引用本文： 刘春雨, 高占成. 抑癌基因 PTEN 与特发性肺间质纤维化. 中国呼吸与危重监护杂志, 2018, 17(2): 200-205. doi: 10.7507/1671-6205.201708021 复制
特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IFP）是一种呈慢性进展不可逆和致死性的特发性间质性肺病，肺间质成纤维细胞广泛增殖，细胞外基质沉积并最终导致肺结构重塑或破坏。其发病机制仍不明确，临床表现具有异质性，尚缺乏早期诊断方法[1-6]。过去 10 年间，IPF 总体发病率呈上升趋势，年发病率为（4.6～16.3）/100 000，患病率（13～20）/100 000，男性发病率高于女性（1.5～1.7∶1），不同人种间无显著差异，吸烟和有害粉尘暴露是独立危险因素[7-8]。IPF 发病率随年龄逐渐升高，平均就诊年龄为 66 岁（55～75 岁），目前认为 IPF 是年龄相关性疾病，具体机制尚不明确，可能与端粒驱动、表观修饰异常有关[1, 9]。明确诊断后该病的平均生存期约为 2.5～5 年[1]。尚无特效药物能够逆转或终止其纤维化进展。第 10 号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是人类恶性肿瘤中突变频率最高的抑癌基因之一，在早期胚胎分化、发育中起重要作用。PTEN 蛋白双特异性磷酸酶活性广泛作用于细胞内多条信号通路，在细胞凋亡、细胞周期调控、细胞迁移等过程中均发挥关键作用，是肿瘤领域研究的热点。近年来，实验研究逐渐发现 PTEN 基因在 IFP 中也发挥着重要作用。本文就 PTEN 抑癌基因与 IPF 发病机制之间的相关性进行文献综述，以期为深入探讨 IPF 致病机制及治疗靶点提供新思路。
1 PTEN 基因结构、功能及其组织分布
PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）即第 10 号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因，是在 1997 年由三个独立的研究小组发现的位于人第 10 号染色体（10q23.3）上的抑癌基因，又名多种进展期癌中突变基因 1（mutated in multiple advanced cancers，MMAC1）或 TGF-β 调控和上皮细胞富集磷酸酶（TGF-β regulated and epithelial-cell-enriched phosphatase，TEP1）[10-12]。PTEN 基因是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，其缺失、突变和失活与多种恶性肿瘤包括神经胶质母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌等的发生密切相关[10]。
1.1 PTEN 基因结构
该基因由 9 个外显子和 8 个内含子组成，全长约 200 kb，其 cDNA 由 1 209 个核苷酸构成，编码的 PTEN 蛋白由 403 个氨基酸组成。PTEN 蛋白由位于 N 端的磷酸酯酶区和位于 C 端的 C2 结构域组成。磷酸酯酶区包含蛋白酪氨酸磷酸酯酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）特征序列，以及与痘苗病毒 H1 相关双特异性蛋白磷酸酶（Vaccinia H1-related，VHR）相似的结构区，PTEN 磷酸酶活性中心比 VHR 与 PTP 大，更加利于其与底物的结合。C 端的 C2 结构域结合磷脂膜，这种结合不依赖钙离子，介导细胞膜募集信号蛋白，对 PTEN 抑癌功能起重要作用。PTEN 蛋白 N 端尾部短，C 端尾部长，有富含丝/苏氨酸残基的 PEST 序列和 PDZ 结合结构域[13]。PTEN 基因经可变剪切与多个翻译起始密码子翻译产生多种 PTEN 蛋白亚型，Hopkins 等[14]发现一种在经典 PTEN 蛋白 N 端增加 173 个氨基酸的翻译变异体，该种变异体是经细胞旁分泌后可穿透细胞膜的脂质磷酸酶，拮抗 PI3K 信号通路并诱导肿瘤细胞死亡。另一项研究发现该变异体与经典 PTEN 形成复合体，增加 PTEN 诱导推定激酶 1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）蛋白水平，维持线粒体稳定，促进线粒体产能[15]。
1.2 PTEN 蛋白分布
PTEN 与张力蛋白（细胞骨架黏着斑相关蛋白）、辅助蛋白（突触囊泡运输相关蛋白）有同源性，在细胞质广泛表达。PTEN 蛋白在细胞核中以单泛素化形式存在，其特殊位点赖氨酸残基泛素化可调节 PTEN 在细胞核-细胞质中的分布，泛素特异性蛋白酶 7（ubiquitin specific protease 7，USP7）辅助 PTEN 蛋白进入细胞核，并与早幼粒细胞白血病体（functional promyelocytic leukaemia protein nuclear bodies，PML nuclear bodies）异常分布于细胞核中[16-18]。
1.3 PTEN 蛋白功能
