引用本文： 樊梅, 邓俊, 王宋平. 阿奇霉素对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺血管重构的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2018, 17(2): 128-133. doi: 10.7507/1671-6205.201710006 复制
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种常见的以持续性呼吸道症状和气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，呼吸道症状和气流受限是由有毒颗粒或气体导致的气道和（或）肺泡异常引起的[1]。气道、肺实质、肺血管炎症是慢阻肺的主要特征，长期炎症刺激和慢性缺氧可导致气道重塑、肺实质破坏、肺血管收缩及重构，肺血管重构是肺动脉高压、慢性肺源性心脏病的主要发病机制之一。
阿奇霉素是第二代大环内酯类抗生素，国外已有多项研究证实，长期小剂量使用阿奇霉素可减少慢阻肺的急性发作次数，提高患者的生活质量[2-4]，这表明阿奇霉素具有抗菌以外的其他作用。阿奇霉素可抑制中性粒细胞活性、促进中性粒细胞凋亡，改善巨噬细胞的吞噬能力，减少促炎因子白细胞介素（interleukin，IL）-8、粒-巨噬细胞集落刺激因子、IL-6 及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等的释放[5-6]，这可能是其用于预防慢阻肺急性加重的重要依据。有研究报道阿奇霉素可抑制气道平滑肌细胞 P38MAPK 途径激活，导致平滑肌细胞释放的血管内皮生长因子显著下降[7]，表明阿奇霉素可能具有一定的抗血管重构作用。但阿奇霉素抗血管重构作用的研究多局限在体外实验细胞水平，本研究旨在观察阿奇霉素对慢阻肺大鼠肺血管重构及骨桥蛋白（osteopontin，OPN）表达的影响，探讨其对慢阻肺肺血管重构的作用及可能机制，为拓宽临床应用阿奇霉素治疗慢阻肺提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性 SD 大鼠 18 只，8 周龄，白色，体重（200±20）g，购自西南医科大学动物实验中心，饲养于恒温空调房，室内温度 20～24 ℃，相对湿度 40%～70%，自由摄食及饮水。
1.2 主要实验试剂及器材
阿奇霉素（石药集团欧意药业有限公司）；脂多糖（美国 sigma 公司）；天下秀牌香烟（焦油量：10 mg，烟碱量：1.0 mg，一氧化碳量：11 mg。四川中烟工业有限责任公司）；大鼠 OPN ELISA 试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司）；维多利亚蓝、VG 染液（ASPEN）；自制玻璃烟熏箱（60 cm×50 cm×30 cm）；OLYMPUS 光学显微镜（日本）；Image-pro-plus6.0 图像分析软件。
1.3 方法
1.3.1 慢阻肺大鼠模型建立
SD 大鼠适应性喂养 7 d 后，随机分对照组（A 组）、慢阻肺模型组（B 组）、阿奇霉素药物干预组（C 组）。B 组：采用熏香烟加气管内滴注脂多糖的方法建立慢阻肺模型：第 1、14 d，经气管注射脂多糖 200 µg（200 µg/100 µl），第 2～13 d、15～42 d 予以熏香烟 2 次/d（每次间隔时间 6 h 以上），每次 10 支，每次 1 h，共 6 周[8]，第 15 d 开始于烟熏前 1 h 行生理盐水 2 ml 灌胃，共 4 周。C 组：经气管内注入脂多糖的条件、烟熏条件及持续时间同 B 组，从第 15 d 起每天熏烟前 1 h 用阿奇霉素灌胃治疗（剂量 50 mg/kg）4 周。A 组：不予被动吸烟，第 15 d 烟熏前 1 h 行生理盐水 2 ml 灌胃，共 4 周。
1.3.2 血清采集
于实验第 42 d 称重所有大鼠，采用 1% 戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔麻醉后固定于操作台，开胸后经心脏取血，以 2 000 r/min 离心 10 min，分离血清，–80 ℃ 保存。
