引用本文： 李三, 朱黎明, 戴爱国. 中性粒细胞哮喘动物模型建立的研究进展. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(5): 529-533. doi: 10.7507/1671-6205.2016122 复制
支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞和细胞组分参与的慢性炎症性疾病。既往认为嗜酸粒细胞(eosinophil，EOS)为哮喘的主要炎症细胞。近年来，大量研究证实中性粒细胞(neutrophil，NEU)在哮喘的发生、发展中起着重要作用。Douwes等[1]发现约50%的哮喘是由NEU引起，且NEU与重症哮喘[2]、迟发型哮喘[3]、激素不敏感型哮喘[4]等密切相关。2006年Simpson等[5]将诱导痰中中性粒细胞百分比(NEU%)＞61%的哮喘患者列为哮喘的一个独立的亚型——中性粒细胞哮喘(neutrophilic asthma，NA)。NA以其高发病率和难控性而受到广泛关注，其病因、发病机制、新药研发和评价、预防及治疗均为目前研究的热点，而这一切均需要成熟可靠的NA实验动物模型为载体。本文综述了NA实验动物模型的常用动物、造模方法及检测指标，并对其未来的研究前景进行展望。
一 常用于制作NA实验动物模型的动物
与人类完全相同的动物自发性哮喘模型目前还未发现，往往需要人工加以复制，尽量做到与人类NA相似。目前常用于制作NA模型的动物为小鼠、豚鼠和大鼠。
1. 小鼠：价廉易得，遗传背景明确，便于探讨哮喘气道炎症反应及气道高反应性(airway hyperreactivity，AHR)产生的免疫遗传机制，目前小鼠已成为国内外用来构建哮喘模型最常用的动物，尤其是BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠。小鼠因品系不同而对致敏原的反应有差异，BALB/c小鼠对致敏原较易产生AHR，而C57BL/6小鼠则不易产生AHR[6]。Hayashi等[7]发现小鼠性别对实验研究也存在影响，在鸡卵清蛋白(ovalbumin，OVA)诱发成熟雌/雄性BALB/c小鼠的迟发性气道炎症中，雌性小鼠气道炎症细胞浸润的程度比雄性小鼠严重，且其支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎症细胞数也较雄性多，所以常选择雌性小鼠用于NA实验研究。
2. 豚鼠：豚鼠是所有实验动物中补体含量最多的一种，已广泛用于迟发型和速发型变态反应的研究，是国内外用于模拟人类哮喘生理学异常常用的动物。豚鼠迟发型变态反应与人相似，采用2~3个月龄或350~400g的豚鼠作迟发型反应研究最合适。不同花色的豚鼠体内免疫球蛋白的含量不同，例如白化豚鼠产生免疫球蛋白的能力较弱，对生活环境中的抗原刺激免疫应答能力显著低于花色豚鼠[8]。
3. 大鼠：价廉易养，繁殖力强，生物学试剂种类多且易获得，标本采集量相对较充足，对抗原的反应性较为一致，大鼠基因组与人类的基因组序列比较相似。目前我国最常用于哮喘研究的大鼠有SD大鼠和Wistar大鼠，国外多用Brown Norway大鼠。其中，SD大鼠较Wistar大鼠对呼吸道疾病的抵抗力更强。
二 变应原诱发的NA动物模型
目前用于复制NA模型的变应原主要有OVA、豚草(ragweed，RW)、对甲苯二异氰酸酯(toluene di-isocyanate，TDI)、尘螨(house dust mites，HDM)等。
