引用本文： 谢晓然, 鲍文华, 杨泽. 肿瘤坏死因子-α 基因多态性与黑龙江省东部地区慢性阻塞性肺疾病人群易感性的研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2019, 18(3): 217-223. doi: 10.7507/1671-6205.201711001 复制
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是全球高致死率、高致残率、高患病率的慢性疾病之一[1]。2017 年慢性阻塞性肺疾病全球倡议（GOLD）将慢阻肺定义为一种可防可治的常见疾病，其特征是持续存在的气流受限和呼吸道症状，且常呈进展性，与有害颗粒或气体暴露导致的气道慢性炎症和（或）肺泡异常有关[2]。吸烟被认为是慢阻肺发生过程中的主要危险因子，但只有 10%～20% 的吸烟人群发展为慢阻肺[3]，而慢阻肺患者中无吸烟史者也占了相当大比例[4]，表明慢阻肺发生发展过程中仍有其他因素的参与[5-7]。研究表明，导致人群肺功能下降的原因中吸烟仅占 15%，包括环境因素的其他因素占 30%，遗传因素占 55%[8-9]，而慢阻肺与反复发作的炎症反应密切相关[10]。因此，世界各地的研究者们将目光投向了可以反映炎症水平的生物标志物及其与慢阻肺临床分期的关系上。已经证实有关的标志物有白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8 以及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等。TNF-α 是由巨噬细胞 β 单核细胞活化产生的一种可以引发瀑布式炎症反应的细胞因子[11]，在慢阻肺患者的痰液、血液、肺泡灌洗液、肺活检标本中均可发现升高[12-14]。而且，国外学者在一项以慢阻肺大鼠为模型的研究中发现，在大鼠肺泡壁和气道肺泡表面活性蛋白 C 生成细胞中表现出 TNF-α 和某些金属蛋白酶的过表达[15]，提示有 TNF-α 相关基因的参与。人 TNF-α 基因位于 6 号染色体 p21.1-p21.3 区域，由 3 个内含子和 2 个外显子组成。目前已发现其与慢阻肺有关的基因多态位点有–308G/A、–238G/A、–863C/A、+489G/A 等[16-18]。但针对 TNF-α 基因多态性与慢阻肺发病风险的关系，在不同种族群体、性别、年龄等中进行的研究结论不尽一致，甚至出现矛盾的结果。为了进一步探讨 TNF-α 与慢阻肺易感性的关系，本研究采用病例对照的研究方法，综合分析 TNF-α 的多态位点是否与慢阻肺的发病有关。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 研究对象
选取 2016 年 1 月至 2017 年 1 月在佳木斯大学附属第一医院呼吸内科住院、门诊确诊的慢阻肺患者 347 例为病例组，男 172 例，女 168 例，平均年龄（63.7±11.7）岁。随机选择同期本院体检中心的健康体检人群 338 例作为对照组，男 171 例，女 167 例，平均年龄（60.8±12.5）岁。其中病例组患者再按照中华医学会呼吸分会慢性阻塞性肺疾病学组修订的《慢性阻塞性肺疾病治疗指南》[19]（2016 年）严重程度的分级标准分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。入组者均为黑龙江东部地区常住居民，相互之间均无血缘关系，均签署知情同意。该研究经佳木斯大学附属第一医院、北京医院伦理委员会批准。
1.1.2 纳入标准
（1）慢性支气管炎症状及病史；（2）肺气肿体征；（3）使用支气管舒张剂后第 1 秒用力呼气容积（forced expiratory volume in 1 second，FEV1）/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）<70%。均符合 2017 年 GOLD 指南中慢阻肺的诊断标准[2]和慢阻肺急性加重诊治专家共识[20]（2014 年版）。
1.1.3 排除标准
同时合并有支气管扩张、哮喘、肺囊性纤维化、间质性肺纤维化、活动性肺结核或肺外结核以及其他重要肺部疾病；其他进展性全身性或慢性致命性疾病，包括心血管、神经、内分泌、血液、肝肾疾病或恶性肿瘤。
