引用本文： 黄进, 朱黎明, 朱应群. KLF2/RelA 比例失衡与哮喘患者中性粒细胞凋亡的关系研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2018, 17(1): 1-5. doi: 10.7507/1671-6205.201706029 复制
以往研究认为支气管哮喘（简称哮喘）的气道炎症以嗜酸性粒细胞浸润为主，但近年来中性粒细胞在哮喘气道炎症中的作用受到广泛重视[1-2]。Parfrey 等[3]认为中性粒细胞凋亡延迟是导致哮喘患者气道内中性粒细胞增多的重要原因。那外周血中性粒细胞是否也存在着凋亡延迟或减少呢？KLF2 是锌指 Krüppel 样转录因子（KLF）家族成员之一。Kuo 等[4]发现 KLF2 基因敲除小鼠体内 Fas 配体（FasL）增加明显，并认为 KFL2 敲除引起 FasL 表达增加是导致 KLF2 基因敲除小鼠 T 淋巴细胞凋亡增加的原因。而 Nie 等[5]研究发现 KLF2 的过表达可引起非小细胞肺癌细胞的凋亡。由此可见 KLF2 与凋亡的关系并不明确，KLF2 与哮喘患者中性粒细胞凋亡的关系也不清楚。转录因子 RelA（p65）属于 NF-κB/Rel 蛋白家族，是核因子-κB（NF-κB）发挥生物学功能所不可缺少的亚单位，也是一种重要的促炎因子，RelA 在延迟及抑制中性粒细胞凋亡中发挥中心性作用[6-7]。最近研究发现镰状细胞性贫血儿童患者血管内皮细胞中 KLF2/RelA 比例下降，这种 KLF2/RelA 比例的下降使血管内皮细胞呈现促炎表型，导致中风风险增高[8]。以上研究结果提示 KLF2 和 RelA 之间可以出现比例失衡，并影响炎症发展过程，其途径可能是通过调控炎症细胞凋亡来实现。本研究拟通过收集支气管哮喘患者外周血标本探讨 KLF2/RelA 比例失衡与支气管哮喘中性粒细胞凋亡的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
本试验所有病例标本均来自于 2011 年 4 月至 2012 年 4 月期间在湖南省老年医院呼吸内科、老年呼吸科和长沙市第三人民医院呼吸内科住院的哮喘急性发作期患者。其中轻度哮喘患者 13 例［男 5 例，女 8 例，平均年龄（43.4±14.6）岁］，中度哮喘 17 例［男 7 例，女 10 例，平均年龄（45.1±14.0）岁］，重度哮喘 9 例［男 4 例，女 5 例，平均年龄（44.8±17.2）岁］。哮喘患者的入选标准和病情分级参照 2013 年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的支气管哮喘防治指南，且 1 个月内未使用过静脉及口服糖皮质激素及免疫调节剂。另选同期 15 例健康体检者为对照组，男 6 例，女 9 例，平均年龄（42.9±13.0）岁。对照组肺功能均正常，支气管激发试验均阴性，且不伴有过敏性疾病，近期未使用糖皮质激素及免疫调节剂。所有受试者均不吸烟或者已戒烟半年以上，均不伴有高血压、冠心病、糖尿病、结缔组织疾病、肿瘤及急慢性感染性疾病。4 组受试者的年龄、性别差异无统计学意义。本研究符合医院伦理委员会相关要求并经审核批准，研究对象均为知情者并签署治疗协议书。
1.2 方法
1.2.1 实验材料 Ficoll-Paque Premium（GE Healthcare Life Sciences 公司）；红细胞裂解液（索莱宝生物科技有限公司）；Wright-Giemsa 染液（贝索生物技术有限公司）；AⅤ/PI 凋亡试剂盒（Invitrogen Life Technologies 公司）；ECL 发光试剂盒（Thermo Scientific Pierce 公司）；KLF2 兔多抗 IgG、P65 兔多抗 IgG（Santa Cruz 公司）；β-actin 鼠单抗 IgG（博士德生物公司）；辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG（Jackson ImmunoRearch 公司）。