PTEN 双特异性磷酸酶的主要底物是磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate，PIP3），通过 PIP3 去磷酸化为磷脂酰肌醇 4,5-双磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2），抑制丝/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）活性，负性调节 PI3K-AKT 通路，影响细胞能量代谢、细胞生长、细胞凋亡和迁移。PTEN 蛋白酪氨酸磷酸酶作用于黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）以及 SH2 包含蛋白（SH2 containing protein，Shc），通过去磷酸化作用调节细胞通路，影响细胞黏附和迁移[19]。PTEN 蛋白在细胞核内调节着丝点稳定性，维持浓缩染色质结构，修复损伤的双链 DNA，调节细胞周期、调控细胞衰老[20-24]。
PTEN 蛋白在整个胚胎发育期广泛、高度表达，早在 3.5 d 囊胚期的胚胎组织以及胚外组织中即可检测到，是胚胎细胞增殖、发育、迁移、死亡等一系列生长发育活动的重要标志。PTEN 基因表达调控 T 细胞增殖与功能，参与 NK 细胞发育以及抗体类型转换，也参与肺脏发育、代谢和功能[25]。
2 PTEN 抑癌基因在 IPF 发病机制中的作用
2.1 IPF 发病机制现状
2.1.1 肺泡上皮细胞微损伤
肺泡上皮细胞位于肺泡腔与肺间质间，是肺天然的物理屏障与免疫屏障。持续刺激导致肺泡上皮细胞损伤以及肺泡结构破坏，肺泡再生障碍以及异常激活是引起 IPF 的始动因素。编码调节肺泡上皮细胞抗压能力、表面活性物质稳定性，染色体端粒酶长度等基因突变导致肺泡上皮细胞对外界刺激敏感性增加[26]。环境中金属或有机成分的可吸入颗粒增加 IPF 发病风险，EB 病毒、疱疹病毒等病毒感染导致潜在的肺泡上皮损伤[8, 27]。慢性病如胃食管反流病、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症与肺泡低通气等对 IPF 发生、发展有促进作用[28-29]。衰老导致肺泡上皮细胞老化以及再生能力衰竭在肺纤维化中亦起到一定作用[30]。
具有遗传易感性个体暴露在特定环境中，在自身基础疾病相互作用下肺泡上皮持续受到刺激，肺泡上皮损伤再生修复功能受损，最终导致肺泡完整性破坏、肺泡陷闭，启动纤维化程序，发生级联效应。
2.1.2 肺泡上皮细胞异常激活
肺泡上皮损伤后释放炎症因子导致毛细血管通透性增加，纤维蛋白原、纤维连接蛋白渗出至肺间质及肺泡腔，形成最初暂时的细胞外基质，间质内其他细胞成分对细胞增殖信号产生应答，迁移至裸露肺泡基底膜维持上皮屏障，释放细胞因子刺激肺泡间质细胞迁移参与修复。激活的凝血因子 X（factor X，FX）使凝血酶原转化为凝血酶，剪切纤维蛋白原为纤维蛋白。肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells，AEC）分泌纤溶酶原激活物抑制因子 1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI1），形成抗纤溶和高凝的微环境，使基质降解减少。Ⅱ型肺泡上皮细胞分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞受到抑制，细胞内促凋亡蛋白[半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）和 Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表达升高，抗凋亡作用的 B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2 gene，Bcl-2）蛋白表达降低，凋亡增加[31]。晚期糖机化终产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）和 CD151 等减少可抑制Ⅰ型肺泡上皮识别基底膜，出现再上皮化障碍[32-33]。肺泡内含 SH2 结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶-2（SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2，Shp2）蛋白减少导致表面活性物质稳定性降低，促进上皮细胞凋亡[34]。
细胞外基质和凝血级联反应中释放的活性蛋白酶参与纤维化组织重塑以及上皮细胞向间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。凝血酶和活化 FX 通过蛋白酶活性受体-1 诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化[32]。同时涉及形态发生相关细胞因子 TGF-β、shh、Wnt/β-catenin、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor ，FGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、Notch 等在此过程中被激活，促进 EMT 转化增加[35]。