1.2 方法
1.2.1 肺功能检测
采用德国公司 JAEGER 肺功能检测仪。测定前静坐 10 min 测定过程中保持坐位，测定 FEV1 占预计值百分比（FEV1%pred）、FEV1/FVC，以 3 次测定值中最高值作为最终肺功能测定值。
1.2.2 采血
入选者于清晨空腹状态下采取静脉全血 3 ml，置于抗凝管，尽快转移至 –80 ℃ 超低温冰箱中冻存。
1.2.3 基因组 DNA 提取
采用 TIANGEN 血液基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱型，目录号 DP348，北京天根生化科技有限公司）提取 DNA，严格按照说明书操作。具体步骤为：充分混匀血样，加入 CL 裂解红细胞，混匀后 8 000 r/mim 离心 5 min，倒掉上清，加入 Buffer GS 震荡至彻底混匀，再加入 Buffer GB 和蛋白酶 K 裂解白细胞，放入 60 ℃ 烘箱 60 min，期间颠倒混匀数次，之后加入 Buffer BD 充分混匀后装入吸附柱 12 000 r/mim 离心 30 s，倒掉废液加入 Buffer GDB 洗涤、Buffer PWB 洗涤，晾干洗涤液后将离心柱转移至无菌离心管，加 100 μl 超纯水洗脱 DNA，12 000 r/mim 离心 2 min 收集 DNA。使用 Nano Drop 系统（Thermo Scientific，Wilming，DE，美国）通过紫外线吸收分光光度法在 260 nm 波长下定量 DNA。
1.2.4 引物的设计与选择
通过查阅相关文献得到目的基因编号，使用 National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库得到目的基因序列，取目的位点上游 40 bp，下游 40 bp 使用 Primer 3（Version 4.0）或 NCBI 中 Primer-BLAST tool 设计引物，规定产物长度 40～70 bp，遵循引物设计原则：引物长度 18～27 bp，GC%：40%～60%，退火温度 60 ℃ 左右，上下游 GC 含量保持接近，不引起二聚体和发卡结构。设计好的引物通过 University of California Santa Cruz（UCSC）数据库中 In-silico PCR tool 进行特异性检验。所设计引物由北京擎科生物有限公司合成（表 1）。
表1
TNF-α 多态性信息及引物
1.2.5 基因片段的扩增
采用 Bio-Rad CFX 96 实时 PCR system（Bio-Rad，USA）聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）进行扩增，建立 PCR 反应体系（10 μl）：2×PCR Super Mix 5.0 μl；超纯水 2.8 μl；LC Green 饱和荧光染料（北京思博全科技有限公司）0.8 μl；内参（上海生工生物工程股份有限公司）0.2 μl；引物，GF 0.1 μl，GR 0.1 μl；DNA 稀释液（取 1 ml/C μl DNA 原液，加超纯水补足至 50 μl）。反应条件：95 ℃ 预变性 3 min，95 ℃ 变性 30s，在各自的退火温度下退火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 45 个循环，72 ℃ 终末延伸 5 min。
1.2.6 基因分型
采用 Light Scanner96 高分辨熔解曲线突变检测系统 HRM（Idaho，USA）进行数据分析，对样本进行分型，并根据熔解顺序确定基因型。高分辨溶解范围 70～85 ℃，每次升温 0.1 ℃，维持 2 s，HRM 通过自动采集数据并自动执行增益校正。
1.2.7 PCR 产物直接测序法验证
将扩增好的产物送往北京擎科生物有限公司进行 DNA 序列测定。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 20.0 统计软件。直接计算法计算等位基因及基因型频率，计量资料用均数±标准差（
