引用本文： 蒋雪莲, 钟萍, 黄成亮, 孟原竹, 何芳, 范贤明. 氧化应激反应标志物在慢性阻塞性肺疾病稳定期患者血清中的表达及意义. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(6): 542-547. doi: 10.7507/1671-6205.2016125 复制
氧化应激是导致慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)发病率和死亡率升高的一个重要因素[1]。在所有反映氧化应激的指标中，由于自由基不稳定不易测定，各个酶促和非酶促抗氧化剂往往所反映的抗氧化能力又较单一。而氧化应激对机体的损伤主要表现为活性氧自由基(ROS)对脂质、蛋白质、DNA的氧化损伤，以及与ROS相对应的机体内清除氧化物的能力。因此，脂质、蛋白质、DNA氧化损伤的终产物和总抗氧化能力含量成为反映氧化与抗氧化失衡相对直接而可靠的指标。机体内丙二醛(MDA)的含量与氧自由基的生成平行，测定MDA的浓度可反映脂质过氧化水平，并间接反映细胞受损坏的程度[2]。蛋白质羰基(PC)是ROS对机体蛋白质氨基酸侧链损伤的产物，随着氧化应激的程度加重，蛋白质羰基化程度也随之加重，从而使蛋白质不易折叠且容易发生交联，故PC被认为是评价蛋白氧化损伤程度的有效指标[3-4]。国外有研究发现PC是慢阻肺的独立危险因素[5]。8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是DNA氧化损伤的终产物，被公认为是DNA氧化损伤的标志物[6]。研究者们对慢阻肺患者尿液中的8-OHdG研究较多，但对慢阻肺患者血清中的8-OHdG研究却很少。总抗氧化能力(TAC)代表机体抗氧化防御体系的整体状态[7]，由酶促和非酶促两大部分组成, 比测定单个抗氧化物能够更好地反映机体的抗氧化状态。本研究通过测定慢阻肺患者血清中氧化应激反应标志物MDA、PC、8-OHdG、TAC的含量，以及对受试者进行肺功能的检测和一般资料的收集，分析氧化应激反应标志物与慢阻肺患者吸烟、肺功能的关系，旨在探讨氧化应激在慢阻肺发病过程中的可能作用，增加临床医师对慢阻肺氧化应激机制的认识，希望能为慢阻肺的个体化治疗提供新思路，降低致残率和病死率。
对象与方法
一 对象
选择2014年6月至2014年8月在西南医科大学附属医院、泸州市江南医院和泸州市龙马潭区红十字医院体检的慢阻肺稳定期患者200例(慢阻肺组)，体检健康者100例(对照组)。本研究经过泸州医学院附属医院伦理委员会批准(申请受理号：KY2012021)，在中国临床试验注册中心注册(注册号：ChiCTR-IPC-14005425)，并征得所有研究对象的知情同意并签字。
纳入标准：年龄40~90岁；神志清楚，言语沟通无障碍，行为配合；所有慢阻肺稳定期患者的诊断均符合我国《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》(2013年修订版)的诊断标准；所有体检健康者FEV1/FVC＞70%，无呼吸系统及其他疾病。慢阻肺组及对照组由吸烟者和未吸烟者组成。纳入标准[8]：吸烟者：吸烟史≥10包年，连续吸烟(大于10年)未进行过戒断；未吸烟者：从未吸烟，无被动吸烟。排除标准[9]：患支气管扩张症、活动性肺结核、支气管哮喘、肺癌等可造成气喘或呼吸困难的其他疾病；有阻塞性睡眠呼吸暂停、糖尿病、肝肾功能障碍；近期有手术、外伤；有关节炎、结缔组织疾病等全身其他系统性炎症疾病；患有精神疾病、认知功能障碍、不能交流的患者；身体超重或肥胖(体重指数≥30 kg/m2)。
二 方法
1.肺功能测试：受试者安静休息30 min，测试前连续3次测量受试者的身高和体重并取平均值。采用日本捷斯特公司的肺功能检测仪，对无禁忌且能配合完成者进行肺功能检测。按照使用说明书，并结合肺功能检测专业技术人员的指导，测试者输入受试者的身高、体重等生理参数，并由计算机自动获取各预计参数。主要观察指标为FEV1/FVC、FEV1%pred。
2.血清标本采集：抽取受试者清晨空腹静脉血3~5 mL，3 500 r/min离心10 min，分离血清，置于-70 ℃冰箱待测。