EMT 是极化的上皮细胞转变为间叶细胞，通常发生在胚胎细胞层运动和肿瘤细胞浸润中，是上皮细胞可塑性的表现。EMT 过程中上皮细胞相关蛋白上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin）和闭锁小带（zonula occludens，ZO-1）表达下调，间质细胞特征蛋白波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和纤连蛋白（fibronectin）表达上调[36]。EMT 直接增加间质细胞数量，细胞本身合成细胞外基质能力增强，释放大量趋化因子，细胞因子激活，募集附近的成纤维细胞使信号级联放大。
2.1.3 上皮细胞-成纤维细胞信号关联并激活成纤维细胞增殖
肺泡上皮损伤后可分泌 TGF-β，能够直接促进纤维化[37]。具体表现为上皮细胞表面传感系统整合素（αvβ6、αvβ6 和 α3β1）和钙黏着蛋白（如 E-cadherin/β-catenin）与基质中促炎因子溶血磷脂受体蛋白 2（LPA2）、Xa 及前体 TGF-β1 联合，将其激活[38, 41]。同时细胞表面 Wnt 受体 LRP6 磷酸化增加，通过经典 Wnt 通路，产生酪氨酸磷酸化 β-catenin 以及磷酸化 Smads 等转录复合体，积累于细胞核，改变其基因转录状态，释放炎症因子共同活化成纤维细胞，同时使其自身向肌成纤维细胞转变[40, 42]。另外，基质中 TGF-β 诱导上皮细胞能够高表达 shh 蛋白，通过正反馈模式进一步促进成纤维细胞 TGF-β 和 α-SMA 高表达，进一步增强纤维化效应[43-44]。
成纤维细胞与肌成纤维细胞过度合成和分泌细胞外基质，导致肺结构重塑，是 IPF 的最终表现。IPF 肺间质中肌成纤维细胞来源于三种成分：（1）外周循环血中一组特殊的白细胞亚群，能够特异性表达 CD45、CD34 和纤维连接蛋白，通过细胞因子受体 CXCR4 识别 IPF 中 AEC 表达的 CXCL12 募集于肺泡间质[45]；（2）Ⅲ型肺泡上皮细胞，转化为能够表达 α-SMA 和神经钙黏着蛋白（N-cadherin）的成纤维细胞；（3）肺间质组织中固有的成纤维细胞，在局部促纤维化生长因子 TGF-β、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）和肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）作用下转变为肌成纤维细胞[46]。
2.2 PTEN 基因在 IPF 发病机制中的作用
PTEN 基因功能异常在遗传性和散发的恶性肿瘤中均扮演重要“角色”。在肿瘤发生过程中，PTEN 基因突变或缺失直接导致 PTEN 蛋白双特异性磷酸酶功能缺失，直接促进细胞增值、侵袭，抑制细胞发生凋亡。P53、PPARγ、NF-kB 等在转录水平上调节 PTEN 基因的表达，非编码 RNA 调节转录后 mRNA 水平，PTEN 蛋白的泛素化、乙酰化以及与其他细胞内蛋白相互作用均与肿瘤的发生密切相关[47]。在 IPF 发生过程中，成纤维细胞广泛增殖、迁移、抗凋亡，其本身即具有恶性疾病特征，而 IPF 患者本身易同时合并肺癌，与此同时，抑癌基因 PTEN 已被证实在 IPF 的发生、发展中起到重要作用，现总结如下。
2.2.1 PTEN 蛋白在 IPF 中活性显著缺失
PTEN 在细胞内作用广泛，针对蛋白表达的调控是复杂且精细的。多种信号通路调节 PTEN 基因转录，miRNA 和 ceRNA 调节 PTEN 转录后 mRNA 稳定性，PTEN 蛋白的磷酸化、乙酰化等可正性或负性调节 PTEN 蛋白稳定性，酶活性以及细胞内定位[25]。PTEN 基因表达、PTEN 蛋白水平、PTEN 蛋白磷酸酶活性在 IPF 来源的成纤维细胞中较正常成纤维细胞显著降低[48]。IPF 成纤维细胞灶中与 PTEN 结合的膜蛋白微囊蛋白 1（caveolin-1）低表达，从而导致细胞膜微环境中 PTEN 磷酸酶活性的相对缺失，进而导致 PI3K/AKT 异常激活[49]。PTEN 在 IPF 中功能缺失还与翻译后修饰有关，Geng 等[50]发现 USP13 与 PTEN 相互作用，并介导 PTEN 蛋白在 IPF 成纤维细胞中泛素化。
2.2.2 PTEN 蛋白缺失具有显著致纤维化作用
（1）肺泡上皮完整性被破坏：小鼠支气管肺泡上皮特异性敲除 PTEN 基因后发现肺泡上皮紧密连接（TJs）分解及基底膜降解增加，上皮来源的肌成纤维细胞增加。博来霉素处理后上皮细胞磷酸化 AKT、磷酸化 S6K、Snail 和基质金属蛋白酶表达增加，紧密连接蛋白-4（Claudin-4）、E-cadherin、β-catenin 和层黏连蛋白 β1（laminin-β1）表达下降[51]。在 IPF 中，PTEN 对肺泡上皮细胞完整性起关键的门控作用，PTEN 缺失使上皮细胞对损伤刺激因素敏感性增加。