±s）表示。各组间不同指标差异采用单因素方差分析。两组肺功能比较，符合正态分布采用两独立样本 t 检验，不符合采用秩合检验，多组肺功能均数两两比较，方差齐性时采用 LSD 检验，方差不齐采用 Dunnett’ s T（3） 检验。两组基因型频率比较采用独立样本 χ2 检验，三组间比较采用 2×C 列联表 χ2 检验。其中，共显性模型为 AA、AG、GG 三者比较，显性模型为 GG 与（AA+AG）的比较，隐性模型为 AA 与（AG+GG）的比较，超显性模型为 AG 与（AA+GG）的比较（–863 位点的突变为 C/A，其模型比较为 AA、AC、CC 的比较）。两组样本与基因遗传平衡定律（Hardy-Weinberg 平衡）的符合程度用 χ2 检验分析。多个分类变量因素应用 logistics 回归分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病例组与对照组间一般情况比较
两组研究对象性别、年龄差异不具有统计学意义（P>0.05），但吸烟史差异有统计学意义（P<0.05），结果见表 2。吸烟分层分析结果无统计学意义（P>0.05）。
表2
研究人群的基线资料
2.2 遗传平衡定律检验
TNF-α 基因 –308G/A、–238G/A、–863C/A、–850G/A、+489G/A 各基因型进行软件分析，对照组样本中 –308G/A、–238G/A、+489G/A、–850G/A 均符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P>0.05），表明本研究样本群体具有较好的遗传代表性，–863C/A 不符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P<0.05），可能该位点发生基因突变或基因迁入。结果见表 3。
表3
对照组 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验
2.3 两组 TNF-α 多态位点基因型频率、等位基因频率比较
两组人群中 rs1800629（–308G/A）、rs1800610（+489G/A）、rs1799724（–850G/A）检出 AA、AG、GG 三种基因型，rs1800630（–863C/A）检出 AA、AC、CC 三种基因型，rs361525（–238G/A）只检出 GG 一种基因型，未检测出突变基因。建立各位点基因模型，其中 –238G/A、–863C/A、+489G/A 位点基因型在病例组和对照组中的分布频率，差异无统计学意义（P>0.05）；–308G/A 共显性模型和隐性模型在两组间差异有统计学意义（共显性 P=0.036，OR 1.512，95%CI 1.023～2.234）；隐性 P=0.027，OR 1.202，95%CI 1.024～1.741）；–850G/A 共显性模型、显性模型和超显性模型在两组间差异均有统计学意义（共显性 P=0.000，OR 1.781，95%CI 1.363～2.329；显性 P=0.000，OR 0.391 7，95%CI 0.270～0.568；超显性 P=0.000，OR 2.680，95%CI 1.728～4.156）。结果见表 4。
表4
慢阻肺组和对照组 TNF-α 单核苷酸多态性的基因型频率
TNF-α –238、–863、+489 位点等位基因频率在病例组和对照组之间比较差异无统计学意义（P>0.05），–308、–850 等位基因频率病例组和对照组之间差异有统计学意义（–308 位点 P=0.036，OR 1.51，95%CI 1.02～2.23；–850 位点 P=0.000，OR 2.19，95%CI 1.61～2.98）。结果见表 5。
表5
慢阻肺组和对照组 TNF-α 单核苷酸多态性的等位基因频率比较
2.4 遗传不平衡单倍型分析结果
TNF-α –863、+489、–308、–850 位点进入遗传不平衡单倍型分析。连锁不平衡测试结果显示–308G/A、–863C/A、+489G/A、–850G/A 位点总体之间不存在连锁关系，即趋于遗传平衡，单倍型分析及单倍体基因型分析结果显示+489、–308、–850 位点分别为 A、G、A 时有统计学意义（P<0.05，OR>1，95%CI >1）。结果见表 6、7。
表6
慢阻肺组和对照组各位点单倍型分析
表7
慢阻肺组和对照组各位点单倍体基因型分析
2.5 慢阻肺组基因多态与肺功能分级关系