1. 基于OVA诱发的NA模型：迄今为止，OVA是制备哮喘动物模型最常用的致敏原，有单纯OVA和复合OVA(含佐剂)两种，以复合OVA较常用。除了致敏原以外，细菌内毒素(LPS)[9]、环境污染[10]、香烟烟雾[11]、支原体感染[12]等许多非过敏性因素也可导致哮喘患者或小鼠气道NEU增多，活性增强，并与AHR有关，因此通常采用OVA联合非过敏因素建NA实验动物模型。
(1) OVA和弗氏完全佐剂(complete Freund’S adjuvant，CFA)诱导的NA动物模型：许多研究证实NA与Th1/Th17抗原特异性反应有关，Th1/Th17细胞主要通过释放的细胞因子如白细胞介素(interleukin, IL-17)等发挥作用，参与诱导气道NEU的募集和加重AHR[13]。而CFA是一种强有力的诱导CD4+ T细胞向Th1/Th17细胞分化的佐剂，是目前最常用于动物实验的佐剂。Bogaert等[14]将OVA联合CFA致敏和OVA激发成功建立了NA动物模型。此模型表现出明显的气道NEU炎症，但是研究者没有进一步检测哮喘小鼠的AHR。Dejager等[15]用同样的方法成功复制NA模型，BALF中NEU%达59%，出现明显的AHR，补充了前者的不足，也证明了此方法具有良好的重复性。我们实验室曾用类似的方法成功建立豚鼠NA模型，弥补了小鼠NA模型取材困难、标本量少等不足，可以满足对标本量需求大的研究的要求，但是气道NEU浸润不及小鼠模型明显[16]。说明用OVA联合CFA致敏、激发的方法在不同鼠种之间有一定的差异性。
(2) OVA和脂多糖(LPS)诱发的NA模型：LPS是一种常用的佐剂，它是革兰阴性杆菌细胞壁的共同成分，它可通过激活多条信号通路，高效诱导细胞因子合成与释放，激发炎症反应，加重AHR[17]，也可以诱导NEU、EOS的募集，从而加重哮喘[9]，因此LPS常用于复制NA动物模型。Bergquist等[18]用BALB/c雌性小鼠腹腔注射10 μg OVA致敏，雾化吸入1%OVA+LPS+PBS混合气溶胶激发，成功复制NA实验动物模型，并从蛋白质组学分析EA与NA的不同，进一步确定了此模型符合NA。
我国多位学者采用OVA联合LPS致敏3次、雾化吸入OVA连续2周激发的方法均成功建立小鼠NA模型[19-20]。此小鼠NA模型发病早期AHR与气道炎症分离，发病晚期AHR发生机制不同于早期，最可能与气道NEU数量增多有关[20]。赵燕等[21]成功构建了以Th17应答为主的气道NEU增高的小鼠哮喘模型。此模型BALF中除NEU明显增加外，EOS也有大量增加，两者之间的差距不如其他模型明显。
综合上述OVA联合LPS复制的NA模型，有以下特点：(1) 实验对象均为小鼠。(2) 多采用腹腔注射、气道滴入或者两者联合的方式系统致敏。致敏时OVA的量为50~200 μg，而LPS的量为0.1 μg或10 μg。(3) 多采用1%的OVA雾化吸入激发，也有吸入15%的OVA，激发时间可长达14 d。(4) NA模型均出现AHR，BALF中炎症细胞以NEU增加为主，以及气道炎症以NEU浸润为主的病理改变。以上模型说明OVA联合LPS复制NA模型具有良好的调节性和稳定性。但是此类模型对LPS的量及诱导时间要求比较严格，LPS的量过多或过少均会影响模型的成功率。
(3) OVA和香烟烟雾暴露诱发的NA模型：研究表明吸烟可导致气道Th2炎症向Th1炎症转化[22]，Min等[11]发现OVA联合香烟烟雾暴露诱导的哮喘小鼠比单独使用OVA诱导的哮喘小鼠AHR更明显，BALF中NEU显著增高，肺组织NEU炎症浸润显著。刘巧维[23]以Wistar大鼠为实验对象，在单纯哮喘模型的基础上处以烟雾暴露建立NA模型，病理改变为支气管壁增厚，支气管腔内及周围气道见大量NEU浸润及较少的EOS，肺组织支气管炎症评分中NEU积分显著高于EOS积分。此模型激发时间长达8周，有利于NEU气道炎症和气道重塑的形成。