（2）促进成纤维细胞分化，促进成纤维细胞侵袭、迁移：PTEN 基因敲除后成纤维细胞 α-SMA、胶原蛋白表达上调，PTEN 基因过表达后抑制 TGF-β 诱导其分化为肌成纤维细胞[48]。Geng 等[52]进一步研究表明 PTEN 表达缺失使正常的成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，细胞增殖加快，侵袭、迁移能力增加，并且低氧可下调 PTEN 表达。对成纤维细胞侵袭表型进行转录组测定，PTEN 基因与基质金属蛋白酶 13（matrix metalloproteinase，MMP-13）、TGF-β1、caveolin-1 和分泌型卷曲相关蛋白 1（secreted frizzled-related proteins 1，Sfrp1）对成纤维细胞侵袭行有明显调控作用[53]。动物实验发现 PTEN 基因缺失小鼠博来霉素诱导发生 IPF 后死亡率明显增加，PTEN 缺失使肺泡上皮细胞易损伤，同时导致参与修复的成纤维细胞功能异常（图 1）。PTEN 基因及其功能在肺间质纤维化发病的多个关键环节起到重要作用。
图1
PTEN 基因在 IFP 发病过程中的作用
PTEN 对肺泡上皮细胞稳定性起到门控作用，PTEN 缺失促进损伤导致基底膜降解，紧密连接，抑制上皮细胞发生 EMT，抑制肺间质来源的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞、分泌细胞外基质，促进外周的巨噬细胞、T 淋巴细胞募集至成纤维细胞灶参与损伤引起的炎症与修复（→为促进作用，┻为抑制或拮抗作用）
（3）诱导成纤维细胞抗凋亡表型，抑制成纤维细胞发生自噬：细胞外基质收缩可激活正常成纤维细胞内 PTEN 蛋白，发挥双特异性磷酸酶活性，拮抗 PI3K 活性，下调磷酸化 AKT 水平，诱导成纤维细胞发生凋亡。而 PTEN 基因缺失的成纤维细胞通过 β1 整合素激活 PI3K-Akt-S6K1 通路，使得磷酸化 AKT 水平升高，使成纤维细胞具有抗胶原诱导的细胞凋亡表型，并通过激活 PI3K-AKT-mTOR 途径，抑制成纤维细胞自噬活性，最终导致 IPF 中成纤维细胞在 ECM 异常增殖（图 2）[54-56]。
Fox3a 转录因子通过上调细胞周期抑制因子 P27 阻抑有丝分裂细胞 G1 期向 S 期过渡。Fox3a 与 caveolin-1 启动子区结合后，可增加其转录和蛋白表达，caveolin-1 过表达可增加 Fas 水平以及 caspase-3/7 活性，促进成纤维细胞发生Ⅰ型胶原诱导的凋亡。而 IPF 患者肺组织活检中发现 caveolin-1、Fas、caspase-3/7 表达下降，PTEN 缺失导致高活性 AKT 磷酸化 Fox3a 而使其失去活性，导致微管相关蛋白 1a/1b 轻链 3B（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3B，LC3-B）转录减少，降低成纤维细胞自噬活性，促进其在胶原基质中增殖（图 2）[57-59]。
（4）纤维化相关细胞因子分泌失衡：IPF 肺纤维化发生初期，损伤修复反应中亦产生抑制纤维化的细胞因子（如前列腺素 E2），但研究发现纤维化反应中的成纤维细胞对前列腺素 E2 并不敏感，主要是由于具有高度活性的磷酸化 AKT 介导前列腺素 E2 受体启动子区甲基化，使细胞合成前列腺素 E2 受体减少，降低了细胞对基质中前列腺素 E2 的敏感性（图 2）[60]。
图2
PTEN 基因促纤维化的分子机制
PTEN 特异性双磷酸酶活性作用于底物 PIP3，去磷酸化从而抑制 PI3K-AKT 通路。当 PTEN 缺乏时，细胞 AKT 活性增强，通过磷酸化使活性 FoxO3a 减少，P27 转录减少，对 CDK 抑制作用减弱，促进细胞增殖；活性 FoxO3a 的降低减少 Caveolin-1 转录与表达，降低 Fas 水平，降低 Caspase-3/7 活性，诱导抗凋亡表型；FoxO3a 降低通过减少 LC3-B 转录抑制细胞自噬；磷酸化 AKT 激活下游 mTOR，通过抑制 LC3-B 降低细胞自噬活性。活性 AKT 通过前列腺素 E2 受体基因上启动子区甲基化作用，减少前列腺素 E2 受体表达，使细胞对抗纤维化细胞因子前列腺素 E2 不敏感
骨髓 PTEN 缺陷小鼠在应用博来霉素诱导后，肺组织表现出 TGF-β1 活化，胶原沉积增加，前胶原蛋白、赖氨酰氧化酶表达增加；肺泡灌洗液中巨噬细胞、T 细胞数量下降，炎症细胞募集功能受损（图 1），肺巨噬细胞极化异常，促纤维化因子 IL-6 以及 TNF-α 合成、分泌增加[61]。PTEN 缺失可导致细胞炎症反应失衡，促纤维化因子释放增多，抗纤维化因子相对不足，维持纤维化状态。
应用 VEGF 抑制剂治疗博来霉素诱导 IPF 蛋白组学的研究显示，PI3K-Akt 信号通路与 Wnt 信号通路有显著促纤维化作用；自然杀伤细胞信号通路（NK signaling）与 PTEN 信号通路具有显著抗纤维化作用，VEGF 抑制剂诱导 SHIP-1 过表达，导致 PTEN 信号增加，介导抗纤维化效应；雷帕霉素（mTOR）和细胞外信号调节激酶（ERK）为促纤维化和抗纤维化反应的关键介质，PTEN 通过抑制 PI3K-AKT-mTOR 通路调节纤维化反应中 mTOR[62]。
3 结论与展望
PTEN 作为具有特异性双磷酸酶活性的抑癌基因，通过去磷酸化细胞内重要信号分子如 PIP3，抑制 PI3K-AKT 信号通路，抑制活化 AKT 下游细胞信号分子。PTEN 蛋白及其活性在 IPF 时显著降低，PTEN 缺失破坏肺泡上皮细胞完整性，促进成纤维细胞分化、迁移，抑制成纤维细胞发生自噬、凋亡，导致细胞炎症反应失衡，促纤维化细胞因子分泌增加，抗纤维化细胞因子分泌不足。PTEN 基因在 IPF 发生、发展过程中起重要作用，为该病的基因治疗提供了新靶点。