病例组中按照肺功能分级相比较，–308G/A、–863C/A 位点突变基因组与野生型肺功能差异有统计学意义（P=0.038，P=0.020），+489G/A、–850G/A 位点突变基因与野生型肺功能差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表 8。
表8
病例组基因型表型与肺功能分级关系分析
3 讨论
慢阻肺的病理基础是持续的炎症导致小气道狭窄、肺泡壁损伤以及肺实质降解和结构破坏。TNF-α 是人体内最主要的炎症因子之一，能诱导其他介质发生瀑布式聚集反应。肺组织内炎症介质长期聚集形成的慢性黏液高分泌状态，可直接破坏肺结缔组织，同时高密度的黏液可使气道黏液栓形成、肺泡弹力受限，小气道炎症加剧会使纤维组织形成从而导致气道重塑，气道阻力增大，肺弹性减弱，持续性气流受限而发展为慢阻肺。大量临床研究已表明慢阻肺患者痰液及循环血中均可检测出 TNF-α 水平增高[12-14]，提示 TNF-α 确实在慢阻肺发生发展中起到重要的作用。
本研究中慢阻肺患者诊断确实，均符合国际公认的诊断标准[2, 17]。研究结果中显示吸烟史差异在慢阻肺病例组和对照组中统计学意义，说明吸烟是慢阻肺发生发展的主要危险因素之一。但再根据吸烟情况进行分层分析时，发现吸烟人群的 TNF-α 多态性与慢阻肺发病并无显著相关性，表明吸烟状况可能不会影响 TNF-α 多态与慢阻肺易感性。本研究基因分型采用 HRM 分析，相较于传统单核苷酸多态性分型方法，HRM 分析不受突变碱基位点及突变类型的影响，且不需要特异序列的探针，操作简便快速，研究结果准确可信。在基因表型和等位基因频率分析中，本研究显示 TNF-α –308 位点共显性模型和隐性模型在病例组和对照组间有统计学差异，OR>1，95%CI >1，提示–308 位点上 AA 基因型可能是慢阻肺的危险因素，AA 纯合子基因型患者发病率风险较高。–308 位点等位基因频率与慢阻肺发病显著相关，OR>1，95%CI >1，说明 A 等位基因是慢阻肺的危险因素，这与上述基因表型概率所提示结果一致，也与 Sakao 等[21]在日本人群、Huang 等[22]在中国台湾人群和 Ozdogan 等[23]在土耳其人群中的研究结果一致。–863、–238、+489 位点等位基因频率与慢阻肺发病均无显著相关，这与 Teramoto 等[24]、Gingo 等[25]研究结果相似，但 Cui 等[18]、Chiang 等[26]、Küçükaycan 等[27]均发现这些位点可能与慢阻肺的发病有关，提示这些位点在不同人群中对慢阻肺的影响或许有不同，可能与人种、民族、或地域、生活差异等有关。单倍型分析结果显示当 +489、–308、–850 分别为 A、G、A 时病例组与对照组差异显著，OR<1，95%CI <1，提示 AGA 连锁遗传可能是慢阻肺的危险因素，此三位点基因型为 AGA 的患者发病风险较高。病例组按肺功能分级比较结果中，–308、–863 位点多态性与肺功能差异有显著相关性，+489 位点无相关性，提示 –308 中 A 等位基因、–863 中 A 等位基因与慢阻肺肺功能恶化有关，此二位点含 A 等位基因的慢阻肺患者肺功能下降速率更快、疾病更易恶化。本研究人群中 TNF-α –238 基因只检出 G 位点，未发现多态性。
黑龙江省是我国慢阻肺高发地区之一，这可能与黑龙江省地处高纬度寒冷地区有关（北纬 43°25’至北纬 53°33’），长期吸入寒冷空气刺激气道诱发气道炎症反应最终引发慢阻肺。本研究中 Hard-Weinberg 遗传平衡检验显示 TNF-α –308、–238、+489、–850 均符合遗传平衡，表示此四个位点的对照研究样本具有较好的遗传代表性。–863 位点不符合遗传平衡，可能与 300 年前中国历史上最大规模的人口迁移—闯关东有关，后续研究进一步扩大样本以减小其影响。
综上所述，在黑龙江省东部地区人群中，TNF-α –308 位点上 A 等位基因可能是慢阻肺的危险因素，AA 纯合子基因型患者发病率风险较高。–850 位点 G 等位基因可能是慢阻肺的危险因素。当+489、–308、–850 分别为 A、G、A 时可能是慢阻肺的危险因素，此三位点基因型为 AGA 的患者发病风险较高。TNF-α –308 中 A 等位基因、–863 中 A 等位基因与慢阻肺肺功能恶化有关，此二位点含 A 等位基因的慢阻肺患者肺功能下降速率更高、更易恶化。本研究未发现 TNF-α –238 多态位点与慢阻肺相关性，这有待于扩大样本量及不同人群进一步研究两者是否关联。