(4) OVA和衣原体感染诱发的NA模型：Patel等[12]发现衣原体感染的哮喘患者诱导痰中NEU比未感染的患者增加明显，另有实验证实衣原体可以诱导小鼠气道NEU大量涌入[24]，推测衣原体感染与NA发展密切相关。Horvat等[25]用OVA联合衣原体感染复制NA模型，衣原体感染可促进Th1细胞免疫反应，使小鼠血和BALF中NEU大量增加，也可抑制Th2细胞免疫反应使EOS减少，并出现AHR、黏液细胞增生等。此模型为研究衣原体感染与哮喘以及与Th1/Th17相关免疫反应疾病关系的机制研究提供了平台。
综合以上OVA所诱导的NA哮喘模型，现将模型致敏、激发以及激发后气道炎症反应比较分析如下(表 1)。
表1
OVA所诱导的NA哮喘模型制作方法及炎症变化比较
2. RW诱发的NA模型：OVA是哮喘研究中最常用的抗原，但RW比OVA更接近临床相关抗原，其诱导的NA比OVA诱导的NA程度更高，更加具有代表性，且不需要长时间日常雾化曝光，或者使用佐剂。Srivastava等[26]以RW为致敏原建立NA模型，模型组出现AHR，BALF中NEU显著增加至(32.5±2.9)%，约为EOS的3倍，气管、血管周围大量的炎症细胞浸润，杯状细胞增生，黏液分泌增加等。RW诱导NEU炎症不是由内毒素引起，而是归因于RW内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，因为RW的内毒素水平只有OVA的0.001%。
3. TDI诱发的NA模型：TDI属于低分子量化学物质，对机体有半抗原特性，在高浓度情况下具有明显的黏膜刺激和腐蚀作用，是重要的职业性致喘物之一，临床研究发现TDI诱导的职业性哮喘诱导痰中往往以NEU为主。宋甲富等[27]用0.3%TDI耳廓致敏2次及口咽部吸入0.01%TDI激发3次建立小鼠NA模型，发现BALF中NEU(约占20%)较对照组显著增加，出现AHR，支气管及血管周围炎症细胞浸润同时伴有支气管上皮的增生。此模型为研究职业性NA提供了新的平台。
4. 其他NEU增加明显的重症哮喘动物模型：目前大量研究已证实NA与重症哮喘密切相关，且存在激素抵抗。Jiang等[28]用皮下注射、腹腔注射OVA致敏，雾化吸入OVA激发，LPS鼻腔滴入诱导的方法建立以NEU增加为主的重症哮喘小鼠模型。多种致敏原诱发的哮喘接近临床重症哮喘患者的病情，Liu等[29]用3种天然抗原HDM、RW、烟曲霉的提取物共同致敏和激发，建立以NEU增加为主的哮喘模型。此模型具有以下特点：(1) 大量NEU炎症浸润和气道重塑；(2) 高水平的IL-8以及肺上皮细胞和杯状细胞增生使黏液分泌增加；(3) 地塞米松治疗产生抵抗；(4) NEU气道炎症可能与核因子κB(NF-κB)的活性增加有关。此类模型激发时间一般较其他模型长，对气道反复刺激，气道反应性增加，出现气道重塑以及对激素治疗抵抗，因此也可用于研究NEU与激素抵抗型哮喘之间关系的研究。
三 NA动物模型检测指标的测定
动物模型应尽量接近人类疾病。对于NA，理想的动物模型至少应具备NEU浸润为主的气道炎症和AHR两大特征。目前主要有如下检测指标。
1. 血或BALF中炎症细胞的测定：利用涂片、推片技术，瑞士-吉姆萨染色或迪夫快速染色、血球计数仪或流式细胞术等计数血或BALF中细胞总数并进行细胞分类计数。综合上述模型，我们发现OVA联合CFA诱导的小鼠NA模型BALF中NEU%较其他模型高，可高达59%，接近临床NA哮喘患者，且具有良好的重复性及稳定性[15]。