3.血清各氧化应激指标的测定：MDA的测定采用硫代巴比妥酸比色法，应用酶标仪于532 nm测定各样本吸光度(OD)值，MDA (nmol/mL)=[(OD测定管-OD标准空白管)/(OD标准管-OD标准空白管)]×标准品浓度×样本测试前稀释倍数；采用ELISA试剂盒检测血清中PC的OD值，根据标准品OD绘制的标准曲线查出相应的浓度(ng/mL)；8-OHdG的测定采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清中8-OHdG的OD值，根据标准品OD值绘制的标准曲线查出相应的含量，再乘以稀释倍数得到血清8-OHdG的浓度(pg/mL)；TAC的测定采用菲罗啉比色法，应用分光光度计于520 nm处依序测量各样本OD值，TAC (U/mL)=[(OD测定管-OD对照管)/0.01]/30×N×n(其中N表示反应体系稀释倍数：样品总体积/取样量，n表示样本测试前稀释倍数)。具体操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。
三 统计学处理
所有数据采用SPSS 17.0软件进行分析，符合正态分布的定量资料采用x±s表示，不符合正态分布的定量资料采用中位数(四分位数间距)(M[P25，P75])表示，定性资料采用百分位数表示。符合正态分布的定量资料的组间差异性比较采用独立样本t检验，不符合正态分布的定量资料组间比较采用秩和检验；定性资料组间差异性比较采用χ2检验。多元线性回归用于探索相关因素与气流受限程度(FEV1%pred)的关联程度。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 慢阻肺组与对照组一般资料比较
将受试者按是否患慢阻肺分为慢阻肺组(n=200)和对照组(n=100)；再将慢阻肺患者按是否吸烟分为吸烟亚组(n=93)和未吸烟亚组(n=107)；将慢阻肺患者按照气流受限程度分为轻-中度亚组(n=107，FEV1pred≥50%)，重-极重度亚组(n=93, FEV1pred＜50%)。慢阻肺组：男119例，女81例；年龄42~87岁，平均年龄(68.2±8.1)岁；吸烟指数28[14,25]包年。对照组：男49例，女51例；年龄51~87岁，平均年龄(67.6±7.6)岁；吸烟指数31[20,41]包年。慢阻肺组与对照组性别构成比、吸烟情况经χ2检验，年龄经独立样本t检验，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
二 慢阻肺组与对照组相关氧化应激反应标志物的比较
与对照组比较，慢阻肺组血清MDA、PC、8-OHdG的浓度均升高(P＜0.05)，而血清TAC水平显著降低(P＜0.001)，结果见表 1。
表1
慢阻肺组与对照组氧化应激反应标志物的比较(M[P25，P75])
三 慢阻肺患者吸烟亚组与未吸烟亚组相关氧化应激指标的差异
与未吸烟亚组比较，吸烟亚组的慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的浓度均明显升高(P＜0.05)；虽然慢阻肺吸烟亚组血清MDA的浓度升高、TAC的浓度降低，但两组间差异均无统计学意义(P＞0.05)，结果见表 2。
表2
吸烟对慢阻肺患者各氧化应激指标的影响(M[P25，P75])
四 慢阻肺患者不同程度气流受限亚组间相关氧化应激指标的差异
重度-极重度亚组的慢阻肺患者血清PC浓度明显高于轻-中度亚组慢阻肺患者血清PC的浓度(P＜0.01)；而血清MDA、8-OHdG、TAC的水平在这两亚组间差异均无统计学意义(P＞0.05)，结果见表 3。
表3
慢阻肺患者不同气流受限亚组间相关氧化应激指标比较(M[P25，P75])
五 气流受限程度FEV1%pred影响因素的探究
经过多元线性回归分析可见，自变量PC和8-OHdG与慢阻肺患者FEV1%pred关联有统计学意义(β=-0.230，-0.219，P＜0.01)，血清PC的水平对FEV1%pred的影响比8-OHdG大。其标准化回归系数均为负值，说明这两个变量与FEV1%pred呈负相关，其测定值越小，FEV1%pred越大；这两个变量测定值越大，FEV1%pred越小，结果见表 4。