1.3.3 病理标本制备
取新鲜右肺中叶组织（1 cm×1 cm×1 cm）用 4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋，行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察以下指标：① 肺组织病理改变；② 选择直径在 50～500 μm 之间的肺动脉 5 支，半定量评价动脉壁及周围炎性细胞浸润程度。炎症评分标准：无炎性细胞浸润为 0 分；少许炎性细胞浸润为 1 分；浸润的炎性细胞较多但分布不均匀为 2 分；炎性细胞浸润较多，分布均匀，但不聚集成团为 3 分；大量炎性细胞浸润并聚集成团为 4 分。维多利亚蓝+Van Gieson（VG）染色后利用图像分析软件测定肺血管重构指标：200 倍镜下选择直径 50～100 μm 的肺腺泡内肺动脉总数并分类，计算肌性动脉（muscular artery，MA）、部分肌性动脉（partial muscular artery，PMA）和非肌性动脉（non-muscular artery，NMA）的构成比；400 倍高倍镜下选择 50～100 μm 的 MA 进行图像分析，计算血管壁面积和血管总面积之比（WA%）、血管壁厚度与血管外径长度之比（WT%）。
1.3.4 ELISA 法检测血清 OPN 的含量
利用大鼠 OPN ELISA 试剂盒检测血清 OPN 水平，按照操作说明书进行，将标准品配制成以下浓度：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0 ng/ml，标准品&样品稀释液直接作为空白孔 0 ng/ml，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，各组样品设 2 个复孔，空白孔加标准品&样品稀释液 100 μl，余孔分别加标准品或待测样品 100 μl，37 ℃ 孵育 90 min，倒去孔内液体，每个孔中加入生物素化抗体工作液 100 μl，37 ℃ 孵育 1 h，磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，每孔加酶结合物工作液 100 μl，37 ℃ 孵育 30 min，洗涤 5 次，每孔加底物溶液（TMB）90 μl，37 ℃ 避光孵育 15 min，最后加终止液 50 μl，终止反应，此时蓝色立转黄色，立即用酶标仪在 450 nm 波长测量各孔的光密度（OD 值）。
1.3.5 免疫组化法测定肺组织 OPN 的蛋白表达含量
采用即用型（Envison）快速酶免疫组化二步法，操作按试剂盒说明书进行。石蜡切片脱蜡至水，置于乙二胺四乙酸四钠缓冲液中微波修复，置于 3% 过氧化氢溶液中，以阻断内源性过氧化物酶，5% 胎牛血清白蛋白封闭 20 min，加入 OPN 一抗，4 ℃ 过夜，随后加入相应种属的二抗、二氨基联苯胺溶液，显微镜控制显色，苏木素复染，1% 盐酸酒精分化，氨水返蓝，再经梯度酒精脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封固。同时利用磷酸盐缓冲液代替一抗染色做阴性对照。每张切片随机选取 5 个高倍镜视野，采用平均阳性染色百分比法分析免疫组化结果。
1.3.6 实时荧光定量 PCR 法检测肺组织 OPN mRNA 的表达
取新鲜左肺组织，参照 Trizol Reagent 试剂盒提取总 RNA，将 RNA 逆转录为 cDNA，并进行 PCR 扩增目的基因，产物进行琼脂糖凝胶胶电泳。扩增引物：① OPN 上游引物：5′-AGCACACAAGCAGACGTTTTG-3′，下游引物：5′-GCAACTGGGATGACCTTGATAG-3′。产物长度：206 bp。② 甘油醛-3-磷酸脱氢酶上游引物：5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，下游引物：5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′。产物长度：201 bp。荧光定量 PCR 反应程序为：95 ℃ 变性 15 s，58 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 45 s，循环 40 次。PCR 熔解曲线程序设定为：60 ℃ 升温至 95 ℃ 的过程中，每 20 s 升温 1 ℃，并检测一次荧光信号。利用荧光定量 PCR 仪自动计算出每个样本的 CT 值，OPN mRNA 的相对表达含量为 2–ΔΔCT。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计软件，数据以均数±标准差（