2. AHR的测定：AHR为哮喘的重要特征，在NA中更明显[20, 29]。测量动物AHR主要包括整体测量方法和离体测量方法。整体法又主要分为无创法和有创法。无创测量最常用的是Penh(Ehanced pause)的测定，主要通过体积描记法测量计算得出，它最大可能地避免了人为因素对测量结果的影响，但现在并没有一种理论能说明它与气道反应性存在必然的相关性[30-31]。有创测量方法是基于单室呼吸模型以及相应的物理公式来进行计算的，主要包括气道阻抗(input impedance，Zin)、肺阻力(lung resistance，RL)、转移阻抗(transfer impedance，Ztr)的测定等。Zin是基于强迫脉冲震荡技术(forced oscillation technique，FOT)原理，是目前最精确、最为标准的测量方法。RL的测定最简单，国内最常用[32]。离体测量方法是采用电刺激小鼠离体气管平滑肌测定其收缩能力，但该方法很难反映由气道内黏液分泌、黏膜水肿及小气道病变所引起的肺通气功能障碍，目前已少用。
3. 肺组织病理学检查：HE染色或过碘酸雪夫染色检查气道、肺泡、肺组织等结构的变化，以及杯状细胞增生、炎症细胞浸润情况，或利用免疫组织化学、蛋白免疫印迹、Q-PCR等技术，观察肺组织中与NEU增加相关的细胞因子的表达情况。
四 NA模型的评价与展望
目前NA是临床治疗的一个难点，其发病机制及防治已成为研究热点，迫切需要合适的动物模型来推动其发展。由于NA动物模型研究在起步阶段，尚无统一的标准来评定NA模型。以往通常用肺功能及BALF中炎症细胞计数来描述哮喘表型，目前我们发现NA模型中BALF中NEU%在20%~59%，并未达到Simpson等[5]所定义的NA气道NEU%大于61%的标准。但是综合以上所有NA动物模型，可初步推测只要是BALF中NEU%大于20%且以NEU炎症为主的哮喘模型就可以认为是NA模型。由于存在种群差异性，将来的研究可以扩大样本量，并进一步优化致敏原及佐剂，制定明确的NA动物模型评判标准。此外，个别学者认为蛋白组学[18]、肺组织支气管炎症积分[23]可以用于鉴定NA模型，也许还有其他的方法可以用于鉴定NA哮喘模型，将来还需要进一步的拓展。在合理标准的指引下制备出更加接近人类的NA实验模型，可为NA的病因、发病机制、药物研发、治疗和预防研究提供更好的平台。
支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞和细胞组分参与的慢性炎症性疾病。既往认为嗜酸粒细胞(eosinophil，EOS)为哮喘的主要炎症细胞。近年来，大量研究证实中性粒细胞(neutrophil，NEU)在哮喘的发生、发展中起着重要作用。Douwes等[1]发现约50%的哮喘是由NEU引起，且NEU与重症哮喘[2]、迟发型哮喘[3]、激素不敏感型哮喘[4]等密切相关。2006年Simpson等[5]将诱导痰中中性粒细胞百分比(NEU%)＞61%的哮喘患者列为哮喘的一个独立的亚型——中性粒细胞哮喘(neutrophilic asthma，NA)。NA以其高发病率和难控性而受到广泛关注，其病因、发病机制、新药研发和评价、预防及治疗均为目前研究的热点，而这一切均需要成熟可靠的NA实验动物模型为载体。本文综述了NA实验动物模型的常用动物、造模方法及检测指标，并对其未来的研究前景进行展望。
一 常用于制作NA实验动物模型的动物
与人类完全相同的动物自发性哮喘模型目前还未发现，往往需要人工加以复制，尽量做到与人类NA相似。目前常用于制作NA模型的动物为小鼠、豚鼠和大鼠。
1. 小鼠：价廉易得，遗传背景明确，便于探讨哮喘气道炎症反应及气道高反应性(airway hyperreactivity，AHR)产生的免疫遗传机制，目前小鼠已成为国内外用来构建哮喘模型最常用的动物，尤其是BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠。小鼠因品系不同而对致敏原的反应有差异，BALB/c小鼠对致敏原较易产生AHR，而C57BL/6小鼠则不易产生AHR[6]。Hayashi等[7]发现小鼠性别对实验研究也存在影响，在鸡卵清蛋白(ovalbumin，OVA)诱发成熟雌/雄性BALB/c小鼠的迟发性气道炎症中，雌性小鼠气道炎症细胞浸润的程度比雄性小鼠严重，且其支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎症细胞数也较雄性多，所以常选择雌性小鼠用于NA实验研究。