表4
各指标对FEV1%pred的多元线性回归
讨论
关于慢阻肺的发病机制，虽然既往研究多集中在炎性机制和弹性蛋白酶/抗弹性蛋白酶失衡两大重要机制上，但是近年来氧化应激作为一个新的切入点，对慢阻肺发生发展的影响逐渐被人们所认识[10]。有研究证实慢阻肺患者血清、肺组织、呼出气冷凝液、诱导痰的MDA水平较对照组明显升高；急性加重期患者痰中MDA的浓度更是显著高于慢阻肺稳定期组和对照组，经治疗后痰中MDA明显减少[5, 11-15]。本研究也发现慢阻肺组血清MDA浓度明显高于对照组。可见，慢阻肺稳定期患者体内存在明显氧化应激，ROS与多不饱和脂肪酸反应产生脂质过氧化物，进而分解出大量MDA。PC是ROS对机体蛋白质氨基酸侧链氧化损伤的产物，并被认为是评价蛋白质氧化损伤程度的有效指标。Ahmad等[16]研究证实慢阻肺组血清PC浓度明显高于对照组。也有研究发现慢阻肺组骨骼肌中PC水平明显高于正常组，在慢阻肺组中血清中的PC含量明显与骨骼肌中的水平呈正相关[17]。Barreiro等[3]还发现慢阻肺组股四头肌肌酸激酶羰基化明显强于对照组，并且肌酸激酶的羰基化强度与FEV1%pred呈负相关。通过研究，我们发现慢阻肺组血清PC浓度明显高于对照组。这说明我国慢阻肺稳定期患者体内也存在蛋白质的氧化损伤。蛋白质的氧化损伤可使一些酶类、呼吸肌和外周骨骼肌蛋白质羰基化，导致蛋白/抗蛋白酶失衡、免疫反应、呼吸肌和外周骨骼肌功能障碍，促进慢阻肺的发生、发展[18-19]。ROS可直接攻击DNA，使DNA上的鸟嘌呤被氧化为8-OHdG。过去，许多学者发现慢阻肺患者尿、肺组织、淋巴细胞和痰液中8-OHdG均明显高于健康人群；尿中8-OHdG的浓度与FVC%、FEV1%pred、动脉血中的氧含量呈负相关；并且发现高水平的8-OHdG与吸烟导致的慢阻肺密切相关[20-22]。我们的研究发现慢阻肺稳定期患者血清8-OHdG的浓度明显高于对照组。这说明慢阻肺患者体内氧化应激失衡导致了DNA的氧化损伤。
TAC代表机体抗氧化防御体系的整体状态。有研究者发现慢阻肺组血清TAC浓度较对照组显著降低[5, 23]；慢阻肺急性加重期患者经治疗缓解后，痰上清液中TAC水平增高[24]。Ekin等[25]发现血清TAC浓度在慢阻肺组与对照组间差异无统计学意义，这可能是由于该研究对照组样本量较少，影响了检验效能。我们的研究也发现慢阻肺组血清TAC水平显著低于对照组，再次验证了慢阻肺患者体内TAC下降，这与慢阻肺患者机体氧化应激负荷过重，过度消耗了体内的抗氧化物有关。有研究表明长期使用抗氧化剂可以提高慢阻肺患者肺功能，延缓其下降，改善生活质量，减少慢阻肺急性加重的次数[26-27]。但抗氧化剂在临床上的使用较少，更多疗效较好的抗氧化剂有待进一步发掘，这更需要临床医生及研究者们引起重视。
香烟烟雾中含有大量自由基，它们进入机体后不能被有效清除而产生聚集。这些聚集的自由基通过对生物大分子的损伤引起气道、肺组织，甚至全身细胞、组织的氧化损伤，从而导致慢阻肺的发生和发展。Ceylan等[28]发现血清PC浓度在吸烟慢阻肺组明显高于对照组。Barreiro等[29]研究发现健康吸烟者及暴露于吸烟环境的小鼠、豚鼠呼吸肌和外周骨骼肌肌肉PC水平升高。Portao de Carlos等[30]也证实香烟烟雾暴露的小鼠肺组织和膈肌发生蛋白质羰基化。但以上研究均不是针对慢阻肺患者吸烟与未吸烟者的比较。在我们的研究中，与未吸烟亚组比较，吸烟亚组的慢阻肺患者血清PC、8-OHdG的浓度明显增高。这说明吸烟可能大大加重了人体呼吸肌和外周骨骼肌肌肉蛋白质的羰基化。而呼吸肌和外周骨骼肌的氧化损伤可以直接导致肺功能和人体运动耐力的下降，这可能与慢阻肺患者的发病机制密切相关。Yang等[31]的研究表明在吸烟的慢阻肺患者外周血单核细胞DNA中的8-OHDG水平与吸烟量呈正相关，并且与FEV1%pred呈负相关。