引用本文： 葛海燕, 朱惠莉, 夏世金, 宋元林, 白春学. 水通道蛋白 1 对内皮祖细胞迁移功能的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2018, 17(3): 290-295. doi: 10.7507/1671-6205.201804037 复制
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是各种直接和间接因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全[1]。由于缺乏有效的治疗措施，其病死率仍高达 40%，严重威胁着患者的生命安全。了解其发病进程，寻求合适治疗手段，提高危重 ALI 的救治率非常重要[2]。肺泡-毛细血管屏障功能及完整性在 ALI 的发生发展及病情转归方面具有重要意义。毛细血管内皮屏障是细胞间物质交换的基础，血管内皮细胞的损伤及基底膜的损伤均能引起内皮功能的完整性受损[3-4]。内皮细胞的迁移在 ALI 修复中发挥重要作用。而内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC）是血管内皮细胞的前体细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。研究显示，EPC 在心脑血管疾病、肿瘤血管形成及损伤愈合等方面均发挥重要作用[5-7]。
水通道蛋白 1（aquaporin 1，AQP1）属于膜主体蛋白家族，早期发现其主要功能是介导渗透压驱动下的跨膜水转运[8-9]，现在发现 AQP1 广泛表达于许多器官的内皮细胞上，在肺脏表达于所有毛细血管内皮细胞及淋巴管的细胞膜上[10]。缺失 AQP1 基因对内皮细胞及肿瘤细胞的迁移、增殖等生物学功能有重要影响。应用缺血再灌注损伤模型复制的肾小管上皮损伤模型中，缺失 AQP1 基因使肾小管上皮细胞修复能力下降，体外研究表明其迁移能力下降，表现为细胞膜足突的形成减少。在缺血缺氧、心脏停搏等疾病中心脏内皮细胞中的 AQP1 表达降低，且可能与缺氧相关的 miR214 调节有关[11]。在各种病理生理条件下，如损伤、器官再生等，AQP1 具有损伤修复功能[12]。关于 AQP1 对 EPC 的功能影响目前尚未有研究。对其进行研究有助于从更早阶段分析 AQP1 对损伤修复的影响，以期为降低 ALI 的死亡率寻求对策。本研究通过体外分离 AQP1 野生型（wild-type，WT）和敲除型（knockout-type，KO）小鼠骨髓间充质干细胞 （mesenchymal stem cell，MSC）并定向培养内皮祖细胞，应用免疫荧光法检测细胞表面抗原 CD133、CD31、CD34 及 Flk-1 鉴定 EPC，通过无标记活细胞动态分析（live cell kinetic imaging and quantification，Cell IQ）技术、Transwell 迁移实验及划痕实验比较 AQP1 WT 和 KO 小鼠中 EPC 的功能差异，旨在从更早阶段分析 AQP1 对损伤修复的影响，为 ALI 损伤修复提供新的治疗思路。
1 材料与方法
1.1 动物
AQP1 KO 小鼠（CD1 系）由加州大学旧金山分校医学研究所赠送，复旦大学附属中山医院呼吸科保种鉴定。选取 4～6 周龄 AQP1 WT 小鼠及 KO 小鼠，每组各 6 只。研究经复旦大学动物伦理委员会批准，按照实验动物处理指南处理小鼠。
1.2 方法
1.2.1 EPC 培养
小鼠麻醉处死后迅速置于 75% 酒精中浸泡 15 min。置于超净台上将小鼠双下肢股骨、胫骨分离取出，浸泡于含胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的磷酸缓冲盐溶液（phophate-buffered saline，PBS）中保存。应用 1 ml 注射器冲洗出小鼠的骨髓，并收集骨髓细胞置于 15 ml 离心管中。按照 6 ml 骨髓细胞加入 4 ml 淋巴细胞分离液的比例，离心 15 min 后收集中间层白膜，PBS 洗涤细胞后应用含 10% FBS 的杜氏改良 Eagle 培养基进行培养。7 d 后进行传代置于经纤连蛋白包被预处理的培养瓶中，并应用 LONZA 专用内皮细胞培养基培养 14 d 后传代备用。相差显微镜观察 EPC 形态。
1.2.2 细胞表面抗原免疫荧光检测鉴定