2. 豚鼠：豚鼠是所有实验动物中补体含量最多的一种，已广泛用于迟发型和速发型变态反应的研究，是国内外用于模拟人类哮喘生理学异常常用的动物。豚鼠迟发型变态反应与人相似，采用2~3个月龄或350~400g的豚鼠作迟发型反应研究最合适。不同花色的豚鼠体内免疫球蛋白的含量不同，例如白化豚鼠产生免疫球蛋白的能力较弱，对生活环境中的抗原刺激免疫应答能力显著低于花色豚鼠[8]。
3. 大鼠：价廉易养，繁殖力强，生物学试剂种类多且易获得，标本采集量相对较充足，对抗原的反应性较为一致，大鼠基因组与人类的基因组序列比较相似。目前我国最常用于哮喘研究的大鼠有SD大鼠和Wistar大鼠，国外多用Brown Norway大鼠。其中，SD大鼠较Wistar大鼠对呼吸道疾病的抵抗力更强。
二 变应原诱发的NA动物模型
目前用于复制NA模型的变应原主要有OVA、豚草(ragweed，RW)、对甲苯二异氰酸酯(toluene di-isocyanate，TDI)、尘螨(house dust mites，HDM)等。
1. 基于OVA诱发的NA模型：迄今为止，OVA是制备哮喘动物模型最常用的致敏原，有单纯OVA和复合OVA(含佐剂)两种，以复合OVA较常用。除了致敏原以外，细菌内毒素(LPS)[9]、环境污染[10]、香烟烟雾[11]、支原体感染[12]等许多非过敏性因素也可导致哮喘患者或小鼠气道NEU增多，活性增强，并与AHR有关，因此通常采用OVA联合非过敏因素建NA实验动物模型。
(1) OVA和弗氏完全佐剂(complete Freund’S adjuvant，CFA)诱导的NA动物模型：许多研究证实NA与Th1/Th17抗原特异性反应有关，Th1/Th17细胞主要通过释放的细胞因子如白细胞介素(interleukin, IL-17)等发挥作用，参与诱导气道NEU的募集和加重AHR[13]。而CFA是一种强有力的诱导CD4+ T细胞向Th1/Th17细胞分化的佐剂，是目前最常用于动物实验的佐剂。Bogaert等[14]将OVA联合CFA致敏和OVA激发成功建立了NA动物模型。此模型表现出明显的气道NEU炎症，但是研究者没有进一步检测哮喘小鼠的AHR。Dejager等[15]用同样的方法成功复制NA模型，BALF中NEU%达59%，出现明显的AHR，补充了前者的不足，也证明了此方法具有良好的重复性。我们实验室曾用类似的方法成功建立豚鼠NA模型，弥补了小鼠NA模型取材困难、标本量少等不足，可以满足对标本量需求大的研究的要求，但是气道NEU浸润不及小鼠模型明显[16]。说明用OVA联合CFA致敏、激发的方法在不同鼠种之间有一定的差异性。
(2) OVA和脂多糖(LPS)诱发的NA模型：LPS是一种常用的佐剂，它是革兰阴性杆菌细胞壁的共同成分，它可通过激活多条信号通路，高效诱导细胞因子合成与释放，激发炎症反应，加重AHR[17]，也可以诱导NEU、EOS的募集，从而加重哮喘[9]，因此LPS常用于复制NA动物模型。Bergquist等[18]用BALB/c雌性小鼠腹腔注射10 μg OVA致敏，雾化吸入1%OVA+LPS+PBS混合气溶胶激发，成功复制NA实验动物模型，并从蛋白质组学分析EA与NA的不同，进一步确定了此模型符合NA。