Ceylan等[28]还发现吸烟相关的慢阻肺患者外周血单核细胞中DNA氧化损伤程度比生物燃料相关的慢阻肺患者更高，吸烟是比生物燃料导致DNA氧化损伤的更显著危险因素。有研究发现在环境烟草烟雾和砷诱导的肺气肿小鼠模型中，8-OHdG作为早期生物标志物水平升高[32]。因此，慢阻肺患者血清中8-OHdG浓度的增高，可能与吸烟导致的机体DNA的氧化损伤关系密切。对于吸烟的人群，或许我们可以通过结合监测机体8-OHdG的水平来早期发现慢阻肺。也有研究者发现吸烟会导致慢阻肺患者体内MDA浓度升高[12]，而各种抗氧化物的水平降低[33-34]。在我们的研究中，虽然慢阻肺吸烟亚组较未吸烟亚组血清MDA的浓度升高、TAC的浓度降低，但两组间差异均无统计学意义。这可能与我们的数据不符合正态分布，使用的是秩和检验，检验效能相对t检验要低，而没有检测出这两组间MDA和TAC水平差异的统计学意义有关。
我们的研究分析得出，与轻-中度亚组相比，重度-极重度亚组慢阻肺患者血清PC浓度明显升高。Torres-Ramos等[35]也发现慢阻肺患者不同气流受限程度分级血清PC水平明显高于正常组，极重度组PC浓度最高，并且比中度组高73%，表明高水平的PC与慢阻肺的严重程度密切相关。还有研究证实慢阻肺患者PC水平与FEV1%pred呈负相关[36]。在本研究中，多元线性回归分析显示慢阻肺患者血清PC的浓度与FEV1%pred呈显著负相关。在慢阻肺发病进程中，由于氧化应激导致蛋白质羰基化，使机体产生蛋白/抗蛋白酶失衡、免疫反应、呼吸肌的损害，促使慢阻肺患者肺功能的下降[18-19]。由此，我们推测PC可作为监测慢阻肺进展和氧化应激损伤的生物标志物。我们的研究未发现慢阻肺患者轻-中度、重-极重度亚组间血清MDA、8-OHdG和TAC的水平有显著差异。但是多元线性回归分析显示慢阻肺患者血清8-OHdG的表达也是FEV1%pred的影响因素，血清中8-OHdG的表达也与FEV1%pred呈负相关，并发现慢阻肺患者血清PC的表达对FEV1%pred的影响较8-OHdG大。这可能与FEV1%pred受多种因素的影响有关；也可能是由于根据我们的数据特点使用了秩和检验，检验效能低于t检验，而没有检测出慢阻肺患者轻-中度、重-极重度亚组间这三个指标水平差异的统计学意义。通过多元线性回归分析，我们的研究未发现慢阻肺患者血清MDA、TAC的水平与FEV1%pred有明显相关性。虽然也有研究发现慢阻肺患者机体的氧化和抗氧化状态与肺功能无相关性[25, 37]。但Arja等[8]的研究表明血清MDA的浓度与慢阻肺患者FEV1%pred呈负相关，认为血清MDA的增多与慢阻肺的发病进程有关，高水平的MDA增加疾病进展的风险。Ahmad等[16]发现慢阻肺患者血清TAC的水平与FEV1%pred呈显著正相关，认为较低的抗氧化能力导致更严重的气流受限。我们推测，研究结果的不一致可能是由于慢阻肺的发病机制较复杂，因而对于“易感基因”和慢阻肺分型的研究可能是未来研究的热点。
虽然血清标本容易获得，且血清标本中氧化应激反应标记物的检测方法较成熟，但无法直接反映气道和肺部局部的氧化应激情况，将来我们可以同时检测呼出气冷凝液、痰中的氧化应激反应标志物，与血清中同类标志物进行比较，以进一步探究慢阻肺的氧化应激机制。另外，本研究的局限在于饮食习惯、体育活动、糖皮质激素等药物的使用可能影响人体内氧化物和抗氧化物的水平，但这些因素难以实现一致，导致我们的许多数据呈偏态分布，可能影响检验效能。但通过我们的研究初步发现慢阻肺患者血清MDA、PC、8-OHdG的浓度明显升高，血清TAC的水平明显降低；吸烟可使慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的浓度异常升高；氧化应激导致的蛋白质羰基化和DNA氧化损伤是肺功能的影响因素，慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的浓度越高，气流受限程度越重。由此可见，慢阻肺稳定期患者体内存在明显的氧化和抗氧化失衡；吸烟引起慢阻肺患者血清PC、8-OHdG的水平异常升高，吸烟可能会加重慢阻肺患者体内蛋白质和DNA的氧化损伤；血清PC、8-OHdG的水平均与FEV1%pred呈负相关，表明氧化应激在慢阻肺的发病过程中起了重要作用。我们可以通过避免接触使机体氧化应激增强的危险因素(如吸烟)和抗氧化治疗来预防慢阻肺的发生和发展。