特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IFP）是一种呈慢性进展不可逆和致死性的特发性间质性肺病，肺间质成纤维细胞广泛增殖，细胞外基质沉积并最终导致肺结构重塑或破坏。其发病机制仍不明确，临床表现具有异质性，尚缺乏早期诊断方法[1-6]。过去 10 年间，IPF 总体发病率呈上升趋势，年发病率为（4.6～16.3）/100 000，患病率（13～20）/100 000，男性发病率高于女性（1.5～1.7∶1），不同人种间无显著差异，吸烟和有害粉尘暴露是独立危险因素[7-8]。IPF 发病率随年龄逐渐升高，平均就诊年龄为 66 岁（55～75 岁），目前认为 IPF 是年龄相关性疾病，具体机制尚不明确，可能与端粒驱动、表观修饰异常有关[1, 9]。明确诊断后该病的平均生存期约为 2.5～5 年[1]。尚无特效药物能够逆转或终止其纤维化进展。第 10 号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是人类恶性肿瘤中突变频率最高的抑癌基因之一，在早期胚胎分化、发育中起重要作用。PTEN 蛋白双特异性磷酸酶活性广泛作用于细胞内多条信号通路，在细胞凋亡、细胞周期调控、细胞迁移等过程中均发挥关键作用，是肿瘤领域研究的热点。近年来，实验研究逐渐发现 PTEN 基因在 IFP 中也发挥着重要作用。本文就 PTEN 抑癌基因与 IPF 发病机制之间的相关性进行文献综述，以期为深入探讨 IPF 致病机制及治疗靶点提供新思路。
1 PTEN 基因结构、功能及其组织分布
PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）即第 10 号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因，是在 1997 年由三个独立的研究小组发现的位于人第 10 号染色体（10q23.3）上的抑癌基因，又名多种进展期癌中突变基因 1（mutated in multiple advanced cancers，MMAC1）或 TGF-β 调控和上皮细胞富集磷酸酶（TGF-β regulated and epithelial-cell-enriched phosphatase，TEP1）[10-12]。PTEN 基因是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，其缺失、突变和失活与多种恶性肿瘤包括神经胶质母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌等的发生密切相关[10]。
1.1 PTEN 基因结构
该基因由 9 个外显子和 8 个内含子组成，全长约 200 kb，其 cDNA 由 1 209 个核苷酸构成，编码的 PTEN 蛋白由 403 个氨基酸组成。PTEN 蛋白由位于 N 端的磷酸酯酶区和位于 C 端的 C2 结构域组成。磷酸酯酶区包含蛋白酪氨酸磷酸酯酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）特征序列，以及与痘苗病毒 H1 相关双特异性蛋白磷酸酶（Vaccinia H1-related，VHR）相似的结构区，PTEN 磷酸酶活性中心比 VHR 与 PTP 大，更加利于其与底物的结合。C 端的 C2 结构域结合磷脂膜，这种结合不依赖钙离子，介导细胞膜募集信号蛋白，对 PTEN 抑癌功能起重要作用。PTEN 蛋白 N 端尾部短，C 端尾部长，有富含丝/苏氨酸残基的 PEST 序列和 PDZ 结合结构域[13]。PTEN 基因经可变剪切与多个翻译起始密码子翻译产生多种 PTEN 蛋白亚型，Hopkins 等[14]发现一种在经典 PTEN 蛋白 N 端增加 173 个氨基酸的翻译变异体，该种变异体是经细胞旁分泌后可穿透细胞膜的脂质磷酸酶，拮抗 PI3K 信号通路并诱导肿瘤细胞死亡。另一项研究发现该变异体与经典 PTEN 形成复合体，增加 PTEN 诱导推定激酶 1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）蛋白水平，维持线粒体稳定，促进线粒体产能[15]。
1.2 PTEN 蛋白分布
PTEN 与张力蛋白（细胞骨架黏着斑相关蛋白）、辅助蛋白（突触囊泡运输相关蛋白）有同源性，在细胞质广泛表达。PTEN 蛋白在细胞核中以单泛素化形式存在，其特殊位点赖氨酸残基泛素化可调节 PTEN 在细胞核-细胞质中的分布，泛素特异性蛋白酶 7（ubiquitin specific protease 7，USP7）辅助 PTEN 蛋白进入细胞核，并与早幼粒细胞白血病体（functional promyelocytic leukaemia protein nuclear bodies，PML nuclear bodies）异常分布于细胞核中[16-18]。
1.3 PTEN 蛋白功能