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是全球高致死率、高致残率、高患病率的慢性疾病之一[1]。2017 年慢性阻塞性肺疾病全球倡议（GOLD）将慢阻肺定义为一种可防可治的常见疾病，其特征是持续存在的气流受限和呼吸道症状，且常呈进展性，与有害颗粒或气体暴露导致的气道慢性炎症和（或）肺泡异常有关[2]。吸烟被认为是慢阻肺发生过程中的主要危险因子，但只有 10%～20% 的吸烟人群发展为慢阻肺[3]，而慢阻肺患者中无吸烟史者也占了相当大比例[4]，表明慢阻肺发生发展过程中仍有其他因素的参与[5-7]。研究表明，导致人群肺功能下降的原因中吸烟仅占 15%，包括环境因素的其他因素占 30%，遗传因素占 55%[8-9]，而慢阻肺与反复发作的炎症反应密切相关[10]。因此，世界各地的研究者们将目光投向了可以反映炎症水平的生物标志物及其与慢阻肺临床分期的关系上。已经证实有关的标志物有白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8 以及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等。TNF-α 是由巨噬细胞 β 单核细胞活化产生的一种可以引发瀑布式炎症反应的细胞因子[11]，在慢阻肺患者的痰液、血液、肺泡灌洗液、肺活检标本中均可发现升高[12-14]。而且，国外学者在一项以慢阻肺大鼠为模型的研究中发现，在大鼠肺泡壁和气道肺泡表面活性蛋白 C 生成细胞中表现出 TNF-α 和某些金属蛋白酶的过表达[15]，提示有 TNF-α 相关基因的参与。人 TNF-α 基因位于 6 号染色体 p21.1-p21.3 区域，由 3 个内含子和 2 个外显子组成。目前已发现其与慢阻肺有关的基因多态位点有–308G/A、–238G/A、–863C/A、+489G/A 等[16-18]。但针对 TNF-α 基因多态性与慢阻肺发病风险的关系，在不同种族群体、性别、年龄等中进行的研究结论不尽一致，甚至出现矛盾的结果。为了进一步探讨 TNF-α 与慢阻肺易感性的关系，本研究采用病例对照的研究方法，综合分析 TNF-α 的多态位点是否与慢阻肺的发病有关。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 研究对象
选取 2016 年 1 月至 2017 年 1 月在佳木斯大学附属第一医院呼吸内科住院、门诊确诊的慢阻肺患者 347 例为病例组，男 172 例，女 168 例，平均年龄（63.7±11.7）岁。随机选择同期本院体检中心的健康体检人群 338 例作为对照组，男 171 例，女 167 例，平均年龄（60.8±12.5）岁。其中病例组患者再按照中华医学会呼吸分会慢性阻塞性肺疾病学组修订的《慢性阻塞性肺疾病治疗指南》[19]（2016 年）严重程度的分级标准分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。入组者均为黑龙江东部地区常住居民，相互之间均无血缘关系，均签署知情同意。该研究经佳木斯大学附属第一医院、北京医院伦理委员会批准。
1.1.2 纳入标准
（1）慢性支气管炎症状及病史；（2）肺气肿体征；（3）使用支气管舒张剂后第 1 秒用力呼气容积（forced expiratory volume in 1 second，FEV1）/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）<70%。均符合 2017 年 GOLD 指南中慢阻肺的诊断标准[2]和慢阻肺急性加重诊治专家共识[20]（2014 年版）。
1.1.3 排除标准
同时合并有支气管扩张、哮喘、肺囊性纤维化、间质性肺纤维化、活动性肺结核或肺外结核以及其他重要肺部疾病；其他进展性全身性或慢性致命性疾病，包括心血管、神经、内分泌、血液、肝肾疾病或恶性肿瘤。
1.2 方法
1.2.1 肺功能检测
采用德国公司 JAEGER 肺功能检测仪。测定前静坐 10 min 测定过程中保持坐位，测定 FEV1 占预计值百分比（FEV1%pred）、FEV1/FVC，以 3 次测定值中最高值作为最终肺功能测定值。