）表示，组间比较采用单因素方差分析，并采用 SNK-q 检验进行两两间比较。Pearson 相关分析进行各因素的相关性检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺组织病理改变
与 A 组比较，B 组大鼠肺组织可见气道纤毛倒伏、脱落，纤毛柱状上皮细胞坏死脱落，杯状细胞增生；气道管壁增厚，管腔狭窄，周围可见大量炎细胞浸润；肺泡扩张，肺泡间隔变薄、断裂，相邻肺泡融合成肺大泡；肺小动脉内膜增厚，平滑肌增生、肥大，管腔狭窄，血管周围大量炎细胞浸润。B、C 组大鼠肺组织病理改变均符合慢性阻塞性肺疾病病理改变，而 C 组上述改变较 B 组均有不同程度减轻。结果见图 1。
图1
各组肺组织病理检查像（HE ×100）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
2.2 肺血管炎症及肺血管重构评价
与 A 组比较，B 组和 C 组的肺血管炎症情况比 A 组严重，C 组与 B 组比较，肺血管炎症减轻（图 2），各组炎症评分见表 1。维多利亚蓝+VG 染色后 MA 主要表现为具有内外双层完整弹力板，PMA 表现为内层完整弹力板，外层部分弹力板，NMA 表现为单层弹力板（图 3）；与 A 组比较，B、C 组 MA 明显增多（P<0.05），B 组 MA 比 C 组明显增多（P<0.05），见表 1。此外，B 组和 C 组肺血管重构指标 WA%、WT% 明显高于 A 组（P<0.05），C 组 WT%、WA% 与 B 组比较明显减低（P<0.05），差异有统计学意义，见表 1。
图2
各组肺组织血管炎症情况（HE ×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
图3
肺血管病理检查像（维多利亚蓝+VG ×200）
a. NMA；b. MA；c. PMA
表1
各组大鼠肺血管炎症及肺血管重构评价（
）
2.3 血清 OPN 含量
ELISA 检测结果显示，B、C 组血清 OPN 浓度明显高于 A 组（P<0.01），C 组血清 OPN 浓度显著低于 B 组（P<0.01）。结果见表 2。
2.4 免疫组化法测定肺组织 OPN 的蛋白表达含量
OPN 在肺组织主要表达于支气管黏膜上皮、血管内皮、气道和肺血管周围的炎症细胞，以胞浆着色为主，阳性产物为棕黄色沉淀。B、C 组肺组织 OPN 的表达高于 A 组（P<0.05），C 组肺组织 OPN 的表达低于 B 组（P<0.05），结果见图 4、表 2。
图4
各组大鼠肺组织 OPN 的表达（免疫组化法 ×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
2.5 实时荧光定量 PCR 法检测肺组织 OPN mRNA 的表达
B、C 组 OPN mRNA 的含量显著高于 A 组（P<0.01），C 组 OPN mRNA 的含量低于 B 组（P<0.01）。结果见表 2。
表2
各组大鼠血清 OPN 浓度、OPN 蛋白含量、OPN mRNA 表达量（
）
2.6 相关性分析
相关性分析结果显示：肺组织 OPN 含量与肺血管炎症评分、血管重塑指标 WT%、WA% 成正相关（r=0.836、0.654、0.796，P<0.005）；血清 OPN 含量与肺血管炎症评分与 WT%、WA% 成正相关（r=0.922、0.730、0.810，P<0.005）；OPN mRNA 含量与肺血管炎症评与 WT%、WA% 成正相关（r=0.982、0.812、0.778，P<0.005）。结果见图 5。
图5
相关性分析散点图
3 讨论