氧化应激是导致慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)发病率和死亡率升高的一个重要因素[1]。在所有反映氧化应激的指标中，由于自由基不稳定不易测定，各个酶促和非酶促抗氧化剂往往所反映的抗氧化能力又较单一。而氧化应激对机体的损伤主要表现为活性氧自由基(ROS)对脂质、蛋白质、DNA的氧化损伤，以及与ROS相对应的机体内清除氧化物的能力。因此，脂质、蛋白质、DNA氧化损伤的终产物和总抗氧化能力含量成为反映氧化与抗氧化失衡相对直接而可靠的指标。机体内丙二醛(MDA)的含量与氧自由基的生成平行，测定MDA的浓度可反映脂质过氧化水平，并间接反映细胞受损坏的程度[2]。蛋白质羰基(PC)是ROS对机体蛋白质氨基酸侧链损伤的产物，随着氧化应激的程度加重，蛋白质羰基化程度也随之加重，从而使蛋白质不易折叠且容易发生交联，故PC被认为是评价蛋白氧化损伤程度的有效指标[3-4]。国外有研究发现PC是慢阻肺的独立危险因素[5]。8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是DNA氧化损伤的终产物，被公认为是DNA氧化损伤的标志物[6]。研究者们对慢阻肺患者尿液中的8-OHdG研究较多，但对慢阻肺患者血清中的8-OHdG研究却很少。总抗氧化能力(TAC)代表机体抗氧化防御体系的整体状态[7]，由酶促和非酶促两大部分组成, 比测定单个抗氧化物能够更好地反映机体的抗氧化状态。本研究通过测定慢阻肺患者血清中氧化应激反应标志物MDA、PC、8-OHdG、TAC的含量，以及对受试者进行肺功能的检测和一般资料的收集，分析氧化应激反应标志物与慢阻肺患者吸烟、肺功能的关系，旨在探讨氧化应激在慢阻肺发病过程中的可能作用，增加临床医师对慢阻肺氧化应激机制的认识，希望能为慢阻肺的个体化治疗提供新思路，降低致残率和病死率。
对象与方法
一 对象
选择2014年6月至2014年8月在西南医科大学附属医院、泸州市江南医院和泸州市龙马潭区红十字医院体检的慢阻肺稳定期患者200例(慢阻肺组)，体检健康者100例(对照组)。本研究经过泸州医学院附属医院伦理委员会批准(申请受理号：KY2012021)，在中国临床试验注册中心注册(注册号：ChiCTR-IPC-14005425)，并征得所有研究对象的知情同意并签字。
纳入标准：年龄40~90岁；神志清楚，言语沟通无障碍，行为配合；所有慢阻肺稳定期患者的诊断均符合我国《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》(2013年修订版)的诊断标准；所有体检健康者FEV1/FVC＞70%，无呼吸系统及其他疾病。慢阻肺组及对照组由吸烟者和未吸烟者组成。纳入标准[8]：吸烟者：吸烟史≥10包年，连续吸烟(大于10年)未进行过戒断；未吸烟者：从未吸烟，无被动吸烟。排除标准[9]：患支气管扩张症、活动性肺结核、支气管哮喘、肺癌等可造成气喘或呼吸困难的其他疾病；有阻塞性睡眠呼吸暂停、糖尿病、肝肾功能障碍；近期有手术、外伤；有关节炎、结缔组织疾病等全身其他系统性炎症疾病；患有精神疾病、认知功能障碍、不能交流的患者；身体超重或肥胖(体重指数≥30 kg/m2)。
二 方法
1.肺功能测试：受试者安静休息30 min，测试前连续3次测量受试者的身高和体重并取平均值。采用日本捷斯特公司的肺功能检测仪，对无禁忌且能配合完成者进行肺功能检测。按照使用说明书，并结合肺功能检测专业技术人员的指导，测试者输入受试者的身高、体重等生理参数，并由计算机自动获取各预计参数。主要观察指标为FEV1/FVC、FEV1%pred。
2.血清标本采集：抽取受试者清晨空腹静脉血3~5 mL，3 500 r/min离心10 min，分离血清，置于-70 ℃冰箱待测。