1.2.2 采血
入选者于清晨空腹状态下采取静脉全血 3 ml，置于抗凝管，尽快转移至 –80 ℃ 超低温冰箱中冻存。
1.2.3 基因组 DNA 提取
采用 TIANGEN 血液基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱型，目录号 DP348，北京天根生化科技有限公司）提取 DNA，严格按照说明书操作。具体步骤为：充分混匀血样，加入 CL 裂解红细胞，混匀后 8 000 r/mim 离心 5 min，倒掉上清，加入 Buffer GS 震荡至彻底混匀，再加入 Buffer GB 和蛋白酶 K 裂解白细胞，放入 60 ℃ 烘箱 60 min，期间颠倒混匀数次，之后加入 Buffer BD 充分混匀后装入吸附柱 12 000 r/mim 离心 30 s，倒掉废液加入 Buffer GDB 洗涤、Buffer PWB 洗涤，晾干洗涤液后将离心柱转移至无菌离心管，加 100 μl 超纯水洗脱 DNA，12 000 r/mim 离心 2 min 收集 DNA。使用 Nano Drop 系统（Thermo Scientific，Wilming，DE，美国）通过紫外线吸收分光光度法在 260 nm 波长下定量 DNA。
1.2.4 引物的设计与选择
通过查阅相关文献得到目的基因编号，使用 National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库得到目的基因序列，取目的位点上游 40 bp，下游 40 bp 使用 Primer 3（Version 4.0）或 NCBI 中 Primer-BLAST tool 设计引物，规定产物长度 40～70 bp，遵循引物设计原则：引物长度 18～27 bp，GC%：40%～60%，退火温度 60 ℃ 左右，上下游 GC 含量保持接近，不引起二聚体和发卡结构。设计好的引物通过 University of California Santa Cruz（UCSC）数据库中 In-silico PCR tool 进行特异性检验。所设计引物由北京擎科生物有限公司合成（表 1）。
表1
TNF-α 多态性信息及引物
1.2.5 基因片段的扩增
采用 Bio-Rad CFX 96 实时 PCR system（Bio-Rad，USA）聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）进行扩增，建立 PCR 反应体系（10 μl）：2×PCR Super Mix 5.0 μl；超纯水 2.8 μl；LC Green 饱和荧光染料（北京思博全科技有限公司）0.8 μl；内参（上海生工生物工程股份有限公司）0.2 μl；引物，GF 0.1 μl，GR 0.1 μl；DNA 稀释液（取 1 ml/C μl DNA 原液，加超纯水补足至 50 μl）。反应条件：95 ℃ 预变性 3 min，95 ℃ 变性 30s，在各自的退火温度下退火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 45 个循环，72 ℃ 终末延伸 5 min。
1.2.6 基因分型
采用 Light Scanner96 高分辨熔解曲线突变检测系统 HRM（Idaho，USA）进行数据分析，对样本进行分型，并根据熔解顺序确定基因型。高分辨溶解范围 70～85 ℃，每次升温 0.1 ℃，维持 2 s，HRM 通过自动采集数据并自动执行增益校正。
1.2.7 PCR 产物直接测序法验证
将扩增好的产物送往北京擎科生物有限公司进行 DNA 序列测定。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 20.0 统计软件。直接计算法计算等位基因及基因型频率，计量资料用均数±标准差（±s）表示。各组间不同指标差异采用单因素方差分析。两组肺功能比较，符合正态分布采用两独立样本 t 检验，不符合采用秩合检验，多组肺功能均数两两比较，方差齐性时采用 LSD 检验，方差不齐采用 Dunnett’ s T（3） 检验。两组基因型频率比较采用独立样本 χ2 检验，三组间比较采用 2×C 列联表 χ2 检验。其中，共显性模型为 AA、AG、GG 三者比较，显性模型为 GG 与（AA+AG）的比较，隐性模型为 AA 与（AG+GG）的比较，超显性模型为 AG 与（AA+GG）的比较（–863 位点的突变为 C/A，其模型比较为 AA、AC、CC 的比较）。两组样本与基因遗传平衡定律（Hardy-Weinberg 平衡）的符合程度用 χ2 检验分析。多个分类变量因素应用 logistics 回归分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病例组与对照组间一般情况比较