肺血管重构是肺血管管壁细胞外基质因低氧、高血流剪应力、炎症等损伤因子发生的血管结构的改变，其主要病理特征为细胞外基质增多，膜平滑肌细胞肥大和增生，导致肺动脉管壁增厚和管腔狭窄[9]，是肺动脉高压的主要发病机制之一。虽然肺动脉高压常在慢阻肺疾病进展期才诊断，但肺血管改变已经发生在疾病早期阶段患者和没有气流受限的吸烟者[10]。本实验发现，烟熏联合脂多糖刺激大鼠 6 周后已经发生肺血管重构，这与张伟等[11]报道一致。
近年来，大环内酯类抗生素的非抗菌作用得到了广泛关注，尤其是其免疫调节作用，在支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、囊性纤维化、支气管哮喘等呼吸系统疾病中的治疗已受到了广泛的关注和肯定[12-14]。本实验研究结果显示：阿奇霉素干预的大鼠肺血管周围炎症细胞数较没有干预的大鼠明显减少，这可能与阿奇霉素抑制中性粒细胞趋化性及活性、促进中性粒细胞凋亡，改善巨噬细胞的吞噬能力有关[6]。郭彩霞[15]发现阿奇霉素可通过抑制 TLR4/NF-κB 信号通路来减少慢阻肺大鼠释放 TNF-α、IL-1β、IL-6 等细胞因子，从而减轻慢阻肺大鼠肺组织炎症。Hodge 等[16]证实小剂量阿奇霉素可减少颗粒酶 B 的释放，抑制气道上皮细胞凋亡，减轻慢阻肺患者气道再修复和气道慢性炎症，而气道炎症和气道重塑逐渐进展可导致气道狭窄、气道阻塞、肺实质破坏与肺血管异常。Rosenberg 等[17]研究表明，OPN 是影响肺动脉高压预后的独立危险因素。OPN 作为一种促细胞黏附和迁移因子，有助于增强血管外膜成纤维细胞的增殖、迁移、侵袭性及表型转换[18]，促进血管平滑肌细胞的增殖、迁移，并通过调节炎症细胞的趋化作用引起血管炎症，从而促进血管重塑[19]。OPN 还可通过 Akt1/AP-1 信号通路，诱导 MMP-2 的释放，造成基质金属蛋白酶系统失衡引起肺血管及气道重塑[20]。本实验发现阿奇霉素干预大鼠的肺血管 WT%、WA% 及 MA% 较没有干预的大鼠明显减少，且血清 OPN、肺组织 OPN 以及 mRNA OPN 含量也明显降低，表明阿奇霉素可抑制肺血管重构，其机制可能与抑制 OPN 的表达有关。
综上，本研究通过体内实验证实了阿奇霉素可减轻肺血管炎症和肺血管重构，其机制可能与抑制 OPN 的表达有关，为阿奇霉素用于治疗慢阻肺提供了新的理论依据。
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种常见的以持续性呼吸道症状和气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，呼吸道症状和气流受限是由有毒颗粒或气体导致的气道和（或）肺泡异常引起的[1]。气道、肺实质、肺血管炎症是慢阻肺的主要特征，长期炎症刺激和慢性缺氧可导致气道重塑、肺实质破坏、肺血管收缩及重构，肺血管重构是肺动脉高压、慢性肺源性心脏病的主要发病机制之一。
阿奇霉素是第二代大环内酯类抗生素，国外已有多项研究证实，长期小剂量使用阿奇霉素可减少慢阻肺的急性发作次数，提高患者的生活质量[2-4]，这表明阿奇霉素具有抗菌以外的其他作用。阿奇霉素可抑制中性粒细胞活性、促进中性粒细胞凋亡，改善巨噬细胞的吞噬能力，减少促炎因子白细胞介素（interleukin，IL）-8、粒-巨噬细胞集落刺激因子、IL-6 及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等的释放[5-6]，这可能是其用于预防慢阻肺急性加重的重要依据。有研究报道阿奇霉素可抑制气道平滑肌细胞 P38MAPK 途径激活，导致平滑肌细胞释放的血管内皮生长因子显著下降[7]，表明阿奇霉素可能具有一定的抗血管重构作用。但阿奇霉素抗血管重构作用的研究多局限在体外实验细胞水平，本研究旨在观察阿奇霉素对慢阻肺大鼠肺血管重构及骨桥蛋白（osteopontin，OPN）表达的影响，探讨其对慢阻肺肺血管重构的作用及可能机制，为拓宽临床应用阿奇霉素治疗慢阻肺提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性 SD 大鼠 18 只，8 周龄，白色，体重（200±20）g，购自西南医科大学动物实验中心，饲养于恒温空调房，室内温度 20～24 ℃，相对湿度 40%～70%，自由摄食及饮水。