1.2.2 中性粒细胞的分离纯化 抽取健康受试者和哮喘患者 2 ml 外周血，用 2 ml 生理盐水稀释，小心加至 3 ml Ficoll-Paque 淋巴细胞分离液上面，2 000 r/min 离心 15 min。小心吸取淋巴细胞层上的血浆备用，弃去淋巴细胞层和 Ficoll-Paque 淋巴细胞分离液层，细胞沉淀用 7 ml PBS 稀释混匀，1 700 r/min 离心 7 min。弃去上清，细胞沉淀内加入备用的血浆和 0.6 ml 0.6% 右旋糖酐，室温静置 30 min。吸取上清，1 000 r/min 离心 5 min 即得中性粒细胞，其中所混红细胞用红细胞裂解液（索莱宝）冰上裂解 5 min 以除去红细胞污染。分离之后的中性粒细胞用 HBSS 液悬浮成 5×103 cells/L，并立即使用。
1.2.3 流式细胞术检测中性粒细胞凋亡率 严格按照 Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit 试剂盒说明书进行。取 5×annexin-binding buffer，用去离子水稀释成 1×annexin-binding buffer，用 1×annexin-binding buffer 稀释 1 mg/ml 的 PI 储存液为 100 μg/ml 的 PI 工作液。分离所得中性粒细胞用 PBS 洗涤 1 次后，用 1×annexin-binding buffer 重悬，调整细胞浓度为 1×106，每个样本约 100 μl。每个样本加入 5 μl Alexa Fluor® 488 annexin V 和 1 μl 100 μg/ml 的 PI 工作液，室温孵育 15 min。孵育后每个样本加入 400 μl 1×annexin-binding buffer，轻轻混匀，尽快上流式细胞仪检测。
1.2.4 Western blot 检测 KLF2 和 RelA 的表达 外周血提取的中性粒细胞通过 RIPA 裂解液进行总蛋白的提取。从总蛋白中取 50 μg 蛋白通过 10% SDS-PAGE 进行蛋白分离并电转移至 PVDF 膜上，1∶200 稀释的抗 KLF2 和 RelA 抗体分别进行蛋白印迹分析，ECL 化学发光试剂盒显像，凝胶图像分析系统分析各蛋白条带灰度值，并以 β-actin 为内参标化各样品蛋白电泳条带的灰度数值。
1.3 统计学方法
所有实验数据均用均数±标准差（
）表示，应用 GraphPad Prism 5.0 统计软件分析，Bartlett 检验判断 4 组计量资料两两之间方差齐性（P>0.1，认为满足方差齐性）后，多组间比较采用单因素方差分析比较，满足方差齐性时采用 SNK-q 检验，方差不齐时采用 Dunnett’s T3 检验。相关分析采用 Pearson 相关检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 外周血中性粒细胞的分离
成功分离外周血中性粒细胞，经 Wright-Giemsa 染色鉴定后，中性粒细胞纯度达到 95% 以上。结果见图 1。
图1
分离的外周血中性粒细胞显微镜像（ Wright-Giemsa 染色 ×1 000）
2.2 哮喘患者外周血中性粒细胞凋亡率
轻、中、重度哮喘组中性粒细胞凋亡率［（4.45±0.76）%、（2.10±0.25）%、（1.81±0.67）%］较对照组［（5.36±0.57）%］显著降低（P<0.01），中、重度哮喘组中性粒细胞凋亡率较轻度哮喘组显著降低（P<0.01），但中度哮喘组与重度哮喘组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图 2。
图2
哮喘患者外周血中性粒细胞的凋亡率
a~d．对照组以及轻、中、重度哮喘组外周血中性粒细胞流式细胞检测像；e．流式细胞检测结果