PTEN 双特异性磷酸酶的主要底物是磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate，PIP3），通过 PIP3 去磷酸化为磷脂酰肌醇 4,5-双磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2），抑制丝/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）活性，负性调节 PI3K-AKT 通路，影响细胞能量代谢、细胞生长、细胞凋亡和迁移。PTEN 蛋白酪氨酸磷酸酶作用于黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）以及 SH2 包含蛋白（SH2 containing protein，Shc），通过去磷酸化作用调节细胞通路，影响细胞黏附和迁移[19]。PTEN 蛋白在细胞核内调节着丝点稳定性，维持浓缩染色质结构，修复损伤的双链 DNA，调节细胞周期、调控细胞衰老[20-24]。
PTEN 蛋白在整个胚胎发育期广泛、高度表达，早在 3.5 d 囊胚期的胚胎组织以及胚外组织中即可检测到，是胚胎细胞增殖、发育、迁移、死亡等一系列生长发育活动的重要标志。PTEN 基因表达调控 T 细胞增殖与功能，参与 NK 细胞发育以及抗体类型转换，也参与肺脏发育、代谢和功能[25]。
2 PTEN 抑癌基因在 IPF 发病机制中的作用
2.1 IPF 发病机制现状
2.1.1 肺泡上皮细胞微损伤
肺泡上皮细胞位于肺泡腔与肺间质间，是肺天然的物理屏障与免疫屏障。持续刺激导致肺泡上皮细胞损伤以及肺泡结构破坏，肺泡再生障碍以及异常激活是引起 IPF 的始动因素。编码调节肺泡上皮细胞抗压能力、表面活性物质稳定性，染色体端粒酶长度等基因突变导致肺泡上皮细胞对外界刺激敏感性增加[26]。环境中金属或有机成分的可吸入颗粒增加 IPF 发病风险，EB 病毒、疱疹病毒等病毒感染导致潜在的肺泡上皮损伤[8, 27]。慢性病如胃食管反流病、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症与肺泡低通气等对 IPF 发生、发展有促进作用[28-29]。衰老导致肺泡上皮细胞老化以及再生能力衰竭在肺纤维化中亦起到一定作用[30]。
具有遗传易感性个体暴露在特定环境中，在自身基础疾病相互作用下肺泡上皮持续受到刺激，肺泡上皮损伤再生修复功能受损，最终导致肺泡完整性破坏、肺泡陷闭，启动纤维化程序，发生级联效应。
2.1.2 肺泡上皮细胞异常激活
肺泡上皮损伤后释放炎症因子导致毛细血管通透性增加，纤维蛋白原、纤维连接蛋白渗出至肺间质及肺泡腔，形成最初暂时的细胞外基质，间质内其他细胞成分对细胞增殖信号产生应答，迁移至裸露肺泡基底膜维持上皮屏障，释放细胞因子刺激肺泡间质细胞迁移参与修复。激活的凝血因子 X（factor X，FX）使凝血酶原转化为凝血酶，剪切纤维蛋白原为纤维蛋白。肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells，AEC）分泌纤溶酶原激活物抑制因子 1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI1），形成抗纤溶和高凝的微环境，使基质降解减少。Ⅱ型肺泡上皮细胞分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞受到抑制，细胞内促凋亡蛋白[半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）和 Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表达升高，抗凋亡作用的 B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2 gene，Bcl-2）蛋白表达降低，凋亡增加[31]。晚期糖机化终产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）和 CD151 等减少可抑制Ⅰ型肺泡上皮识别基底膜，出现再上皮化障碍[32-33]。肺泡内含 SH2 结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶-2（SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2，Shp2）蛋白减少导致表面活性物质稳定性降低，促进上皮细胞凋亡[34]。
细胞外基质和凝血级联反应中释放的活性蛋白酶参与纤维化组织重塑以及上皮细胞向间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。凝血酶和活化 FX 通过蛋白酶活性受体-1 诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化[32]。同时涉及形态发生相关细胞因子 TGF-β、shh、Wnt/β-catenin、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor ，FGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、Notch 等在此过程中被激活，促进 EMT 转化增加[35]。