1.2 主要实验试剂及器材
阿奇霉素（石药集团欧意药业有限公司）；脂多糖（美国 sigma 公司）；天下秀牌香烟（焦油量：10 mg，烟碱量：1.0 mg，一氧化碳量：11 mg。四川中烟工业有限责任公司）；大鼠 OPN ELISA 试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司）；维多利亚蓝、VG 染液（ASPEN）；自制玻璃烟熏箱（60 cm×50 cm×30 cm）；OLYMPUS 光学显微镜（日本）；Image-pro-plus6.0 图像分析软件。
1.3 方法
1.3.1 慢阻肺大鼠模型建立
SD 大鼠适应性喂养 7 d 后，随机分对照组（A 组）、慢阻肺模型组（B 组）、阿奇霉素药物干预组（C 组）。B 组：采用熏香烟加气管内滴注脂多糖的方法建立慢阻肺模型：第 1、14 d，经气管注射脂多糖 200 µg（200 µg/100 µl），第 2～13 d、15～42 d 予以熏香烟 2 次/d（每次间隔时间 6 h 以上），每次 10 支，每次 1 h，共 6 周[8]，第 15 d 开始于烟熏前 1 h 行生理盐水 2 ml 灌胃，共 4 周。C 组：经气管内注入脂多糖的条件、烟熏条件及持续时间同 B 组，从第 15 d 起每天熏烟前 1 h 用阿奇霉素灌胃治疗（剂量 50 mg/kg）4 周。A 组：不予被动吸烟，第 15 d 烟熏前 1 h 行生理盐水 2 ml 灌胃，共 4 周。
1.3.2 血清采集
于实验第 42 d 称重所有大鼠，采用 1% 戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔麻醉后固定于操作台，开胸后经心脏取血，以 2 000 r/min 离心 10 min，分离血清，–80 ℃ 保存。
1.3.3 病理标本制备
取新鲜右肺中叶组织（1 cm×1 cm×1 cm）用 4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋，行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察以下指标：① 肺组织病理改变；② 选择直径在 50～500 μm 之间的肺动脉 5 支，半定量评价动脉壁及周围炎性细胞浸润程度。炎症评分标准：无炎性细胞浸润为 0 分；少许炎性细胞浸润为 1 分；浸润的炎性细胞较多但分布不均匀为 2 分；炎性细胞浸润较多，分布均匀，但不聚集成团为 3 分；大量炎性细胞浸润并聚集成团为 4 分。维多利亚蓝+Van Gieson（VG）染色后利用图像分析软件测定肺血管重构指标：200 倍镜下选择直径 50～100 μm 的肺腺泡内肺动脉总数并分类，计算肌性动脉（muscular artery，MA）、部分肌性动脉（partial muscular artery，PMA）和非肌性动脉（non-muscular artery，NMA）的构成比；400 倍高倍镜下选择 50～100 μm 的 MA 进行图像分析，计算血管壁面积和血管总面积之比（WA%）、血管壁厚度与血管外径长度之比（WT%）。
1.3.4 ELISA 法检测血清 OPN 的含量
利用大鼠 OPN ELISA 试剂盒检测血清 OPN 水平，按照操作说明书进行，将标准品配制成以下浓度：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0 ng/ml，标准品&样品稀释液直接作为空白孔 0 ng/ml，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，各组样品设 2 个复孔，空白孔加标准品&样品稀释液 100 μl，余孔分别加标准品或待测样品 100 μl，37 ℃ 孵育 90 min，倒去孔内液体，每个孔中加入生物素化抗体工作液 100 μl，37 ℃ 孵育 1 h，磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，每孔加酶结合物工作液 100 μl，37 ℃ 孵育 30 min，洗涤 5 次，每孔加底物溶液（TMB）90 μl，37 ℃ 避光孵育 15 min，最后加终止液 50 μl，终止反应，此时蓝色立转黄色，立即用酶标仪在 450 nm 波长测量各孔的光密度（OD 值）。
