引用本文： 刘峰, 周向东, 余红梅, 李琪, 钟有清. Elafin 对气道上皮细胞黏蛋白 5AC 的调节作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2018, 17(3): 296-300. doi: 10.7507/1671-6205.201711009 复制
气道黏液高分泌是慢性气道炎症的重要病理特征之一，同时也是目前呼吸系统疾病方面函待解决的重要问题之一[1]。气道病理性黏液产生的主要原因是黏蛋白的过度表达，气道黏蛋白（mucin，MUC）的主要病理表型为 MUC5AC[2-3]。MUC5AC 是气道内主要的分泌型 MUC，同时也是超负荷生成病理性黏液中的重要成分。有研究表明，天然内生多肽 Elafin 可以抑制转录激活蛋白-1（activator protein 1，AP-1）的上调，以及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的 DNA 结合活性[4-6]。MUC5AC 的转录启动与增强与 AP-1、NF-κB 及特殊蛋白-1 等转录因子紧密相关[7-8]。本研究选用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及香烟做为实验刺激因素来诱导气道黏液的高分泌，探讨 Elafin 对气道上皮细胞 MUC5AC 的调节作用，以期为气道黏液高分泌的临床治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
16HBE 人气道上皮细胞株购自上海复祥生物科技有限公司。
1.1.2 主要试剂
pEGFP-N1-Elafin（重庆医科大学附属第二医院呼吸内科杨捷博士提供[9]）；从铜绿假单胞菌提取的 LPS（美国 Sigma 公司）；胃黏蛋白标准品（美国 Sigma 公司）；鼠抗 MUC5AC 单克隆抗体（MAB2011，美国 CHEMICON 公司）；异硫氰酸标记的羊抗鼠荧光素 IgG、辣根酶标记羊抗兔及鼠 IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；ELISA 试剂盒（武汉博士德公司）；RPMI 1640 培养基（美国 Gibco 公司）；胎牛血清（美国 Gibco 公司）；RIPA 蛋白裂解液（北京碧云天生物技术研究所）；4% 的多聚甲醛。
1.2 方法
1.2.1 细胞的培养
将人气道上皮细胞 16HBE 细胞放置于 6 孔培养板中培养，每孔约为 4×105～5×105个细胞，再加入 2 ml 含 10% 小牛血清 RPMI 1640 培养液，于 37 ℃、50% CO2、饱和湿度培养箱孵育，进行常规换液培养，细胞融合至 70%～80% 时传代。
1.2.2 香烟烟雾提取物（CSE）的制备
用燃烧的骆驼牌香烟，采用注射器驱动装置，以 1 吸喷周期/min的速率进行连续抽吸（35 ml/吸喷周期）。吸入的烟雾经过三通管，缓慢注入 20 ml 含 50 mmol/L HEPES 的 RPMI 1640 培养液中制做成悬液，密封于瓶内摇动使其充分溶解，滴定至 pH=7.4。经过 0.22 μm 醋酸纤维过滤除菌，存于冰中。使用前将过滤装置在 37 ℃、5% CO2 的条件下孵育 1 h，并使用无血清培养基，将该悬液配制成最终浓度为 1 g/L（每升含有 1 g 烟雾微粒）的工作液。
1.2.3 MTT 法选取最佳的 LPS 及 CSE 浓度
（1）MTT 液配置：取 MTT 50 mg，加入 10 ml PBS 液（0.01 mmol/L，pH 7.4），震荡搅拌直至充分溶解，经过 0.22 μm 的针头式微孔滤器进行过滤除菌，于–4 ℃ 保存。（2）测定不同浓度 LPS 及 CSE 对细胞活力的影响：16HBE 细胞培养于 96 孔板上，按照密度约为 1×104/ml 每孔加入 200 μl 的细胞悬液，再常规培养至 70%～80% 后，换成新鲜无血清培养液继续培养，于 24 h 后换液，加入不同浓度的刺激因素，即 1、5、10、20 μg/ml 的 LPS，以及 0.25、0.5、1、2 g/L 的 CSE。设定未加任何刺激因素，而仅加培养液的细胞为对照。取 8、16、24 及 36 h 时间点进行 MTT 测定。弃去培养液，加入 20 μl MTT 液，以及 200 μl 无血清 RPMI 1640 培养液，再继续培养 4 h 后，每孔加入 150 μl 二甲基亚砜。于室温下振荡 15 min，在自动酶标仪上以 570 nm 波长测定各孔吸光度值（A）。
1.2.4 LPS 刺激组细胞分组