EMT 是极化的上皮细胞转变为间叶细胞，通常发生在胚胎细胞层运动和肿瘤细胞浸润中，是上皮细胞可塑性的表现。EMT 过程中上皮细胞相关蛋白上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin）和闭锁小带（zonula occludens，ZO-1）表达下调，间质细胞特征蛋白波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和纤连蛋白（fibronectin）表达上调[36]。EMT 直接增加间质细胞数量，细胞本身合成细胞外基质能力增强，释放大量趋化因子，细胞因子激活，募集附近的成纤维细胞使信号级联放大。
2.1.3 上皮细胞-成纤维细胞信号关联并激活成纤维细胞增殖
肺泡上皮损伤后可分泌 TGF-β，能够直接促进纤维化[37]。具体表现为上皮细胞表面传感系统整合素（αvβ6、αvβ6 和 α3β1）和钙黏着蛋白（如 E-cadherin/β-catenin）与基质中促炎因子溶血磷脂受体蛋白 2（LPA2）、Xa 及前体 TGF-β1 联合，将其激活[38, 41]。同时细胞表面 Wnt 受体 LRP6 磷酸化增加，通过经典 Wnt 通路，产生酪氨酸磷酸化 β-catenin 以及磷酸化 Smads 等转录复合体，积累于细胞核，改变其基因转录状态，释放炎症因子共同活化成纤维细胞，同时使其自身向肌成纤维细胞转变[40, 42]。另外，基质中 TGF-β 诱导上皮细胞能够高表达 shh 蛋白，通过正反馈模式进一步促进成纤维细胞 TGF-β 和 α-SMA 高表达，进一步增强纤维化效应[43-44]。
成纤维细胞与肌成纤维细胞过度合成和分泌细胞外基质，导致肺结构重塑，是 IPF 的最终表现。IPF 肺间质中肌成纤维细胞来源于三种成分：（1）外周循环血中一组特殊的白细胞亚群，能够特异性表达 CD45、CD34 和纤维连接蛋白，通过细胞因子受体 CXCR4 识别 IPF 中 AEC 表达的 CXCL12 募集于肺泡间质[45]；（2）Ⅲ型肺泡上皮细胞，转化为能够表达 α-SMA 和神经钙黏着蛋白（N-cadherin）的成纤维细胞；（3）肺间质组织中固有的成纤维细胞，在局部促纤维化生长因子 TGF-β、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）和肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）作用下转变为肌成纤维细胞[46]。
2.2 PTEN 基因在 IPF 发病机制中的作用
PTEN 基因功能异常在遗传性和散发的恶性肿瘤中均扮演重要“角色”。在肿瘤发生过程中，PTEN 基因突变或缺失直接导致 PTEN 蛋白双特异性磷酸酶功能缺失，直接促进细胞增值、侵袭，抑制细胞发生凋亡。P53、PPARγ、NF-kB 等在转录水平上调节 PTEN 基因的表达，非编码 RNA 调节转录后 mRNA 水平，PTEN 蛋白的泛素化、乙酰化以及与其他细胞内蛋白相互作用均与肿瘤的发生密切相关[47]。在 IPF 发生过程中，成纤维细胞广泛增殖、迁移、抗凋亡，其本身即具有恶性疾病特征，而 IPF 患者本身易同时合并肺癌，与此同时，抑癌基因 PTEN 已被证实在 IPF 的发生、发展中起到重要作用，现总结如下。
2.2.1 PTEN 蛋白在 IPF 中活性显著缺失
PTEN 在细胞内作用广泛，针对蛋白表达的调控是复杂且精细的。多种信号通路调节 PTEN 基因转录，miRNA 和 ceRNA 调节 PTEN 转录后 mRNA 稳定性，PTEN 蛋白的磷酸化、乙酰化等可正性或负性调节 PTEN 蛋白稳定性，酶活性以及细胞内定位[25]。PTEN 基因表达、PTEN 蛋白水平、PTEN 蛋白磷酸酶活性在 IPF 来源的成纤维细胞中较正常成纤维细胞显著降低[48]。IPF 成纤维细胞灶中与 PTEN 结合的膜蛋白微囊蛋白 1（caveolin-1）低表达，从而导致细胞膜微环境中 PTEN 磷酸酶活性的相对缺失，进而导致 PI3K/AKT 异常激活[49]。PTEN 在 IPF 中功能缺失还与翻译后修饰有关，Geng 等[50]发现 USP13 与 PTEN 相互作用，并介导 PTEN 蛋白在 IPF 成纤维细胞中泛素化。
2.2.2 PTEN 蛋白缺失具有显著致纤维化作用
（1）肺泡上皮完整性被破坏：小鼠支气管肺泡上皮特异性敲除 PTEN 基因后发现肺泡上皮紧密连接（TJs）分解及基底膜降解增加，上皮来源的肌成纤维细胞增加。博来霉素处理后上皮细胞磷酸化 AKT、磷酸化 S6K、Snail 和基质金属蛋白酶表达增加，紧密连接蛋白-4（Claudin-4）、E-cadherin、β-catenin 和层黏连蛋白 β1（laminin-β1）表达下降[51]。在 IPF 中，PTEN 对肺泡上皮细胞完整性起关键的门控作用，PTEN 缺失使上皮细胞对损伤刺激因素敏感性增加。