3.血清各氧化应激指标的测定：MDA的测定采用硫代巴比妥酸比色法，应用酶标仪于532 nm测定各样本吸光度(OD)值，MDA (nmol/mL)=[(OD测定管-OD标准空白管)/(OD标准管-OD标准空白管)]×标准品浓度×样本测试前稀释倍数；采用ELISA试剂盒检测血清中PC的OD值，根据标准品OD绘制的标准曲线查出相应的浓度(ng/mL)；8-OHdG的测定采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清中8-OHdG的OD值，根据标准品OD值绘制的标准曲线查出相应的含量，再乘以稀释倍数得到血清8-OHdG的浓度(pg/mL)；TAC的测定采用菲罗啉比色法，应用分光光度计于520 nm处依序测量各样本OD值，TAC (U/mL)=[(OD测定管-OD对照管)/0.01]/30×N×n(其中N表示反应体系稀释倍数：样品总体积/取样量，n表示样本测试前稀释倍数)。具体操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。
三 统计学处理
所有数据采用SPSS 17.0软件进行分析，符合正态分布的定量资料采用x±s表示，不符合正态分布的定量资料采用中位数(四分位数间距)(M[P25，P75])表示，定性资料采用百分位数表示。符合正态分布的定量资料的组间差异性比较采用独立样本t检验，不符合正态分布的定量资料组间比较采用秩和检验；定性资料组间差异性比较采用χ2检验。多元线性回归用于探索相关因素与气流受限程度(FEV1%pred)的关联程度。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 慢阻肺组与对照组一般资料比较
将受试者按是否患慢阻肺分为慢阻肺组(n=200)和对照组(n=100)；再将慢阻肺患者按是否吸烟分为吸烟亚组(n=93)和未吸烟亚组(n=107)；将慢阻肺患者按照气流受限程度分为轻-中度亚组(n=107，FEV1pred≥50%)，重-极重度亚组(n=93, FEV1pred＜50%)。慢阻肺组：男119例，女81例；年龄42~87岁，平均年龄(68.2±8.1)岁；吸烟指数28[14,25]包年。对照组：男49例，女51例；年龄51~87岁，平均年龄(67.6±7.6)岁；吸烟指数31[20,41]包年。慢阻肺组与对照组性别构成比、吸烟情况经χ2检验，年龄经独立样本t检验，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
二 慢阻肺组与对照组相关氧化应激反应标志物的比较
与对照组比较，慢阻肺组血清MDA、PC、8-OHdG的浓度均升高(P＜0.05)，而血清TAC水平显著降低(P＜0.001)，结果见表 1。
表1
慢阻肺组与对照组氧化应激反应标志物的比较(M[P25，P75])
三 慢阻肺患者吸烟亚组与未吸烟亚组相关氧化应激指标的差异
与未吸烟亚组比较，吸烟亚组的慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的浓度均明显升高(P＜0.05)；虽然慢阻肺吸烟亚组血清MDA的浓度升高、TAC的浓度降低，但两组间差异均无统计学意义(P＞0.05)，结果见表 2。
表2
吸烟对慢阻肺患者各氧化应激指标的影响(M[P25，P75])
四 慢阻肺患者不同程度气流受限亚组间相关氧化应激指标的差异
重度-极重度亚组的慢阻肺患者血清PC浓度明显高于轻-中度亚组慢阻肺患者血清PC的浓度(P＜0.01)；而血清MDA、8-OHdG、TAC的水平在这两亚组间差异均无统计学意义(P＞0.05)，结果见表 3。
表3
慢阻肺患者不同气流受限亚组间相关氧化应激指标比较(M[P25，P75])
五 气流受限程度FEV1%pred影响因素的探究
经过多元线性回归分析可见，自变量PC和8-OHdG与慢阻肺患者FEV1%pred关联有统计学意义(β=-0.230，-0.219，P＜0.01)，血清PC的水平对FEV1%pred的影响比8-OHdG大。其标准化回归系数均为负值，说明这两个变量与FEV1%pred呈负相关，其测定值越小，FEV1%pred越大；这两个变量测定值越大，FEV1%pred越小，结果见表 4。