在 6 孔板中培养 16HBE细胞，待细胞融合至 70%～80% 时开始传代，将细胞分为 4 组，每组 3 个复孔。（1）对照组：在无胎牛血清、无双抗的 1640 培养基中继续培养细胞；（2）LPS 刺激组：在无血清培养液中加入最终浓度为 10 μg/ml 的 LPS；（3）LPS+Elafin 组：用 0.4 μmol/LpEGFP-N1-Elafin 刺激，于 24 h 后加入最终浓度为 10 μg/ml 的 LPS；（4）Elafin 组：用 0.4 μmol/L pEGFP-N1-Elafin刺激 24 h。继续培养 24 h 后，分别收集上清和细胞进行检测，每组实验重复进行 6 次。
1.2.5 CSE 刺激组细胞分组
在 6 孔板中培养 16HBE 细胞，待细胞融合至 70%～80% 时开始传代，将细胞分为 4 组，每组有 3 个复孔。（1）对照组：在无胎牛血清、无双抗的 1640 培养基中继续培养细胞；（2）CSE 刺激组：在无血清培养液中加入最终浓度为 1 g/L 的 CSE；（3）CSE+Elafin 组：用 0.4 μmol/LpEGFP-N1-Elafin 刺激，于 24 h 后加入最终浓度为 1 g/L 的 CSE；（4）Elafin 组：用 0.4 μmol/L pEGFP-N1-Elafin 刺激 24 h。继续培养 24 h 后，分别收集上清和细胞进行检测，每组实验重复 6 次。
1.2.6 细胞免疫荧光法观察胞内 MUC5AC 的蛋白表达
（1）多次清洗载玻片与血盖片，经泡酸、高温、高压以消毒灭菌。（2）将各组处于对数生长期的 16HBE 细胞消化后，行细胞计数，并接种到装有盖片的 24 孔板中，每孔接种的细胞数约为 1×105个，培养 24 h 后，改用无血清培养基，继续培养 24 h 后行进行分组培养。（3）弃去培养液，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（4）加入 4% 多聚甲醛，在室温下固定 30 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（5）在室温下，使用 0.4% Triton-X 100 反应 20 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（6）在室温下，加入羊血清工作液，进行非特异性封闭 30 min。（7）弃去羊血清工作液，加入一抗为小鼠抗人 MUC5AC 单克隆抗体（1∶500），于湿盒内 4 ℃ 过夜，次日使用 0.01 mol/LPBS 漂洗 3×5 min/次。（8）加入二抗为异硫氰酸标记的羊抗鼠 IgG（1∶50），于室温下置暗盒内孵育 30 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（9）用少许的 50% 甘油封片，在激光共聚焦显微镜下观察。
1.2.7 ELISA 法检测细胞分泌的 MUC5AC 的蛋白含量
细胞采用预冷的 0.01 mmol/L 的 PBS 清洗（于冰上操作），加入 RIPA 裂解液（冰预冷），以及相应的 1/100 量苯甲基磺酰氟化物，轻轻晃动吹打后，转到 Eppendorf 管中冰浴 20 min。于 4 ℃ 离心 15 000 r/min×20 min，然后取出上清液。取少许的各种样本，采用二喹啉甲酸法测定其总蛋白含量。用 RIPA 裂解液调整蛋白浓度，以使各样本一致，然后用 PBS 稀释蛋白样本。取出各样本 100 μl，加入 96 孔酶标板，再置于 4 ℃ 的湿盒中过夜。小牛血清室温下封闭 1 h，分别加入小鼠抗 MUC5AC 单克隆抗体 45M1（1∶100，使用含 0.05% Tween-20 的 PBS 稀释至 50 μl）孵育 1 h，然后加入 100 μl 辣根过氧化物酶-羊抗小鼠 IgG（1∶10 000），孵育 1 h，经过四甲基联苯胺过氧化物酶显色后，测出各孔吸光度值（450 nm），并与标准品比较，得出 MUC5AC 的相对值。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 17.0 软件进行分析。根据方差齐性与否，分别采用参数检验与非参数检验，即齐性资料用单因素方差分析（ANOVA），结果用均数±标准差（
±s）表示，两两比较采用 LSD 检验，非齐性资料用秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度 LPS 对细胞增殖活力的影响