我国多位学者采用OVA联合LPS致敏3次、雾化吸入OVA连续2周激发的方法均成功建立小鼠NA模型[19-20]。此小鼠NA模型发病早期AHR与气道炎症分离，发病晚期AHR发生机制不同于早期，最可能与气道NEU数量增多有关[20]。赵燕等[21]成功构建了以Th17应答为主的气道NEU增高的小鼠哮喘模型。此模型BALF中除NEU明显增加外，EOS也有大量增加，两者之间的差距不如其他模型明显。
综合上述OVA联合LPS复制的NA模型，有以下特点：(1) 实验对象均为小鼠。(2) 多采用腹腔注射、气道滴入或者两者联合的方式系统致敏。致敏时OVA的量为50~200 μg，而LPS的量为0.1 μg或10 μg。(3) 多采用1%的OVA雾化吸入激发，也有吸入15%的OVA，激发时间可长达14 d。(4) NA模型均出现AHR，BALF中炎症细胞以NEU增加为主，以及气道炎症以NEU浸润为主的病理改变。以上模型说明OVA联合LPS复制NA模型具有良好的调节性和稳定性。但是此类模型对LPS的量及诱导时间要求比较严格，LPS的量过多或过少均会影响模型的成功率。
(3) OVA和香烟烟雾暴露诱发的NA模型：研究表明吸烟可导致气道Th2炎症向Th1炎症转化[22]，Min等[11]发现OVA联合香烟烟雾暴露诱导的哮喘小鼠比单独使用OVA诱导的哮喘小鼠AHR更明显，BALF中NEU显著增高，肺组织NEU炎症浸润显著。刘巧维[23]以Wistar大鼠为实验对象，在单纯哮喘模型的基础上处以烟雾暴露建立NA模型，病理改变为支气管壁增厚，支气管腔内及周围气道见大量NEU浸润及较少的EOS，肺组织支气管炎症评分中NEU积分显著高于EOS积分。此模型激发时间长达8周，有利于NEU气道炎症和气道重塑的形成。
(4) OVA和衣原体感染诱发的NA模型：Patel等[12]发现衣原体感染的哮喘患者诱导痰中NEU比未感染的患者增加明显，另有实验证实衣原体可以诱导小鼠气道NEU大量涌入[24]，推测衣原体感染与NA发展密切相关。Horvat等[25]用OVA联合衣原体感染复制NA模型，衣原体感染可促进Th1细胞免疫反应，使小鼠血和BALF中NEU大量增加，也可抑制Th2细胞免疫反应使EOS减少，并出现AHR、黏液细胞增生等。此模型为研究衣原体感染与哮喘以及与Th1/Th17相关免疫反应疾病关系的机制研究提供了平台。
综合以上OVA所诱导的NA哮喘模型，现将模型致敏、激发以及激发后气道炎症反应比较分析如下(表 1)。
表1
OVA所诱导的NA哮喘模型制作方法及炎症变化比较
2. RW诱发的NA模型：OVA是哮喘研究中最常用的抗原，但RW比OVA更接近临床相关抗原，其诱导的NA比OVA诱导的NA程度更高，更加具有代表性，且不需要长时间日常雾化曝光，或者使用佐剂。Srivastava等[26]以RW为致敏原建立NA模型，模型组出现AHR，BALF中NEU显著增加至(32.5±2.9)%，约为EOS的3倍，气管、血管周围大量的炎症细胞浸润，杯状细胞增生，黏液分泌增加等。RW诱导NEU炎症不是由内毒素引起，而是归因于RW内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，因为RW的内毒素水平只有OVA的0.001%。
3. TDI诱发的NA模型：TDI属于低分子量化学物质，对机体有半抗原特性，在高浓度情况下具有明显的黏膜刺激和腐蚀作用，是重要的职业性致喘物之一，临床研究发现TDI诱导的职业性哮喘诱导痰中往往以NEU为主。宋甲富等[27]用0.3%TDI耳廓致敏2次及口咽部吸入0.01%TDI激发3次建立小鼠NA模型，发现BALF中NEU(约占20%)较对照组显著增加，出现AHR，支气管及血管周围炎症细胞浸润同时伴有支气管上皮的增生。此模型为研究职业性NA提供了新的平台。