表4
各指标对FEV1%pred的多元线性回归
讨论
关于慢阻肺的发病机制，虽然既往研究多集中在炎性机制和弹性蛋白酶/抗弹性蛋白酶失衡两大重要机制上，但是近年来氧化应激作为一个新的切入点，对慢阻肺发生发展的影响逐渐被人们所认识[10]。有研究证实慢阻肺患者血清、肺组织、呼出气冷凝液、诱导痰的MDA水平较对照组明显升高；急性加重期患者痰中MDA的浓度更是显著高于慢阻肺稳定期组和对照组，经治疗后痰中MDA明显减少[5, 11-15]。本研究也发现慢阻肺组血清MDA浓度明显高于对照组。可见，慢阻肺稳定期患者体内存在明显氧化应激，ROS与多不饱和脂肪酸反应产生脂质过氧化物，进而分解出大量MDA。PC是ROS对机体蛋白质氨基酸侧链氧化损伤的产物，并被认为是评价蛋白质氧化损伤程度的有效指标。Ahmad等[16]研究证实慢阻肺组血清PC浓度明显高于对照组。也有研究发现慢阻肺组骨骼肌中PC水平明显高于正常组，在慢阻肺组中血清中的PC含量明显与骨骼肌中的水平呈正相关[17]。Barreiro等[3]还发现慢阻肺组股四头肌肌酸激酶羰基化明显强于对照组，并且肌酸激酶的羰基化强度与FEV1%pred呈负相关。通过研究，我们发现慢阻肺组血清PC浓度明显高于对照组。这说明我国慢阻肺稳定期患者体内也存在蛋白质的氧化损伤。蛋白质的氧化损伤可使一些酶类、呼吸肌和外周骨骼肌蛋白质羰基化，导致蛋白/抗蛋白酶失衡、免疫反应、呼吸肌和外周骨骼肌功能障碍，促进慢阻肺的发生、发展[18-19]。ROS可直接攻击DNA，使DNA上的鸟嘌呤被氧化为8-OHdG。过去，许多学者发现慢阻肺患者尿、肺组织、淋巴细胞和痰液中8-OHdG均明显高于健康人群；尿中8-OHdG的浓度与FVC%、FEV1%pred、动脉血中的氧含量呈负相关；并且发现高水平的8-OHdG与吸烟导致的慢阻肺密切相关[20-22]。我们的研究发现慢阻肺稳定期患者血清8-OHdG的浓度明显高于对照组。这说明慢阻肺患者体内氧化应激失衡导致了DNA的氧化损伤。
TAC代表机体抗氧化防御体系的整体状态。有研究者发现慢阻肺组血清TAC浓度较对照组显著降低[5, 23]；慢阻肺急性加重期患者经治疗缓解后，痰上清液中TAC水平增高[24]。Ekin等[25]发现血清TAC浓度在慢阻肺组与对照组间差异无统计学意义，这可能是由于该研究对照组样本量较少，影响了检验效能。我们的研究也发现慢阻肺组血清TAC水平显著低于对照组，再次验证了慢阻肺患者体内TAC下降，这与慢阻肺患者机体氧化应激负荷过重，过度消耗了体内的抗氧化物有关。有研究表明长期使用抗氧化剂可以提高慢阻肺患者肺功能，延缓其下降，改善生活质量，减少慢阻肺急性加重的次数[26-27]。但抗氧化剂在临床上的使用较少，更多疗效较好的抗氧化剂有待进一步发掘，这更需要临床医生及研究者们引起重视。
香烟烟雾中含有大量自由基，它们进入机体后不能被有效清除而产生聚集。这些聚集的自由基通过对生物大分子的损伤引起气道、肺组织，甚至全身细胞、组织的氧化损伤，从而导致慢阻肺的发生和发展。Ceylan等[28]发现血清PC浓度在吸烟慢阻肺组明显高于对照组。Barreiro等[29]研究发现健康吸烟者及暴露于吸烟环境的小鼠、豚鼠呼吸肌和外周骨骼肌肌肉PC水平升高。Portao de Carlos等[30]也证实香烟烟雾暴露的小鼠肺组织和膈肌发生蛋白质羰基化。但以上研究均不是针对慢阻肺患者吸烟与未吸烟者的比较。在我们的研究中，与未吸烟亚组比较，吸烟亚组的慢阻肺患者血清PC、8-OHdG的浓度明显增高。这说明吸烟可能大大加重了人体呼吸肌和外周骨骼肌肌肉蛋白质的羰基化。而呼吸肌和外周骨骼肌的氧化损伤可以直接导致肺功能和人体运动耐力的下降，这可能与慢阻肺患者的发病机制密切相关。Yang等[31]的研究表明在吸烟的慢阻肺患者外周血单核细胞DNA中的8-OHDG水平与吸烟量呈正相关，并且与FEV1%pred呈负相关。Ceylan等[28]还发现吸烟相关的慢阻肺患者外周血单核细胞中DNA氧化损伤程度比生物燃料相关的慢阻肺患者更高，吸烟是比生物燃料导致DNA氧化损伤的更显著危险因素。有研究发现在环境烟草烟雾和砷诱导的肺气肿小鼠模型中，8-OHdG作为早期生物标志物水平升高[32]。