细胞经过 LPS 处理后，1、5 及 10 μg/ml 的浓度组，在各自时间点比较，增殖活力无明显改变。当浓度增加至 2 μg/ml 时，从第 16 h 起吸光度值开始降低，为 0.176±0.006，与正常对照组以及其他浓度组比较，差异有统计学意义（均 P<0.05）。与其他组比较，在 24 h 和 36 h 的吸光度值明显降低（均P<0.01）。结果见表 1。
表1
MTT 检测不同浓度 LPS 刺激对细胞增殖活力的影响（n=6，
）
2.2 不同浓度 CSE 对细胞增殖活力的影响
细胞经过 CSE 处理后，将 0.25、0.5 及 1 g/L 的浓度组在各自的时间点相比，增殖活力无明显改变。但是当浓度增加到 2 g/L 时，第 16 h 起，吸光度值开始出现降低，为 0.190±0.005，与正常对照组以及其他浓度组对比，差异有统计学意义（均 P<0.05）。与其他组比较，在 24 h 和 36 h 的吸光度值有明显降低（均P<0.01）。结果见表 2。
表2
MTT 检测不同浓度 CSE 刺激对细胞增殖活力的影响（n=6，
）
2.3 Elafin 对 LPS 及 CSE 诱导的 MUC5AC 胞内蛋白生成的影响
与对照组比较，LPS 刺激组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量明显增多。在 LPS 刺激前予 Elafin 预处理组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量低于单纯的 LPS 刺激组。与对照组比较，单纯予 Elafin 处理组细胞内的 MUC5AC 表达量显著降低。结果见图 1。
图1
LPS 及 Elafin 对 MUC5AC 胞内蛋白含量的影响
a. 对照组；b. LPS 处理组；c. LPS+Elafin 处理组；d. Elafin 处理组
与对照组比较，CSE 刺激组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量显著增多。在 CSE 刺激前予 Elafin 预处理组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量低于单纯的 CSE 刺激组。与对照组比较，单纯予 Elafin 处理组细胞内的 MUC5AC 表达量显著降低。结果见图 2。
图2
CSE 及 Elafin 对 MUC5AC 胞内蛋白含量的影响
a. 对照组；b. CSE 处理组；c. CSE+Elafin 处理组；d. Elafin 处理组
2.4 Elafin 对 LPS 及 CSE 诱导的 MUC5AC 蛋白分泌量的影响
与对照组比较，LPS 刺激组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平显著增高（P<0.01）。在 LPS 刺激前予 Elafin 预处理组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明显低于单纯的 LPS 刺激组（P<0.01）。与对照组比较，单纯予 Elafin 处理组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平显著降低（P<0.05）。结果见表 3。
表3
LPS 及 Elafin 对 MUC5AC 蛋白分泌量的影响（n=6，
，μg/ml）
与对照组比较，CSE 刺激组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）。在 CSE 刺激前予 Elafin 预处理组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明显低于单纯的 CSE 处理组（P<0.01）。与对照组比较，单纯予 Elafin 处理组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表 4。
表4
CSE 及 Elafin 对 MUC5AC 蛋白分泌量的影响（n=6，
，μg/ml）
3 讨论
Elafin 是近年来发现的一种小分子（相对分子质量 9 900）抗弹力酶特异性保护因子[10-11]。呼吸道 Elafin 主要由肺泡上皮细胞、Clara 细胞及肺泡巨噬细胞产生[12]，具有保护细胞外基质以及上皮细胞免于受中性粒细胞弹性蛋白酶溶解破坏的重要作用，并且显示出优良的抗菌作用，以及对阳离子蛋白酶的抑制作用[13-14]。Elafin 的这种多重有益效应以及其分子量小、穿透性好的特点，使其成为治疗慢性气道炎症的一种极其具希望和潜质的候选靶物质。因此，获取人工重组 Elafin 对于慢性气道炎症性疾病的治疗极其具有研究价值。