2.3 哮喘患者外周血中性粒细胞 KLF2/RelA 比值变化
轻、中、重度哮喘组 KLF2/RelA 比值（0.667±0.351、0.384±0.203、0.536±0.293）较对照组（4.038±2.011）降低（P<0.01），轻、中、重度哮喘组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图 3。
图3
哮喘患者外周血中性粒细胞 KLF2/RelA 比值变化
a. Western blot 检测像；b. Western blot 检测结果
2.4 KLF2/RelA 比值与中性粒细胞凋亡率之间的相关性分析
KLF2/RelA 蛋白比值与中性粒细胞凋亡率做 Pearson 相关性分析（r=0.592 0，P<0.000 1），提示两者之间呈正相关。结果见图 4。
图4
KLF2/RelA 比值与中性粒细胞凋亡的关系
3 讨论
多种炎症细胞和结构细胞参与支气管哮喘的气道炎症，中性粒细胞作为支气管哮喘发病中的一种重要的炎症细胞，在哮喘发病机制中的作用越来越受到人们的重视。哮喘患者气道中性粒细胞较健康人增多，并且与哮喘严重程度呈正相关[9-10]。关于哮喘气道中性粒细胞增多的机制，目前认为与中性粒细胞凋亡延迟密切相关[3]，但哮喘患者外周血中性粒细胞是否也存在中性粒细胞凋亡延迟，以使中性粒细胞有更多的机会向气道聚集呢？我们的研究发现哮喘患者外周血中性粒细胞凋亡率确实较对照组中性粒细胞凋亡率减少。
1995 年 Anderson 等[11]首次分离出 KLF2，因发现KLF2 在肺部表达丰富，当时也称 KLF2 为 LKLF（lung Krüppel-like transcription factor）。研究发现 KLF2作为一种转录因子参与人体的多种病理生理过程，如炎症反应[12]、增殖与分化[13-14]、黏附及迁移[15-16]等，但 KLF2 与凋亡的关系目前存在争议[4-5]。本研究发现轻、中、重度哮喘患者外周血中性粒细胞 KLF2 较对照组显著降低（P<0.01），但通过相关性分析发现 KLF2 的表达变化与中性粒细胞凋亡率之间并不存在相关性（r=0.120 8，P>0.05）（结果中未显示）。Carlson 等[17]也发现 KLF2 并不能明显地维持 T 细胞的静息状态与生存，KLF2 的缺失也并不导致 T 细胞的凋亡增加，并且认为 KLF2 在淋巴细胞黏附迁移中发挥着更大的作用。
RelA 是一种关键的抗凋亡信号，在细胞凋亡调控中发挥中心性作用，能够上调多种抗凋亡蛋白来抑制细胞凋亡[6-7]。本研究发现，支气管哮喘组 RelA 的表达较对照组上升（P<0.01），并且随着哮喘严重程度的加重，RelA 的表达呈上升趋势，各组间比较差异存在统计学意义（P<0.01）。相关性分析发现 RelA 的表达与中性粒细胞凋亡率之间存在负相关关系（r=–0.807 9，P<0.001）。以上结果均提示 RelA 可能抑制哮喘患者外周血中性粒细胞的凋亡。
近来研究发现 KLF2 和 RelA 之间保持着一种平衡，如果这种平衡被打破即可引起机体的稳态失衡，表现为抗炎或促炎表型[8]。通过本试验，我们发现哮喘患者中性粒细胞内确实存在着 KLF2/RelA 比例失衡，而且这种比例失衡与中性粒细胞凋亡率呈正相关，但 KLF2 与中性粒细胞凋亡之间并不存在相关性。Sheppard 等[18]发现血管内皮细胞在炎症状态时 KLF2 能通过与 RelA 竞争辅转录因子 CBP/P300 从而减少 NF-κB 依赖的下游炎症基因表达，这提示我们 KLF2/RelA 可能为一对相互制约的转录因子。而目前多项研究均发现 KLF2 在维持细胞稳态中发挥重要的作用[19-20]，这提示 RelA 在哮喘患者中性粒细胞凋亡中发挥着主导作用，而 KLF2 可能是通过与 RelA 竞争辅转录因子 CBP/P300 控制着中性粒细胞的凋亡过程，从而抑制 RelA 所致中性粒细胞生存期的过分延长。