因此，慢阻肺患者血清中8-OHdG浓度的增高，可能与吸烟导致的机体DNA的氧化损伤关系密切。对于吸烟的人群，或许我们可以通过结合监测机体8-OHdG的水平来早期发现慢阻肺。也有研究者发现吸烟会导致慢阻肺患者体内MDA浓度升高[12]，而各种抗氧化物的水平降低[33-34]。在我们的研究中，虽然慢阻肺吸烟亚组较未吸烟亚组血清MDA的浓度升高、TAC的浓度降低，但两组间差异均无统计学意义。这可能与我们的数据不符合正态分布，使用的是秩和检验，检验效能相对t检验要低，而没有检测出这两组间MDA和TAC水平差异的统计学意义有关。
我们的研究分析得出，与轻-中度亚组相比，重度-极重度亚组慢阻肺患者血清PC浓度明显升高。Torres-Ramos等[35]也发现慢阻肺患者不同气流受限程度分级血清PC水平明显高于正常组，极重度组PC浓度最高，并且比中度组高73%，表明高水平的PC与慢阻肺的严重程度密切相关。还有研究证实慢阻肺患者PC水平与FEV1%pred呈负相关[36]。在本研究中，多元线性回归分析显示慢阻肺患者血清PC的浓度与FEV1%pred呈显著负相关。在慢阻肺发病进程中，由于氧化应激导致蛋白质羰基化，使机体产生蛋白/抗蛋白酶失衡、免疫反应、呼吸肌的损害，促使慢阻肺患者肺功能的下降[18-19]。由此，我们推测PC可作为监测慢阻肺进展和氧化应激损伤的生物标志物。我们的研究未发现慢阻肺患者轻-中度、重-极重度亚组间血清MDA、8-OHdG和TAC的水平有显著差异。但是多元线性回归分析显示慢阻肺患者血清8-OHdG的表达也是FEV1%pred的影响因素，血清中8-OHdG的表达也与FEV1%pred呈负相关，并发现慢阻肺患者血清PC的表达对FEV1%pred的影响较8-OHdG大。这可能与FEV1%pred受多种因素的影响有关；也可能是由于根据我们的数据特点使用了秩和检验，检验效能低于t检验，而没有检测出慢阻肺患者轻-中度、重-极重度亚组间这三个指标水平差异的统计学意义。通过多元线性回归分析，我们的研究未发现慢阻肺患者血清MDA、TAC的水平与FEV1%pred有明显相关性。虽然也有研究发现慢阻肺患者机体的氧化和抗氧化状态与肺功能无相关性[25, 37]。但Arja等[8]的研究表明血清MDA的浓度与慢阻肺患者FEV1%pred呈负相关，认为血清MDA的增多与慢阻肺的发病进程有关，高水平的MDA增加疾病进展的风险。Ahmad等[16]发现慢阻肺患者血清TAC的水平与FEV1%pred呈显著正相关，认为较低的抗氧化能力导致更严重的气流受限。我们推测，研究结果的不一致可能是由于慢阻肺的发病机制较复杂，因而对于“易感基因”和慢阻肺分型的研究可能是未来研究的热点。
虽然血清标本容易获得，且血清标本中氧化应激反应标记物的检测方法较成熟，但无法直接反映气道和肺部局部的氧化应激情况，将来我们可以同时检测呼出气冷凝液、痰中的氧化应激反应标志物，与血清中同类标志物进行比较，以进一步探究慢阻肺的氧化应激机制。另外，本研究的局限在于饮食习惯、体育活动、糖皮质激素等药物的使用可能影响人体内氧化物和抗氧化物的水平，但这些因素难以实现一致，导致我们的许多数据呈偏态分布，可能影响检验效能。但通过我们的研究初步发现慢阻肺患者血清MDA、PC、8-OHdG的浓度明显升高，血清TAC的水平明显降低；吸烟可使慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的浓度异常升高；氧化应激导致的蛋白质羰基化和DNA氧化损伤是肺功能的影响因素，慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的浓度越高，气流受限程度越重。由此可见，慢阻肺稳定期患者体内存在明显的氧化和抗氧化失衡；吸烟引起慢阻肺患者血清PC、8-OHdG的水平异常升高，吸烟可能会加重慢阻肺患者体内蛋白质和DNA的氧化损伤；血清PC、8-OHdG的水平均与FEV1%pred呈负相关，表明氧化应激在慢阻肺的发病过程中起了重要作用。我们可以通过避免接触使机体氧化应激增强的危险因素(如吸烟)和抗氧化治疗来预防慢阻肺的发生和发展。