Elafin 具有的抗蛋白酶性使其在气道黏液高分泌的治疗中具有突出的优势[15]。既往对 Elafin 的研究多立足于其抗感染、抗蛋白酶等细胞外的作用上。本研究通过培养气道上皮细胞，采用 CSE 及 LPS 作为刺激因素，使用细胞免疫荧光法及 ELISA 法，分别检测各组气道上皮细胞 MUC5AC 的胞内蛋白及胞外蛋白分泌的表达情况。结果显示，与对照组比较，LPS 及 CSE 刺激组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平明显增多，在 LPS 及 CES 刺激前予 Elafin 预处理组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平低于单纯 LPS 及单纯 CES 刺激组，而单纯予 Elafin 处理组细胞内的 MUC5AC 表达量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平显著降低。因此，LPS 及 CSE 可以诱导炎症介质的产生，进而上调 MUC5AC 的胞内蛋白及分泌到胞外的蛋白的含量，从而促进慢性气道炎症的形成；而以 Elafin 进行干预可以明显降低 LPS 及 CSE 上调的上述指标水平。因此，可以得出结论，CSE 及 LPS 可增加 MUC5AC 的合成及分泌，而 Elafin 可显著抑制 CSE 及 LPS 的上述效应；Elafin 可以通过阻断气道黏蛋白的生成及分泌，从而达到抑制气道黏液高分泌的目的。
本实验选择 MUC5AC 作为炎症反应强度的指标，是因为 MUC5AC 是气道黏液中最重要的黏蛋白，而许多气道黏液高分泌疾病，如慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、支气管扩张等的病理生理改变都与其密切相关[16-17]。由于 MUC5AC 与慢性阻塞性肺疾病等慢性气道炎症疾病患者的病情进展和预后紧密相关，故本实验着重观察 Elafin 与 MUC5AC 的胞内蛋白及分泌到胞外的蛋白的关系，结果进一步提示 Elafin 可显著遏制 MUC5AC 的合成及分泌，从而降低了 MUC5AC 的病理性表达[18]。
目前国内外针对 Elafin 对气道黏液高分泌影响方面的研究不多，本研究在之前研究[19]的基础上进一步确认了 Elafin 在治疗气道黏液高分泌方面的积极效应，从而提示其在气道黏液高分泌的调控领域中可能发挥重要作用。因此，Elafin 纯化的表达产物在气道局部的治疗中将有较为广阔的临床应用前景。
气道黏液高分泌是慢性气道炎症的重要病理特征之一，同时也是目前呼吸系统疾病方面函待解决的重要问题之一[1]。气道病理性黏液产生的主要原因是黏蛋白的过度表达，气道黏蛋白（mucin，MUC）的主要病理表型为 MUC5AC[2-3]。MUC5AC 是气道内主要的分泌型 MUC，同时也是超负荷生成病理性黏液中的重要成分。有研究表明，天然内生多肽 Elafin 可以抑制转录激活蛋白-1（activator protein 1，AP-1）的上调，以及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的 DNA 结合活性[4-6]。MUC5AC 的转录启动与增强与 AP-1、NF-κB 及特殊蛋白-1 等转录因子紧密相关[7-8]。本研究选用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及香烟做为实验刺激因素来诱导气道黏液的高分泌，探讨 Elafin 对气道上皮细胞 MUC5AC 的调节作用，以期为气道黏液高分泌的临床治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
16HBE 人气道上皮细胞株购自上海复祥生物科技有限公司。
1.1.2 主要试剂
pEGFP-N1-Elafin（重庆医科大学附属第二医院呼吸内科杨捷博士提供[9]）；从铜绿假单胞菌提取的 LPS（美国 Sigma 公司）；胃黏蛋白标准品（美国 Sigma 公司）；鼠抗 MUC5AC 单克隆抗体（MAB2011，美国 CHEMICON 公司）；异硫氰酸标记的羊抗鼠荧光素 IgG、辣根酶标记羊抗兔及鼠 IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；ELISA 试剂盒（武汉博士德公司）；RPMI 1640 培养基（美国 Gibco 公司）；胎牛血清（美国 Gibco 公司）；RIPA 蛋白裂解液（北京碧云天生物技术研究所）；4% 的多聚甲醛。
1.2 方法
1.2.1 细胞的培养