4. 其他NEU增加明显的重症哮喘动物模型：目前大量研究已证实NA与重症哮喘密切相关，且存在激素抵抗。Jiang等[28]用皮下注射、腹腔注射OVA致敏，雾化吸入OVA激发，LPS鼻腔滴入诱导的方法建立以NEU增加为主的重症哮喘小鼠模型。多种致敏原诱发的哮喘接近临床重症哮喘患者的病情，Liu等[29]用3种天然抗原HDM、RW、烟曲霉的提取物共同致敏和激发，建立以NEU增加为主的哮喘模型。此模型具有以下特点：(1) 大量NEU炎症浸润和气道重塑；(2) 高水平的IL-8以及肺上皮细胞和杯状细胞增生使黏液分泌增加；(3) 地塞米松治疗产生抵抗；(4) NEU气道炎症可能与核因子κB(NF-κB)的活性增加有关。此类模型激发时间一般较其他模型长，对气道反复刺激，气道反应性增加，出现气道重塑以及对激素治疗抵抗，因此也可用于研究NEU与激素抵抗型哮喘之间关系的研究。
三 NA动物模型检测指标的测定
动物模型应尽量接近人类疾病。对于NA，理想的动物模型至少应具备NEU浸润为主的气道炎症和AHR两大特征。目前主要有如下检测指标。
1. 血或BALF中炎症细胞的测定：利用涂片、推片技术，瑞士-吉姆萨染色或迪夫快速染色、血球计数仪或流式细胞术等计数血或BALF中细胞总数并进行细胞分类计数。综合上述模型，我们发现OVA联合CFA诱导的小鼠NA模型BALF中NEU%较其他模型高，可高达59%，接近临床NA哮喘患者，且具有良好的重复性及稳定性[15]。
2. AHR的测定：AHR为哮喘的重要特征，在NA中更明显[20, 29]。测量动物AHR主要包括整体测量方法和离体测量方法。整体法又主要分为无创法和有创法。无创测量最常用的是Penh(Ehanced pause)的测定，主要通过体积描记法测量计算得出，它最大可能地避免了人为因素对测量结果的影响，但现在并没有一种理论能说明它与气道反应性存在必然的相关性[30-31]。有创测量方法是基于单室呼吸模型以及相应的物理公式来进行计算的，主要包括气道阻抗(input impedance，Zin)、肺阻力(lung resistance，RL)、转移阻抗(transfer impedance，Ztr)的测定等。Zin是基于强迫脉冲震荡技术(forced oscillation technique，FOT)原理，是目前最精确、最为标准的测量方法。RL的测定最简单，国内最常用[32]。离体测量方法是采用电刺激小鼠离体气管平滑肌测定其收缩能力，但该方法很难反映由气道内黏液分泌、黏膜水肿及小气道病变所引起的肺通气功能障碍，目前已少用。
3. 肺组织病理学检查：HE染色或过碘酸雪夫染色检查气道、肺泡、肺组织等结构的变化，以及杯状细胞增生、炎症细胞浸润情况，或利用免疫组织化学、蛋白免疫印迹、Q-PCR等技术，观察肺组织中与NEU增加相关的细胞因子的表达情况。
四 NA模型的评价与展望
目前NA是临床治疗的一个难点，其发病机制及防治已成为研究热点，迫切需要合适的动物模型来推动其发展。由于NA动物模型研究在起步阶段，尚无统一的标准来评定NA模型。以往通常用肺功能及BALF中炎症细胞计数来描述哮喘表型，目前我们发现NA模型中BALF中NEU%在20%~59%，并未达到Simpson等[5]所定义的NA气道NEU%大于61%的标准。但是综合以上所有NA动物模型，可初步推测只要是BALF中NEU%大于20%且以NEU炎症为主的哮喘模型就可以认为是NA模型。由于存在种群差异性，将来的研究可以扩大样本量，并进一步优化致敏原及佐剂，制定明确的NA动物模型评判标准。此外，个别学者认为蛋白组学[18]、肺组织支气管炎症积分[23]可以用于鉴定NA模型，也许还有其他的方法可以用于鉴定NA哮喘模型，将来还需要进一步的拓展。在合理标准的指引下制备出更加接近人类的NA实验模型，可为NA的病因、发病机制、药物研发、治疗和预防研究提供更好的平台。