综上所述，本研究结果提示哮喘患者外周血中性粒细胞存在 KLF2/RelA 比例失衡，并且 KLF2/RelA 比例失衡可能是导致哮喘患者外周血中性粒细胞凋亡减少的机制之一。
以往研究认为支气管哮喘（简称哮喘）的气道炎症以嗜酸性粒细胞浸润为主，但近年来中性粒细胞在哮喘气道炎症中的作用受到广泛重视[1-2]。Parfrey 等[3]认为中性粒细胞凋亡延迟是导致哮喘患者气道内中性粒细胞增多的重要原因。那外周血中性粒细胞是否也存在着凋亡延迟或减少呢？KLF2 是锌指 Krüppel 样转录因子（KLF）家族成员之一。Kuo 等[4]发现 KLF2 基因敲除小鼠体内 Fas 配体（FasL）增加明显，并认为 KFL2 敲除引起 FasL 表达增加是导致 KLF2 基因敲除小鼠 T 淋巴细胞凋亡增加的原因。而 Nie 等[5]研究发现 KLF2 的过表达可引起非小细胞肺癌细胞的凋亡。由此可见 KLF2 与凋亡的关系并不明确，KLF2 与哮喘患者中性粒细胞凋亡的关系也不清楚。转录因子 RelA（p65）属于 NF-κB/Rel 蛋白家族，是核因子-κB（NF-κB）发挥生物学功能所不可缺少的亚单位，也是一种重要的促炎因子，RelA 在延迟及抑制中性粒细胞凋亡中发挥中心性作用[6-7]。最近研究发现镰状细胞性贫血儿童患者血管内皮细胞中 KLF2/RelA 比例下降，这种 KLF2/RelA 比例的下降使血管内皮细胞呈现促炎表型，导致中风风险增高[8]。以上研究结果提示 KLF2 和 RelA 之间可以出现比例失衡，并影响炎症发展过程，其途径可能是通过调控炎症细胞凋亡来实现。本研究拟通过收集支气管哮喘患者外周血标本探讨 KLF2/RelA 比例失衡与支气管哮喘中性粒细胞凋亡的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
本试验所有病例标本均来自于 2011 年 4 月至 2012 年 4 月期间在湖南省老年医院呼吸内科、老年呼吸科和长沙市第三人民医院呼吸内科住院的哮喘急性发作期患者。其中轻度哮喘患者 13 例［男 5 例，女 8 例，平均年龄（43.4±14.6）岁］，中度哮喘 17 例［男 7 例，女 10 例，平均年龄（45.1±14.0）岁］，重度哮喘 9 例［男 4 例，女 5 例，平均年龄（44.8±17.2）岁］。哮喘患者的入选标准和病情分级参照 2013 年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的支气管哮喘防治指南，且 1 个月内未使用过静脉及口服糖皮质激素及免疫调节剂。另选同期 15 例健康体检者为对照组，男 6 例，女 9 例，平均年龄（42.9±13.0）岁。对照组肺功能均正常，支气管激发试验均阴性，且不伴有过敏性疾病，近期未使用糖皮质激素及免疫调节剂。所有受试者均不吸烟或者已戒烟半年以上，均不伴有高血压、冠心病、糖尿病、结缔组织疾病、肿瘤及急慢性感染性疾病。4 组受试者的年龄、性别差异无统计学意义。本研究符合医院伦理委员会相关要求并经审核批准，研究对象均为知情者并签署治疗协议书。
1.2 方法
1.2.1 实验材料 Ficoll-Paque Premium（GE Healthcare Life Sciences 公司）；红细胞裂解液（索莱宝生物科技有限公司）；Wright-Giemsa 染液（贝索生物技术有限公司）；AⅤ/PI 凋亡试剂盒（Invitrogen Life Technologies 公司）；ECL 发光试剂盒（Thermo Scientific Pierce 公司）；KLF2 兔多抗 IgG、P65 兔多抗 IgG（Santa Cruz 公司）；β-actin 鼠单抗 IgG（博士德生物公司）；辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG（Jackson ImmunoRearch 公司）。