将人气道上皮细胞 16HBE 细胞放置于 6 孔培养板中培养，每孔约为 4×105～5×105个细胞，再加入 2 ml 含 10% 小牛血清 RPMI 1640 培养液，于 37 ℃、50% CO2、饱和湿度培养箱孵育，进行常规换液培养，细胞融合至 70%～80% 时传代。
1.2.2 香烟烟雾提取物（CSE）的制备
用燃烧的骆驼牌香烟，采用注射器驱动装置，以 1 吸喷周期/min的速率进行连续抽吸（35 ml/吸喷周期）。吸入的烟雾经过三通管，缓慢注入 20 ml 含 50 mmol/L HEPES 的 RPMI 1640 培养液中制做成悬液，密封于瓶内摇动使其充分溶解，滴定至 pH=7.4。经过 0.22 μm 醋酸纤维过滤除菌，存于冰中。使用前将过滤装置在 37 ℃、5% CO2 的条件下孵育 1 h，并使用无血清培养基，将该悬液配制成最终浓度为 1 g/L（每升含有 1 g 烟雾微粒）的工作液。
1.2.3 MTT 法选取最佳的 LPS 及 CSE 浓度
（1）MTT 液配置：取 MTT 50 mg，加入 10 ml PBS 液（0.01 mmol/L，pH 7.4），震荡搅拌直至充分溶解，经过 0.22 μm 的针头式微孔滤器进行过滤除菌，于–4 ℃ 保存。（2）测定不同浓度 LPS 及 CSE 对细胞活力的影响：16HBE 细胞培养于 96 孔板上，按照密度约为 1×104/ml 每孔加入 200 μl 的细胞悬液，再常规培养至 70%～80% 后，换成新鲜无血清培养液继续培养，于 24 h 后换液，加入不同浓度的刺激因素，即 1、5、10、20 μg/ml 的 LPS，以及 0.25、0.5、1、2 g/L 的 CSE。设定未加任何刺激因素，而仅加培养液的细胞为对照。取 8、16、24 及 36 h 时间点进行 MTT 测定。弃去培养液，加入 20 μl MTT 液，以及 200 μl 无血清 RPMI 1640 培养液，再继续培养 4 h 后，每孔加入 150 μl 二甲基亚砜。于室温下振荡 15 min，在自动酶标仪上以 570 nm 波长测定各孔吸光度值（A）。
1.2.4 LPS 刺激组细胞分组
在 6 孔板中培养 16HBE细胞，待细胞融合至 70%～80% 时开始传代，将细胞分为 4 组，每组 3 个复孔。（1）对照组：在无胎牛血清、无双抗的 1640 培养基中继续培养细胞；（2）LPS 刺激组：在无血清培养液中加入最终浓度为 10 μg/ml 的 LPS；（3）LPS+Elafin 组：用 0.4 μmol/LpEGFP-N1-Elafin 刺激，于 24 h 后加入最终浓度为 10 μg/ml 的 LPS；（4）Elafin 组：用 0.4 μmol/L pEGFP-N1-Elafin刺激 24 h。继续培养 24 h 后，分别收集上清和细胞进行检测，每组实验重复进行 6 次。
1.2.5 CSE 刺激组细胞分组
在 6 孔板中培养 16HBE 细胞，待细胞融合至 70%～80% 时开始传代，将细胞分为 4 组，每组有 3 个复孔。（1）对照组：在无胎牛血清、无双抗的 1640 培养基中继续培养细胞；（2）CSE 刺激组：在无血清培养液中加入最终浓度为 1 g/L 的 CSE；（3）CSE+Elafin 组：用 0.4 μmol/LpEGFP-N1-Elafin 刺激，于 24 h 后加入最终浓度为 1 g/L 的 CSE；（4）Elafin 组：用 0.4 μmol/L pEGFP-N1-Elafin 刺激 24 h。继续培养 24 h 后，分别收集上清和细胞进行检测，每组实验重复 6 次。
1.2.6 细胞免疫荧光法观察胞内 MUC5AC 的蛋白表达
（1）多次清洗载玻片与血盖片，经泡酸、高温、高压以消毒灭菌。（2）将各组处于对数生长期的 16HBE 细胞消化后，行细胞计数，并接种到装有盖片的 24 孔板中，每孔接种的细胞数约为 1×105个，培养 24 h 后，改用无血清培养基，继续培养 24 h 后行进行分组培养。（3）弃去培养液，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（4）加入 4% 多聚甲醛，在室温下固定 30 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（5）在室温下，使用 0.4% Triton-X 100 反应 20 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（6）在室温下，加入羊血清工作液，进行非特异性封闭 30 min。（7）弃去羊血清工作液，加入一抗为小鼠抗人 MUC5AC 单克隆抗体（1∶500），于湿盒内 4 ℃ 过夜，次日使用 0.01 mol/LPBS 漂洗 3×5 min/次。（8）加入二抗为异硫氰酸标记的羊抗鼠 IgG（1∶50），于室温下置暗盒内孵育 30 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（9）用少许的 50% 甘油封片，在激光共聚焦显微镜下观察。
