血管内皮依赖性舒张抑制；同时，内毒素致肺血管平滑肌上M受体密度上调，ACH转而通过直接刺激血管平滑肌上的M受体产生血管收缩作用，使肺循环阻力的增高[11]。毒蕈碱型乙酰胆碱受体家族是由五个(M1-M5)亚型组成。存在于大多数血管床中，毒蕈碱受体激活通过血管内皮细胞释放血管扩张剂导致血管舒张[12]。Attinà等[3]的研究发现M3受体亚型介导了肺动脉对ACH的舒张反应。佟冬怡等[10]在兔肺动脉离体试验中发现，应用大剂量长托宁能逆转内毒素休克兔肺动脉对ACH的舒张反应的降低。长托宁是一种新型抗胆碱能药物，其选择性阻断M1、M3受体。所以感染性休克时肺动脉高压有可能是由于内毒素造成肺动脉内皮的M3受体内在活性降低从而使M3受体介导的舒张反应降低造成的。本研究通过观察感染性休克时M3受体活性的改变探讨感染性休克肺动脉血管反应性改变的机制，以解释感染性休克时肺动脉高压的形成机制, 并为临床感染性休克的治疗提供依据。
本研究结果显示，内毒素减弱了肺动脉对ACH的舒张反应，而对PE的收缩反应没有影响，这表明我们的内毒素孵育模型是成功的。从表 1可以知道，内毒素使肺动脉对ACH的舒张反应显著降低，在加入M3受体特异性阻断剂达非那新(100、10、1和0.1 μmol/L)后正常组和内毒素组肺动脉对ACH的舒张反应均降低，表明M3受体亚型介导了内毒素使ACH舒张反应的降低。但从图 1结果可知，相同浓度的ACH下对内毒素组产生的舒张反应低于正常组。并且从图 2和图 3还可以知道，在内毒素的作用下M3受体的亲和力明显降低。根据达非那新对不同浓度ACH(1、10和100 μmol/L)反应得出的EC50值，从EC50值得知相同浓度的ACH下内毒素组的EC50值要明显大于正常组。这说明内毒素组M3受体亲和力与正常组相比明显降低。而造成亲和力变化主要有两方面原因：一方面是受体的数量发生了变化，一方面是受体的内在活性发生了变化。M3受体是一种蛋白质，其合成需要一定时间，本试验中内毒素仅仅作用了4 h，所以数量上的变化可能性极小。从表 3可以发现，M3受体在内毒素作用下其内在活性a值显著降低。因此推断内毒素可以使M3受体的内在活性显著降低，从而引起肺动脉在内毒素作用下ACH反应的降低并导致肺动脉高压。
综上所述，M3受体亚型介导了内毒素时肺动脉舒张反应减低，并且内毒素使M3受体亚型内在活性的减低可能是肺动脉舒张反应降低的作用机制之一。感染性休克时肺动脉高压其机制与M3受体活性改变使肺动脉舒张反应降低有关。