（2）促进成纤维细胞分化，促进成纤维细胞侵袭、迁移：PTEN 基因敲除后成纤维细胞 α-SMA、胶原蛋白表达上调，PTEN 基因过表达后抑制 TGF-β 诱导其分化为肌成纤维细胞[48]。Geng 等[52]进一步研究表明 PTEN 表达缺失使正常的成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，细胞增殖加快，侵袭、迁移能力增加，并且低氧可下调 PTEN 表达。对成纤维细胞侵袭表型进行转录组测定，PTEN 基因与基质金属蛋白酶 13（matrix metalloproteinase，MMP-13）、TGF-β1、caveolin-1 和分泌型卷曲相关蛋白 1（secreted frizzled-related proteins 1，Sfrp1）对成纤维细胞侵袭行有明显调控作用[53]。动物实验发现 PTEN 基因缺失小鼠博来霉素诱导发生 IPF 后死亡率明显增加，PTEN 缺失使肺泡上皮细胞易损伤，同时导致参与修复的成纤维细胞功能异常（图 1）。PTEN 基因及其功能在肺间质纤维化发病的多个关键环节起到重要作用。
图1
PTEN 基因在 IFP 发病过程中的作用
PTEN 对肺泡上皮细胞稳定性起到门控作用，PTEN 缺失促进损伤导致基底膜降解，紧密连接，抑制上皮细胞发生 EMT，抑制肺间质来源的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞、分泌细胞外基质，促进外周的巨噬细胞、T 淋巴细胞募集至成纤维细胞灶参与损伤引起的炎症与修复（→为促进作用，┻为抑制或拮抗作用）
（3）诱导成纤维细胞抗凋亡表型，抑制成纤维细胞发生自噬：细胞外基质收缩可激活正常成纤维细胞内 PTEN 蛋白，发挥双特异性磷酸酶活性，拮抗 PI3K 活性，下调磷酸化 AKT 水平，诱导成纤维细胞发生凋亡。而 PTEN 基因缺失的成纤维细胞通过 β1 整合素激活 PI3K-Akt-S6K1 通路，使得磷酸化 AKT 水平升高，使成纤维细胞具有抗胶原诱导的细胞凋亡表型，并通过激活 PI3K-AKT-mTOR 途径，抑制成纤维细胞自噬活性，最终导致 IPF 中成纤维细胞在 ECM 异常增殖（图 2）[54-56]。
Fox3a 转录因子通过上调细胞周期抑制因子 P27 阻抑有丝分裂细胞 G1 期向 S 期过渡。Fox3a 与 caveolin-1 启动子区结合后，可增加其转录和蛋白表达，caveolin-1 过表达可增加 Fas 水平以及 caspase-3/7 活性，促进成纤维细胞发生Ⅰ型胶原诱导的凋亡。而 IPF 患者肺组织活检中发现 caveolin-1、Fas、caspase-3/7 表达下降，PTEN 缺失导致高活性 AKT 磷酸化 Fox3a 而使其失去活性，导致微管相关蛋白 1a/1b 轻链 3B（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3B，LC3-B）转录减少，降低成纤维细胞自噬活性，促进其在胶原基质中增殖（图 2）[57-59]。
（4）纤维化相关细胞因子分泌失衡：IPF 肺纤维化发生初期，损伤修复反应中亦产生抑制纤维化的细胞因子（如前列腺素 E2），但研究发现纤维化反应中的成纤维细胞对前列腺素 E2 并不敏感，主要是由于具有高度活性的磷酸化 AKT 介导前列腺素 E2 受体启动子区甲基化，使细胞合成前列腺素 E2 受体减少，降低了细胞对基质中前列腺素 E2 的敏感性（图 2）[60]。
图2
PTEN 基因促纤维化的分子机制
PTEN 特异性双磷酸酶活性作用于底物 PIP3，去磷酸化从而抑制 PI3K-AKT 通路。当 PTEN 缺乏时，细胞 AKT 活性增强，通过磷酸化使活性 FoxO3a 减少，P27 转录减少，对 CDK 抑制作用减弱，促进细胞增殖；活性 FoxO3a 的降低减少 Caveolin-1 转录与表达，降低 Fas 水平，降低 Caspase-3/7 活性，诱导抗凋亡表型；FoxO3a 降低通过减少 LC3-B 转录抑制细胞自噬；磷酸化 AKT 激活下游 mTOR，通过抑制 LC3-B 降低细胞自噬活性。活性 AKT 通过前列腺素 E2 受体基因上启动子区甲基化作用，减少前列腺素 E2 受体表达，使细胞对抗纤维化细胞因子前列腺素 E2 不敏感
骨髓 PTEN 缺陷小鼠在应用博来霉素诱导后，肺组织表现出 TGF-β1 活化，胶原沉积增加，前胶原蛋白、赖氨酰氧化酶表达增加；肺泡灌洗液中巨噬细胞、T 细胞数量下降，炎症细胞募集功能受损（图 1），肺巨噬细胞极化异常，促纤维化因子 IL-6 以及 TNF-α 合成、分泌增加[61]。PTEN 缺失可导致细胞炎症反应失衡，促纤维化因子释放增多，抗纤维化因子相对不足，维持纤维化状态。
应用 VEGF 抑制剂治疗博来霉素诱导 IPF 蛋白组学的研究显示，PI3K-Akt 信号通路与 Wnt 信号通路有显著促纤维化作用；自然杀伤细胞信号通路（NK signaling）与 PTEN 信号通路具有显著抗纤维化作用，VEGF 抑制剂诱导 SHIP-1 过表达，导致 PTEN 信号增加，介导抗纤维化效应；雷帕霉素（mTOR）和细胞外信号调节激酶（ERK）为促纤维化和抗纤维化反应的关键介质，PTEN 通过抑制 PI3K-AKT-mTOR 通路调节纤维化反应中 mTOR[62]。
3 结论与展望
PTEN 作为具有特异性双磷酸酶活性的抑癌基因，通过去磷酸化细胞内重要信号分子如 PIP3，抑制 PI3K-AKT 信号通路，抑制活化 AKT 下游细胞信号分子。PTEN 蛋白及其活性在 IPF 时显著降低，PTEN 缺失破坏肺泡上皮细胞完整性，促进成纤维细胞分化、迁移，抑制成纤维细胞发生自噬、凋亡，导致细胞炎症反应失衡，促纤维化细胞因子分泌增加，抗纤维化细胞因子分泌不足。PTEN 基因在 IPF 发生、发展过程中起重要作用，为该病的基因治疗提供了新靶点。