选择干细胞的表面标志 CD133 及 CD31，以及内皮细胞的表面标志 CD34 及 Flk-1 对 EPC 进行检测鉴定。选择传代后第 7 d 和第 14 d 的 EPC 进行细胞表面抗原免疫荧光法鉴定。应用经人纤维连接蛋白包被的无菌载玻片作为载体，将细胞接种于含无菌载玻片的 6 孔板内，用含 10% FBS 的杜氏改良 Eagle 培养基进行培养。分别培养 3 d 后取出载玻片，并以用 4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 漂洗 3 次，封闭血清封闭 30 min 后，分别加入大鼠抗小鼠 CD133（1∶100）、兔抗小鼠 CD31（1∶100），以及大鼠抗小鼠 CD34（1∶100）、大鼠抗小鼠 Flk-1（1∶100）抗体于 4 ℃ 孵育过夜。第 2 d，用 PBS 漂洗 3 次后，加入羊抗大鼠 IgG-FITC 抗体（1∶400）及羊抗兔 IgG-PE 抗体（1∶200）于常温下孵育 1 h。PBS 漂洗 2 遍后封片。于荧光显微镜下观察拍照。
1.2.3 Transwell 实验检测 EPC 迁移能力
用 50 mg/L Matrigel 胶 1∶8 稀释液包被 Transwell 小室底部膜上室面，4 ℃ 风干。将 200 μl 枪头的尖端剪掉，吸取纤连蛋白均匀涂抹于小室的下室面。EPC 无血清培养 12 h 后，消化离心，用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 1×105/ml，取细胞悬液 200 μl 加入 Transwell 小室，下室加入 500 μl 含 FBS 的培养基，常规培养 36 h 后，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞。结晶紫染色后，400 倍高倍视野下选择 6 个视野进行拍照计数，取平均值。
1.2.4 Cell IQ 实验
应用法国 Manual Tracking 活细胞工作系统进行细胞实时监测，并利用机器自带的图像分析软件进行分析。接种 EPC 细胞并应用 Cell IQ 系统进行实时监测。Cell IQ 系统按照设定间隔时间每 15 min 自动拍照并计算细胞总数。每组包含 6 个重复图像。
1.2.5 细胞划痕实验
传代后的细胞培养 24 h 后，去除培养基，用尖端相同的 10 μl 枪头划直线，培养基清洗 3 次以去除刮起的漂浮细胞，加入低血清培养基（1%），放置于 Cell IQ 活细胞工作站中，每组选择 3 个视野进行连续观测，每隔 15 min 采集图像 1 次，连续观测 48 h，测量计算迁移距离并分析。每组实验重复 6 次。
1.3 统计学方法
应用 SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（
±s）表示，组间比较采用独立样本 t 检验，多组差别比较应用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠 EPC 的培养及鉴定
从小鼠大腿骨和胫骨骨髓分离出单个核细胞，应用 MSC 培养基培养 7 d。如图所示，最初细胞保持悬浮状态，但在 7 d 内逐渐黏附贴壁。MSC 细胞传代后，放置于经纤连蛋白包被预处理的培养瓶中，并更换培养基为内皮细胞专用培养基进行培养，7 d 后细胞逐渐分化贴壁，14 d 后细胞继续增殖、形态为梭形或多边形，并融合成铺路石样的 EPC 细胞（图 1）。
图1
骨髓中分离出的单个核细胞在细胞培养不同时间点的相差显微镜像（×200）
a. MSC 培养第 1 d；b. MSC 培养第 7 d；c. EPC 培养第 7 d；d. EPC 培养第 14 d
选择干细胞的表面标志 CD133 及 CD31，以及内皮细胞的表面标志 CD34 及 Flk-1 分不同时间点对 EPC 进行检测鉴定，结果发现在应用内皮细胞专用培养基培养 7 d 后细胞 CD133 及 CD31 表达阳性，随着培养时间的延长在 14 d 时 CD34 及 Flk-1 出现表达阳性（图 2）。上述结果提示，经 MSC 内皮分化培养后的 EPC，最初表现出干细胞特征，随着培养的延长，逐渐表现出内皮细胞特征。
图2
对不同时间点 EPC 进行内皮细胞表面标志物的免疫荧光鉴定
a. 免疫荧光检测像（×400），其中绿色表示不同内皮细胞表面标志物阳性结果，蓝色表示 DAPI 核染色；b. 免疫荧光检测结果分析
2.2 在不同组别 EPC 中 AQP1 的表达验证