两组研究对象性别、年龄差异不具有统计学意义（P>0.05），但吸烟史差异有统计学意义（P<0.05），结果见表 2。吸烟分层分析结果无统计学意义（P>0.05）。
表2
研究人群的基线资料
2.2 遗传平衡定律检验
TNF-α 基因 –308G/A、–238G/A、–863C/A、–850G/A、+489G/A 各基因型进行软件分析，对照组样本中 –308G/A、–238G/A、+489G/A、–850G/A 均符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P>0.05），表明本研究样本群体具有较好的遗传代表性，–863C/A 不符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P<0.05），可能该位点发生基因突变或基因迁入。结果见表 3。
表3
对照组 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验
2.3 两组 TNF-α 多态位点基因型频率、等位基因频率比较
两组人群中 rs1800629（–308G/A）、rs1800610（+489G/A）、rs1799724（–850G/A）检出 AA、AG、GG 三种基因型，rs1800630（–863C/A）检出 AA、AC、CC 三种基因型，rs361525（–238G/A）只检出 GG 一种基因型，未检测出突变基因。建立各位点基因模型，其中 –238G/A、–863C/A、+489G/A 位点基因型在病例组和对照组中的分布频率，差异无统计学意义（P>0.05）；–308G/A 共显性模型和隐性模型在两组间差异有统计学意义（共显性 P=0.036，OR 1.512，95%CI 1.023～2.234）；隐性 P=0.027，OR 1.202，95%CI 1.024～1.741）；–850G/A 共显性模型、显性模型和超显性模型在两组间差异均有统计学意义（共显性 P=0.000，OR 1.781，95%CI 1.363～2.329；显性 P=0.000，OR 0.391 7，95%CI 0.270～0.568；超显性 P=0.000，OR 2.680，95%CI 1.728～4.156）。结果见表 4。
表4
慢阻肺组和对照组 TNF-α 单核苷酸多态性的基因型频率
TNF-α –238、–863、+489 位点等位基因频率在病例组和对照组之间比较差异无统计学意义（P>0.05），–308、–850 等位基因频率病例组和对照组之间差异有统计学意义（–308 位点 P=0.036，OR 1.51，95%CI 1.02～2.23；–850 位点 P=0.000，OR 2.19，95%CI 1.61～2.98）。结果见表 5。
表5
慢阻肺组和对照组 TNF-α 单核苷酸多态性的等位基因频率比较
2.4 遗传不平衡单倍型分析结果
TNF-α –863、+489、–308、–850 位点进入遗传不平衡单倍型分析。连锁不平衡测试结果显示–308G/A、–863C/A、+489G/A、–850G/A 位点总体之间不存在连锁关系，即趋于遗传平衡，单倍型分析及单倍体基因型分析结果显示+489、–308、–850 位点分别为 A、G、A 时有统计学意义（P<0.05，OR>1，95%CI >1）。结果见表 6、7。
表6
慢阻肺组和对照组各位点单倍型分析
表7
慢阻肺组和对照组各位点单倍体基因型分析
2.5 慢阻肺组基因多态与肺功能分级关系
病例组中按照肺功能分级相比较，–308G/A、–863C/A 位点突变基因组与野生型肺功能差异有统计学意义（P=0.038，P=0.020），+489G/A、–850G/A 位点突变基因与野生型肺功能差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表 8。