1.2.2 中性粒细胞的分离纯化 抽取健康受试者和哮喘患者 2 ml 外周血，用 2 ml 生理盐水稀释，小心加至 3 ml Ficoll-Paque 淋巴细胞分离液上面，2 000 r/min 离心 15 min。小心吸取淋巴细胞层上的血浆备用，弃去淋巴细胞层和 Ficoll-Paque 淋巴细胞分离液层，细胞沉淀用 7 ml PBS 稀释混匀，1 700 r/min 离心 7 min。弃去上清，细胞沉淀内加入备用的血浆和 0.6 ml 0.6% 右旋糖酐，室温静置 30 min。吸取上清，1 000 r/min 离心 5 min 即得中性粒细胞，其中所混红细胞用红细胞裂解液（索莱宝）冰上裂解 5 min 以除去红细胞污染。分离之后的中性粒细胞用 HBSS 液悬浮成 5×103 cells/L，并立即使用。
1.2.3 流式细胞术检测中性粒细胞凋亡率 严格按照 Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit 试剂盒说明书进行。取 5×annexin-binding buffer，用去离子水稀释成 1×annexin-binding buffer，用 1×annexin-binding buffer 稀释 1 mg/ml 的 PI 储存液为 100 μg/ml 的 PI 工作液。分离所得中性粒细胞用 PBS 洗涤 1 次后，用 1×annexin-binding buffer 重悬，调整细胞浓度为 1×106，每个样本约 100 μl。每个样本加入 5 μl Alexa Fluor® 488 annexin V 和 1 μl 100 μg/ml 的 PI 工作液，室温孵育 15 min。孵育后每个样本加入 400 μl 1×annexin-binding buffer，轻轻混匀，尽快上流式细胞仪检测。
1.2.4 Western blot 检测 KLF2 和 RelA 的表达 外周血提取的中性粒细胞通过 RIPA 裂解液进行总蛋白的提取。从总蛋白中取 50 μg 蛋白通过 10% SDS-PAGE 进行蛋白分离并电转移至 PVDF 膜上，1∶200 稀释的抗 KLF2 和 RelA 抗体分别进行蛋白印迹分析，ECL 化学发光试剂盒显像，凝胶图像分析系统分析各蛋白条带灰度值，并以 β-actin 为内参标化各样品蛋白电泳条带的灰度数值。
1.3 统计学方法
所有实验数据均用均数±标准差（
）表示，应用 GraphPad Prism 5.0 统计软件分析，Bartlett 检验判断 4 组计量资料两两之间方差齐性（P>0.1，认为满足方差齐性）后，多组间比较采用单因素方差分析比较，满足方差齐性时采用 SNK-q 检验，方差不齐时采用 Dunnett’s T3 检验。相关分析采用 Pearson 相关检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 外周血中性粒细胞的分离
成功分离外周血中性粒细胞，经 Wright-Giemsa 染色鉴定后，中性粒细胞纯度达到 95% 以上。结果见图 1。
图1
分离的外周血中性粒细胞显微镜像（ Wright-Giemsa 染色 ×1 000）
2.2 哮喘患者外周血中性粒细胞凋亡率
轻、中、重度哮喘组中性粒细胞凋亡率［（4.45±0.76）%、（2.10±0.25）%、（1.81±0.67）%］较对照组［（5.36±0.57）%］显著降低（P<0.01），中、重度哮喘组中性粒细胞凋亡率较轻度哮喘组显著降低（P<0.01），但中度哮喘组与重度哮喘组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图 2。
图2
哮喘患者外周血中性粒细胞的凋亡率
a~d．对照组以及轻、中、重度哮喘组外周血中性粒细胞流式细胞检测像；e．流式细胞检测结果
2.3 哮喘患者外周血中性粒细胞 KLF2/RelA 比值变化