1.3.5 免疫组化法测定肺组织 OPN 的蛋白表达含量
采用即用型（Envison）快速酶免疫组化二步法，操作按试剂盒说明书进行。石蜡切片脱蜡至水，置于乙二胺四乙酸四钠缓冲液中微波修复，置于 3% 过氧化氢溶液中，以阻断内源性过氧化物酶，5% 胎牛血清白蛋白封闭 20 min，加入 OPN 一抗，4 ℃ 过夜，随后加入相应种属的二抗、二氨基联苯胺溶液，显微镜控制显色，苏木素复染，1% 盐酸酒精分化，氨水返蓝，再经梯度酒精脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封固。同时利用磷酸盐缓冲液代替一抗染色做阴性对照。每张切片随机选取 5 个高倍镜视野，采用平均阳性染色百分比法分析免疫组化结果。
1.3.6 实时荧光定量 PCR 法检测肺组织 OPN mRNA 的表达
取新鲜左肺组织，参照 Trizol Reagent 试剂盒提取总 RNA，将 RNA 逆转录为 cDNA，并进行 PCR 扩增目的基因，产物进行琼脂糖凝胶胶电泳。扩增引物：① OPN 上游引物：5′-AGCACACAAGCAGACGTTTTG-3′，下游引物：5′-GCAACTGGGATGACCTTGATAG-3′。产物长度：206 bp。② 甘油醛-3-磷酸脱氢酶上游引物：5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，下游引物：5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′。产物长度：201 bp。荧光定量 PCR 反应程序为：95 ℃ 变性 15 s，58 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 45 s，循环 40 次。PCR 熔解曲线程序设定为：60 ℃ 升温至 95 ℃ 的过程中，每 20 s 升温 1 ℃，并检测一次荧光信号。利用荧光定量 PCR 仪自动计算出每个样本的 CT 值，OPN mRNA 的相对表达含量为 2–ΔΔCT。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计软件，数据以均数±标准差（
）表示，组间比较采用单因素方差分析，并采用 SNK-q 检验进行两两间比较。Pearson 相关分析进行各因素的相关性检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺组织病理改变
与 A 组比较，B 组大鼠肺组织可见气道纤毛倒伏、脱落，纤毛柱状上皮细胞坏死脱落，杯状细胞增生；气道管壁增厚，管腔狭窄，周围可见大量炎细胞浸润；肺泡扩张，肺泡间隔变薄、断裂，相邻肺泡融合成肺大泡；肺小动脉内膜增厚，平滑肌增生、肥大，管腔狭窄，血管周围大量炎细胞浸润。B、C 组大鼠肺组织病理改变均符合慢性阻塞性肺疾病病理改变，而 C 组上述改变较 B 组均有不同程度减轻。结果见图 1。
图1
各组肺组织病理检查像（HE ×100）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
2.2 肺血管炎症及肺血管重构评价
与 A 组比较，B 组和 C 组的肺血管炎症情况比 A 组严重，C 组与 B 组比较，肺血管炎症减轻（图 2），各组炎症评分见表 1。维多利亚蓝+VG 染色后 MA 主要表现为具有内外双层完整弹力板，PMA 表现为内层完整弹力板，外层部分弹力板，NMA 表现为单层弹力板（图 3）；与 A 组比较，B、C 组 MA 明显增多（P<0.05），B 组 MA 比 C 组明显增多（P<0.05），见表 1。此外，B 组和 C 组肺血管重构指标 WA%、WT% 明显高于 A 组（P<0.05），C 组 WT%、WA% 与 B 组比较明显减低（P<0.05），差异有统计学意义，见表 1。
图2
各组肺组织血管炎症情况（HE ×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