表8
病例组基因型表型与肺功能分级关系分析
3 讨论
慢阻肺的病理基础是持续的炎症导致小气道狭窄、肺泡壁损伤以及肺实质降解和结构破坏。TNF-α 是人体内最主要的炎症因子之一，能诱导其他介质发生瀑布式聚集反应。肺组织内炎症介质长期聚集形成的慢性黏液高分泌状态，可直接破坏肺结缔组织，同时高密度的黏液可使气道黏液栓形成、肺泡弹力受限，小气道炎症加剧会使纤维组织形成从而导致气道重塑，气道阻力增大，肺弹性减弱，持续性气流受限而发展为慢阻肺。大量临床研究已表明慢阻肺患者痰液及循环血中均可检测出 TNF-α 水平增高[12-14]，提示 TNF-α 确实在慢阻肺发生发展中起到重要的作用。
本研究中慢阻肺患者诊断确实，均符合国际公认的诊断标准[2, 17]。研究结果中显示吸烟史差异在慢阻肺病例组和对照组中统计学意义，说明吸烟是慢阻肺发生发展的主要危险因素之一。但再根据吸烟情况进行分层分析时，发现吸烟人群的 TNF-α 多态性与慢阻肺发病并无显著相关性，表明吸烟状况可能不会影响 TNF-α 多态与慢阻肺易感性。本研究基因分型采用 HRM 分析，相较于传统单核苷酸多态性分型方法，HRM 分析不受突变碱基位点及突变类型的影响，且不需要特异序列的探针，操作简便快速，研究结果准确可信。在基因表型和等位基因频率分析中，本研究显示 TNF-α –308 位点共显性模型和隐性模型在病例组和对照组间有统计学差异，OR>1，95%CI >1，提示–308 位点上 AA 基因型可能是慢阻肺的危险因素，AA 纯合子基因型患者发病率风险较高。–308 位点等位基因频率与慢阻肺发病显著相关，OR>1，95%CI >1，说明 A 等位基因是慢阻肺的危险因素，这与上述基因表型概率所提示结果一致，也与 Sakao 等[21]在日本人群、Huang 等[22]在中国台湾人群和 Ozdogan 等[23]在土耳其人群中的研究结果一致。–863、–238、+489 位点等位基因频率与慢阻肺发病均无显著相关，这与 Teramoto 等[24]、Gingo 等[25]研究结果相似，但 Cui 等[18]、Chiang 等[26]、Küçükaycan 等[27]均发现这些位点可能与慢阻肺的发病有关，提示这些位点在不同人群中对慢阻肺的影响或许有不同，可能与人种、民族、或地域、生活差异等有关。单倍型分析结果显示当 +489、–308、–850 分别为 A、G、A 时病例组与对照组差异显著，OR<1，95%CI <1，提示 AGA 连锁遗传可能是慢阻肺的危险因素，此三位点基因型为 AGA 的患者发病风险较高。病例组按肺功能分级比较结果中，–308、–863 位点多态性与肺功能差异有显著相关性，+489 位点无相关性，提示 –308 中 A 等位基因、–863 中 A 等位基因与慢阻肺肺功能恶化有关，此二位点含 A 等位基因的慢阻肺患者肺功能下降速率更快、疾病更易恶化。本研究人群中 TNF-α –238 基因只检出 G 位点，未发现多态性。
黑龙江省是我国慢阻肺高发地区之一，这可能与黑龙江省地处高纬度寒冷地区有关（北纬 43°25’至北纬 53°33’），长期吸入寒冷空气刺激气道诱发气道炎症反应最终引发慢阻肺。本研究中 Hard-Weinberg 遗传平衡检验显示 TNF-α –308、–238、+489、–850 均符合遗传平衡，表示此四个位点的对照研究样本具有较好的遗传代表性。–863 位点不符合遗传平衡，可能与 300 年前中国历史上最大规模的人口迁移—闯关东有关，后续研究进一步扩大样本以减小其影响。
综上所述，在黑龙江省东部地区人群中，TNF-α –308 位点上 A 等位基因可能是慢阻肺的危险因素，AA 纯合子基因型患者发病率风险较高。–850 位点 G 等位基因可能是慢阻肺的危险因素。当+489、–308、–850 分别为 A、G、A 时可能是慢阻肺的危险因素，此三位点基因型为 AGA 的患者发病风险较高。TNF-α –308 中 A 等位基因、–863 中 A 等位基因与慢阻肺肺功能恶化有关，此二位点含 A 等位基因的慢阻肺患者肺功能下降速率更高、更易恶化。本研究未发现 TNF-α –238 多态位点与慢阻肺相关性，这有待于扩大样本量及不同人群进一步研究两者是否关联。