1.2.7 ELISA 法检测细胞分泌的 MUC5AC 的蛋白含量
细胞采用预冷的 0.01 mmol/L 的 PBS 清洗（于冰上操作），加入 RIPA 裂解液（冰预冷），以及相应的 1/100 量苯甲基磺酰氟化物，轻轻晃动吹打后，转到 Eppendorf 管中冰浴 20 min。于 4 ℃ 离心 15 000 r/min×20 min，然后取出上清液。取少许的各种样本，采用二喹啉甲酸法测定其总蛋白含量。用 RIPA 裂解液调整蛋白浓度，以使各样本一致，然后用 PBS 稀释蛋白样本。取出各样本 100 μl，加入 96 孔酶标板，再置于 4 ℃ 的湿盒中过夜。小牛血清室温下封闭 1 h，分别加入小鼠抗 MUC5AC 单克隆抗体 45M1（1∶100，使用含 0.05% Tween-20 的 PBS 稀释至 50 μl）孵育 1 h，然后加入 100 μl 辣根过氧化物酶-羊抗小鼠 IgG（1∶10 000），孵育 1 h，经过四甲基联苯胺过氧化物酶显色后，测出各孔吸光度值（450 nm），并与标准品比较，得出 MUC5AC 的相对值。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 17.0 软件进行分析。根据方差齐性与否，分别采用参数检验与非参数检验，即齐性资料用单因素方差分析（ANOVA），结果用均数±标准差（
±s）表示，两两比较采用 LSD 检验，非齐性资料用秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度 LPS 对细胞增殖活力的影响
细胞经过 LPS 处理后，1、5 及 10 μg/ml 的浓度组，在各自时间点比较，增殖活力无明显改变。当浓度增加至 2 μg/ml 时，从第 16 h 起吸光度值开始降低，为 0.176±0.006，与正常对照组以及其他浓度组比较，差异有统计学意义（均 P<0.05）。与其他组比较，在 24 h 和 36 h 的吸光度值明显降低（均P<0.01）。结果见表 1。
表1
MTT 检测不同浓度 LPS 刺激对细胞增殖活力的影响（n=6，
）
2.2 不同浓度 CSE 对细胞增殖活力的影响
细胞经过 CSE 处理后，将 0.25、0.5 及 1 g/L 的浓度组在各自的时间点相比，增殖活力无明显改变。但是当浓度增加到 2 g/L 时，第 16 h 起，吸光度值开始出现降低，为 0.190±0.005，与正常对照组以及其他浓度组对比，差异有统计学意义（均 P<0.05）。与其他组比较，在 24 h 和 36 h 的吸光度值有明显降低（均P<0.01）。结果见表 2。
表2
MTT 检测不同浓度 CSE 刺激对细胞增殖活力的影响（n=6，
）
2.3 Elafin 对 LPS 及 CSE 诱导的 MUC5AC 胞内蛋白生成的影响
与对照组比较，LPS 刺激组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量明显增多。在 LPS 刺激前予 Elafin 预处理组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量低于单纯的 LPS 刺激组。与对照组比较，单纯予 Elafin 处理组细胞内的 MUC5AC 表达量显著降低。结果见图 1。
图1
LPS 及 Elafin 对 MUC5AC 胞内蛋白含量的影响
a. 对照组；b. LPS 处理组；c. LPS+Elafin 处理组；d. Elafin 处理组
与对照组比较，CSE 刺激组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量显著增多。在 CSE 刺激前予 Elafin 预处理组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量低于单纯的 CSE 刺激组。与对照组比较，单纯予 Elafin 处理组细胞内的 MUC5AC 表达量显著降低。结果见图 2。
图2
CSE 及 Elafin 对 MUC5AC 胞内蛋白含量的影响
a. 对照组；b. CSE 处理组；c. CSE+Elafin 处理组；d. Elafin 处理组
2.4 Elafin 对 LPS 及 CSE 诱导的 MUC5AC 蛋白分泌量的影响