对 AQP1 WT 和 KO 小鼠经第一次传代的 EPC 细胞进行 AQP1 免疫荧光检测结果发现，仅在 AQP1 WT 小鼠中 AQP1 表达阳性（图 3）。
图3
AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 细胞中 AQP1 表达的免疫 荧光检测像（×400）
a. KO 小鼠；b. WT 小鼠
2.3 不同组别 EPC 增殖和迁移能力比较
Cell IQ 结果显示，培养 72 h 的 AQP1 WT 小鼠与 KO 小鼠 EPC 细胞增殖数目无显著差异（图 4）。进一步的 Transwell 检测结果显示，AQP1 KO 小鼠 EPC 迁移能力较 WT 小鼠明显减弱（图 5）。细胞划痕实验检测结果显示，AQP1 KO 小鼠 EPC 的划痕愈合能力明显低于 WT 小鼠（图 6）。
图4
Cell IQ 检测 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 细胞增殖能力
图5
Transwell 检测 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 细胞侵袭能力
a. Transwell 检测像（×400）；b. Transwell 检测结果分析
图6
Cell IQ 检测 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 细胞划痕愈合 能力
3 讨论
ALI 临床上表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫，由于缺乏有效的治疗措施导致其病死率高[13]。ALI 是各种直接和间接因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全，其共同的基础是肺泡毛细血管膜急性损伤[14]。
我们前期研究发现 AQP1 在小鼠肺缺血再灌注损伤中表达增加，并且与内皮细胞标志物 CD31 共定位，AQP1 KO 小鼠肺组织有较明显的白细胞浸润、胶原沉积、微血管通透性增加及血管生成因子表达减少，这提示 AQP1 缺失抑制血管生成延缓了再灌注肺组织的修复过程[15]。而 EPC 是血管内皮细胞的前体细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。AQP1 对 EPC 的增殖迁移功能是否有影响，目前未有研究。对此进行研究有助于从更早阶段分析 AQP1 对损伤修复的影响，为降低 ALI 尤其是老年危重 ALI 的死亡率寻求新的治疗方法。
AQP 是一类位于细胞膜上的可介导水转运的蛋白家族。AQP1 是最早发现的 AQP 家族成员，早期发现其主要功能是介导渗透压驱动下的跨膜水转运，分别参与了乳汁生成、软骨容积管理、滑液分泌、尿液浓缩、脑脊液平衡、房水平衡、胆汁分泌等多个生理及病理过程。而在呼吸系统，AQP1 参与包括气道内气体的水化、胎儿肺水的吸收、心力衰竭、肺损伤肺水肿的形成、各种病理条件下胸膜液体的分泌和聚集等过程。最近的研究发现，AQP1 多在全身各系统的微血管内皮细胞中表达，在损伤修复、血管生成的过程中发挥了非常重要的调节作用。Saadoun 等[16]在 2005 年发表于 Nature 的一项研究应用 AQP1 KO 小鼠和细胞培养体系，首次证明细胞膜 AQP 在血管生成和细胞迁移中发挥重要作用。内皮细胞损伤后无论从其结构还是功能等各方面都会引起一系列的改变。Mun 等[17]研究认为内皮细胞中的板式剪切力变化可以诱导 AQP1 的表达增加，该研究通过检测内皮细胞的板式剪切力发现其可以增加 AQP1 的表达量，而应用 siRNA AQP1 处理后可以减轻内皮细胞的损伤反应。另外，AQP1 还与肝硬化患者肝血窦肝动脉毛细血管增殖相关，在对照组 AQP1 主要定位于肝门静脉、肝小动脉、胆管区等处，肝血窦处毛细血管含量较少，而在肝硬化患者肝血窦处的内皮细胞上 AQP1 表达显著增加，增加肝硬化的微血管抵抗[18]。而另外一项对肝硬化的研究同样表明，在肝硬化纤维区小的血管源性的以及新生血管系统中 AQP1 表达增高，促进成纤维生长因子诱导肝脏内皮细胞动态膜起泡，从而促进其在基质中侵袭[19]。我们前期的研究也发现 AQP1 在小鼠肺缺血再灌注损伤中表达增加，并且与内皮细胞标志物 CD31 共定位，AQP1 KO 小鼠肺组织有较明显的白细胞浸润、胶原沉积、微血管通透性增加及血管生成因子表达减少，这提示 AQP1 缺失抑制血管生成，延缓了再灌注肺组织的修复过程。