轻、中、重度哮喘组 KLF2/RelA 比值（0.667±0.351、0.384±0.203、0.536±0.293）较对照组（4.038±2.011）降低（P<0.01），轻、中、重度哮喘组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图 3。
图3
哮喘患者外周血中性粒细胞 KLF2/RelA 比值变化
a. Western blot 检测像；b. Western blot 检测结果
2.4 KLF2/RelA 比值与中性粒细胞凋亡率之间的相关性分析
KLF2/RelA 蛋白比值与中性粒细胞凋亡率做 Pearson 相关性分析（r=0.592 0，P<0.000 1），提示两者之间呈正相关。结果见图 4。
图4
KLF2/RelA 比值与中性粒细胞凋亡的关系
3 讨论
多种炎症细胞和结构细胞参与支气管哮喘的气道炎症，中性粒细胞作为支气管哮喘发病中的一种重要的炎症细胞，在哮喘发病机制中的作用越来越受到人们的重视。哮喘患者气道中性粒细胞较健康人增多，并且与哮喘严重程度呈正相关[9-10]。关于哮喘气道中性粒细胞增多的机制，目前认为与中性粒细胞凋亡延迟密切相关[3]，但哮喘患者外周血中性粒细胞是否也存在中性粒细胞凋亡延迟，以使中性粒细胞有更多的机会向气道聚集呢？我们的研究发现哮喘患者外周血中性粒细胞凋亡率确实较对照组中性粒细胞凋亡率减少。
1995 年 Anderson 等[11]首次分离出 KLF2，因发现KLF2 在肺部表达丰富，当时也称 KLF2 为 LKLF（lung Krüppel-like transcription factor）。研究发现 KLF2作为一种转录因子参与人体的多种病理生理过程，如炎症反应[12]、增殖与分化[13-14]、黏附及迁移[15-16]等，但 KLF2 与凋亡的关系目前存在争议[4-5]。本研究发现轻、中、重度哮喘患者外周血中性粒细胞 KLF2 较对照组显著降低（P<0.01），但通过相关性分析发现 KLF2 的表达变化与中性粒细胞凋亡率之间并不存在相关性（r=0.120 8，P>0.05）（结果中未显示）。Carlson 等[17]也发现 KLF2 并不能明显地维持 T 细胞的静息状态与生存，KLF2 的缺失也并不导致 T 细胞的凋亡增加，并且认为 KLF2 在淋巴细胞黏附迁移中发挥着更大的作用。
RelA 是一种关键的抗凋亡信号，在细胞凋亡调控中发挥中心性作用，能够上调多种抗凋亡蛋白来抑制细胞凋亡[6-7]。本研究发现，支气管哮喘组 RelA 的表达较对照组上升（P<0.01），并且随着哮喘严重程度的加重，RelA 的表达呈上升趋势，各组间比较差异存在统计学意义（P<0.01）。相关性分析发现 RelA 的表达与中性粒细胞凋亡率之间存在负相关关系（r=–0.807 9，P<0.001）。以上结果均提示 RelA 可能抑制哮喘患者外周血中性粒细胞的凋亡。
近来研究发现 KLF2 和 RelA 之间保持着一种平衡，如果这种平衡被打破即可引起机体的稳态失衡，表现为抗炎或促炎表型[8]。通过本试验，我们发现哮喘患者中性粒细胞内确实存在着 KLF2/RelA 比例失衡，而且这种比例失衡与中性粒细胞凋亡率呈正相关，但 KLF2 与中性粒细胞凋亡之间并不存在相关性。Sheppard 等[18]发现血管内皮细胞在炎症状态时 KLF2 能通过与 RelA 竞争辅转录因子 CBP/P300 从而减少 NF-κB 依赖的下游炎症基因表达，这提示我们 KLF2/RelA 可能为一对相互制约的转录因子。而目前多项研究均发现 KLF2 在维持细胞稳态中发挥重要的作用[19-20]，这提示 RelA 在哮喘患者中性粒细胞凋亡中发挥着主导作用，而 KLF2 可能是通过与 RelA 竞争辅转录因子 CBP/P300 控制着中性粒细胞的凋亡过程，从而抑制 RelA 所致中性粒细胞生存期的过分延长。
综上所述，本研究结果提示哮喘患者外周血中性粒细胞存在 KLF2/RelA 比例失衡，并且 KLF2/RelA 比例失衡可能是导致哮喘患者外周血中性粒细胞凋亡减少的机制之一。