图3
肺血管病理检查像（维多利亚蓝+VG ×200）
a. NMA；b. MA；c. PMA
表1
各组大鼠肺血管炎症及肺血管重构评价（
）
2.3 血清 OPN 含量
ELISA 检测结果显示，B、C 组血清 OPN 浓度明显高于 A 组（P<0.01），C 组血清 OPN 浓度显著低于 B 组（P<0.01）。结果见表 2。
2.4 免疫组化法测定肺组织 OPN 的蛋白表达含量
OPN 在肺组织主要表达于支气管黏膜上皮、血管内皮、气道和肺血管周围的炎症细胞，以胞浆着色为主，阳性产物为棕黄色沉淀。B、C 组肺组织 OPN 的表达高于 A 组（P<0.05），C 组肺组织 OPN 的表达低于 B 组（P<0.05），结果见图 4、表 2。
图4
各组大鼠肺组织 OPN 的表达（免疫组化法 ×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
2.5 实时荧光定量 PCR 法检测肺组织 OPN mRNA 的表达
B、C 组 OPN mRNA 的含量显著高于 A 组（P<0.01），C 组 OPN mRNA 的含量低于 B 组（P<0.01）。结果见表 2。
表2
各组大鼠血清 OPN 浓度、OPN 蛋白含量、OPN mRNA 表达量（
）
2.6 相关性分析
相关性分析结果显示：肺组织 OPN 含量与肺血管炎症评分、血管重塑指标 WT%、WA% 成正相关（r=0.836、0.654、0.796，P<0.005）；血清 OPN 含量与肺血管炎症评分与 WT%、WA% 成正相关（r=0.922、0.730、0.810，P<0.005）；OPN mRNA 含量与肺血管炎症评与 WT%、WA% 成正相关（r=0.982、0.812、0.778，P<0.005）。结果见图 5。
图5
相关性分析散点图
3 讨论
肺血管重构是肺血管管壁细胞外基质因低氧、高血流剪应力、炎症等损伤因子发生的血管结构的改变，其主要病理特征为细胞外基质增多，膜平滑肌细胞肥大和增生，导致肺动脉管壁增厚和管腔狭窄[9]，是肺动脉高压的主要发病机制之一。虽然肺动脉高压常在慢阻肺疾病进展期才诊断，但肺血管改变已经发生在疾病早期阶段患者和没有气流受限的吸烟者[10]。本实验发现，烟熏联合脂多糖刺激大鼠 6 周后已经发生肺血管重构，这与张伟等[11]报道一致。
近年来，大环内酯类抗生素的非抗菌作用得到了广泛关注，尤其是其免疫调节作用，在支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、囊性纤维化、支气管哮喘等呼吸系统疾病中的治疗已受到了广泛的关注和肯定[12-14]。本实验研究结果显示：阿奇霉素干预的大鼠肺血管周围炎症细胞数较没有干预的大鼠明显减少，这可能与阿奇霉素抑制中性粒细胞趋化性及活性、促进中性粒细胞凋亡，改善巨噬细胞的吞噬能力有关[6]。郭彩霞[15]发现阿奇霉素可通过抑制 TLR4/NF-κB 信号通路来减少慢阻肺大鼠释放 TNF-α、IL-1β、IL-6 等细胞因子，从而减轻慢阻肺大鼠肺组织炎症。Hodge 等[16]证实小剂量阿奇霉素可减少颗粒酶 B 的释放，抑制气道上皮细胞凋亡，减轻慢阻肺患者气道再修复和气道慢性炎症，而气道炎症和气道重塑逐渐进展可导致气道狭窄、气道阻塞、肺实质破坏与肺血管异常。Rosenberg 等[17]研究表明，OPN 是影响肺动脉高压预后的独立危险因素。OPN 作为一种促细胞黏附和迁移因子，有助于增强血管外膜成纤维细胞的增殖、迁移、侵袭性及表型转换[18]，促进血管平滑肌细胞的增殖、迁移，并通过调节炎症细胞的趋化作用引起血管炎症，从而促进血管重塑[19]。OPN 还可通过 Akt1/AP-1 信号通路，诱导 MMP-2 的释放，造成基质金属蛋白酶系统失衡引起肺血管及气道重塑[20]。本实验发现阿奇霉素干预大鼠的肺血管 WT%、WA% 及 MA% 较没有干预的大鼠明显减少，且血清 OPN、肺组织 OPN 以及 mRNA OPN 含量也明显降低，表明阿奇霉素可抑制肺血管重构，其机制可能与抑制 OPN 的表达有关。
综上，本研究通过体内实验证实了阿奇霉素可减轻肺血管炎症和肺血管重构，其机制可能与抑制 OPN 的表达有关，为阿奇霉素用于治疗慢阻肺提供了新的理论依据。