EPC 是可以分化为成熟内皮细胞的前体细胞，参与血管生成、损伤修复等各种修复过程[6]。目前有关 EPC 的培养方法选择众多，可以从骨髓、脐血、外周血等来源提取并分离 EPC，而在骨髓中其含量最高。我们的研究选取了 4～6 周龄小鼠的股骨、胫骨分离获取单核细胞，并应用特定的内皮细胞专用培养基进行诱导分化，该培养方法具有高效、简便的特点。在我们的研究中，骨髓分离中出单个核细胞后，首先应用 MSC 培养基培养 7 d，最初细胞保持悬浮状态，但在 7 d 内逐渐黏附贴壁。MSC 细胞传代后，放置于经纤连蛋白包被预处理的培养瓶中，并更换培养基为内皮细胞专用培养基进行培养，7 d 后细胞逐渐分化贴壁，14 d 后细胞继续增殖，形态为梭形或多边形，并融合成典型的铺路石样的 EPC 细胞。关于 EPC 的鉴定目前也缺乏公认的金标准。综合文献检索及预实验结果[20-21]，我们选择了细胞形态学鉴定和细胞表面抗原鉴定的方法。鉴定结果显示，内皮分化培养后的 EPC，最初表现出 CD133 及 CD31 阳性的干细胞特征，随着培养时间的延长，逐渐表现出 CD34 及 Flk-1 阳性的内皮细胞样特征。
对 EPC 培养鉴定成功后，我们进一步研究了 AQP1 不同状态下 EPC 的功能差异研究，应用 Cell IQ 技术对 EPC 进行增殖能力检测，结果发现培养 72 h 的 AQP1 WT 小鼠与 KO 小鼠 EPC 细胞增殖数目无显著差异。而进一步应用 Transwell 检测发现，AQP1 KO 小鼠 EPC 迁移能力较 WT 小鼠明显减弱，且 AQP1 KO 小鼠 EPC 的划痕愈合能力明显低于 WT 小鼠。结果提示 AQP1 影响可 EPC 的侵袭迁移能力而非增殖能力。该结果也与先前内皮细胞在损伤修复中 AQP1 主要影响内皮细胞迁移能力相一致。
综上，本研究通过培养并鉴定 EPC，应用 Cell IQ、Transwell 迁移实验及划痕实验比较 AQP1 WT 和 KO 小鼠中 EPC 的功能差异。研究发现 AQP1 可影响 EPC 的侵袭迁移能力而非增殖能力。本研究从更早阶段分析 AQP1 对损伤修复的影响，对于 ALI 的防治具有重要意义。后续可模拟体外 ALI 缺氧复氧模型并进一步观察 AQP1 对 EPC 的功能影响机制。
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是各种直接和间接因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全[1]。由于缺乏有效的治疗措施，其病死率仍高达 40%，严重威胁着患者的生命安全。了解其发病进程，寻求合适治疗手段，提高危重 ALI 的救治率非常重要[2]。肺泡-毛细血管屏障功能及完整性在 ALI 的发生发展及病情转归方面具有重要意义。毛细血管内皮屏障是细胞间物质交换的基础，血管内皮细胞的损伤及基底膜的损伤均能引起内皮功能的完整性受损[3-4]。内皮细胞的迁移在 ALI 修复中发挥重要作用。而内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC）是血管内皮细胞的前体细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。研究显示，EPC 在心脑血管疾病、肿瘤血管形成及损伤愈合等方面均发挥重要作用[5-7]。
水通道蛋白 1（aquaporin 1，AQP1）属于膜主体蛋白家族，早期发现其主要功能是介导渗透压驱动下的跨膜水转运[8-9]，现在发现 AQP1 广泛表达于许多器官的内皮细胞上，在肺脏表达于所有毛细血管内皮细胞及淋巴管的细胞膜上[10]。缺失 AQP1 基因对内皮细胞及肿瘤细胞的迁移、增殖等生物学功能有重要影响。应用缺血再灌注损伤模型复制的肾小管上皮损伤模型中，缺失 AQP1 基因使肾小管上皮细胞修复能力下降，体外研究表明其迁移能力下降，表现为细胞膜足突的形成减少。在缺血缺氧、心脏停搏等疾病中心脏内皮细胞中的 AQP1 表达降低，且可能与缺氧相关的 miR214 调节有关[11]。在各种病理生理条件下，如损伤、器官再生等，AQP1 具有损伤修复功能[12]。关于 AQP1 对 EPC 的功能影响目前尚未有研究。对其进行研究有助于从更早阶段分析 AQP1 对损伤修复的影响，以期为降低 ALI 的死亡率寻求对策。本研究通过体外分离 AQP1 野生型（wild-type，WT）和敲除型（knockout-type，KO）小鼠骨髓间充质干细胞 （mesenchymal stem cell，MSC）并定向培养内皮祖细胞，应用免疫荧光法检测细胞表面抗原 CD133、CD31、CD34 及 Flk-1 鉴定 EPC，通过无标记活细胞动态分析（live cell kinetic imaging and quantification，Cell IQ）技术、Transwell 迁移实验及划痕实验比较 AQP1 WT 和 KO 小鼠中 EPC 的功能差异，旨在从更早阶段分析 AQP1 对损伤修复的影响，为 ALI 损伤修复提供新的治疗思路。