与对照组比较，LPS 刺激组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平显著增高（P<0.01）。在 LPS 刺激前予 Elafin 预处理组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明显低于单纯的 LPS 刺激组（P<0.01）。与对照组比较，单纯予 Elafin 处理组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平显著降低（P<0.05）。结果见表 3。
表3
LPS 及 Elafin 对 MUC5AC 蛋白分泌量的影响（n=6，
，μg/ml）
与对照组比较，CSE 刺激组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）。在 CSE 刺激前予 Elafin 预处理组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明显低于单纯的 CSE 处理组（P<0.01）。与对照组比较，单纯予 Elafin 处理组的 MUC5AC 蛋白的分泌水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表 4。
表4
CSE 及 Elafin 对 MUC5AC 蛋白分泌量的影响（n=6，
，μg/ml）
3 讨论
Elafin 是近年来发现的一种小分子（相对分子质量 9 900）抗弹力酶特异性保护因子[10-11]。呼吸道 Elafin 主要由肺泡上皮细胞、Clara 细胞及肺泡巨噬细胞产生[12]，具有保护细胞外基质以及上皮细胞免于受中性粒细胞弹性蛋白酶溶解破坏的重要作用，并且显示出优良的抗菌作用，以及对阳离子蛋白酶的抑制作用[13-14]。Elafin 的这种多重有益效应以及其分子量小、穿透性好的特点，使其成为治疗慢性气道炎症的一种极其具希望和潜质的候选靶物质。因此，获取人工重组 Elafin 对于慢性气道炎症性疾病的治疗极其具有研究价值。
Elafin 具有的抗蛋白酶性使其在气道黏液高分泌的治疗中具有突出的优势[15]。既往对 Elafin 的研究多立足于其抗感染、抗蛋白酶等细胞外的作用上。本研究通过培养气道上皮细胞，采用 CSE 及 LPS 作为刺激因素，使用细胞免疫荧光法及 ELISA 法，分别检测各组气道上皮细胞 MUC5AC 的胞内蛋白及胞外蛋白分泌的表达情况。结果显示，与对照组比较，LPS 及 CSE 刺激组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平明显增多，在 LPS 及 CES 刺激前予 Elafin 预处理组细胞内的 MUC5AC 蛋白含量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平低于单纯 LPS 及单纯 CES 刺激组，而单纯予 Elafin 处理组细胞内的 MUC5AC 表达量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平显著降低。因此，LPS 及 CSE 可以诱导炎症介质的产生，进而上调 MUC5AC 的胞内蛋白及分泌到胞外的蛋白的含量，从而促进慢性气道炎症的形成；而以 Elafin 进行干预可以明显降低 LPS 及 CSE 上调的上述指标水平。因此，可以得出结论，CSE 及 LPS 可增加 MUC5AC 的合成及分泌，而 Elafin 可显著抑制 CSE 及 LPS 的上述效应；Elafin 可以通过阻断气道黏蛋白的生成及分泌，从而达到抑制气道黏液高分泌的目的。
本实验选择 MUC5AC 作为炎症反应强度的指标，是因为 MUC5AC 是气道黏液中最重要的黏蛋白，而许多气道黏液高分泌疾病，如慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、支气管扩张等的病理生理改变都与其密切相关[16-17]。由于 MUC5AC 与慢性阻塞性肺疾病等慢性气道炎症疾病患者的病情进展和预后紧密相关，故本实验着重观察 Elafin 与 MUC5AC 的胞内蛋白及分泌到胞外的蛋白的关系，结果进一步提示 Elafin 可显著遏制 MUC5AC 的合成及分泌，从而降低了 MUC5AC 的病理性表达[18]。
目前国内外针对 Elafin 对气道黏液高分泌影响方面的研究不多，本研究在之前研究[19]的基础上进一步确认了 Elafin 在治疗气道黏液高分泌方面的积极效应，从而提示其在气道黏液高分泌的调控领域中可能发挥重要作用。因此，Elafin 纯化的表达产物在气道局部的治疗中将有较为广阔的临床应用前景。