1 材料与方法
1.1 动物
AQP1 KO 小鼠（CD1 系）由加州大学旧金山分校医学研究所赠送，复旦大学附属中山医院呼吸科保种鉴定。选取 4～6 周龄 AQP1 WT 小鼠及 KO 小鼠，每组各 6 只。研究经复旦大学动物伦理委员会批准，按照实验动物处理指南处理小鼠。
1.2 方法
1.2.1 EPC 培养
小鼠麻醉处死后迅速置于 75% 酒精中浸泡 15 min。置于超净台上将小鼠双下肢股骨、胫骨分离取出，浸泡于含胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的磷酸缓冲盐溶液（phophate-buffered saline，PBS）中保存。应用 1 ml 注射器冲洗出小鼠的骨髓，并收集骨髓细胞置于 15 ml 离心管中。按照 6 ml 骨髓细胞加入 4 ml 淋巴细胞分离液的比例，离心 15 min 后收集中间层白膜，PBS 洗涤细胞后应用含 10% FBS 的杜氏改良 Eagle 培养基进行培养。7 d 后进行传代置于经纤连蛋白包被预处理的培养瓶中，并应用 LONZA 专用内皮细胞培养基培养 14 d 后传代备用。相差显微镜观察 EPC 形态。
1.2.2 细胞表面抗原免疫荧光检测鉴定
选择干细胞的表面标志 CD133 及 CD31，以及内皮细胞的表面标志 CD34 及 Flk-1 对 EPC 进行检测鉴定。选择传代后第 7 d 和第 14 d 的 EPC 进行细胞表面抗原免疫荧光法鉴定。应用经人纤维连接蛋白包被的无菌载玻片作为载体，将细胞接种于含无菌载玻片的 6 孔板内，用含 10% FBS 的杜氏改良 Eagle 培养基进行培养。分别培养 3 d 后取出载玻片，并以用 4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 漂洗 3 次，封闭血清封闭 30 min 后，分别加入大鼠抗小鼠 CD133（1∶100）、兔抗小鼠 CD31（1∶100），以及大鼠抗小鼠 CD34（1∶100）、大鼠抗小鼠 Flk-1（1∶100）抗体于 4 ℃ 孵育过夜。第 2 d，用 PBS 漂洗 3 次后，加入羊抗大鼠 IgG-FITC 抗体（1∶400）及羊抗兔 IgG-PE 抗体（1∶200）于常温下孵育 1 h。PBS 漂洗 2 遍后封片。于荧光显微镜下观察拍照。
1.2.3 Transwell 实验检测 EPC 迁移能力
用 50 mg/L Matrigel 胶 1∶8 稀释液包被 Transwell 小室底部膜上室面，4 ℃ 风干。将 200 μl 枪头的尖端剪掉，吸取纤连蛋白均匀涂抹于小室的下室面。EPC 无血清培养 12 h 后，消化离心，用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 1×105/ml，取细胞悬液 200 μl 加入 Transwell 小室，下室加入 500 μl 含 FBS 的培养基，常规培养 36 h 后，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞。结晶紫染色后，400 倍高倍视野下选择 6 个视野进行拍照计数，取平均值。
1.2.4 Cell IQ 实验
应用法国 Manual Tracking 活细胞工作系统进行细胞实时监测，并利用机器自带的图像分析软件进行分析。接种 EPC 细胞并应用 Cell IQ 系统进行实时监测。Cell IQ 系统按照设定间隔时间每 15 min 自动拍照并计算细胞总数。每组包含 6 个重复图像。
1.2.5 细胞划痕实验
传代后的细胞培养 24 h 后，去除培养基，用尖端相同的 10 μl 枪头划直线，培养基清洗 3 次以去除刮起的漂浮细胞，加入低血清培养基（1%），放置于 Cell IQ 活细胞工作站中，每组选择 3 个视野进行连续观测，每隔 15 min 采集图像 1 次，连续观测 48 h，测量计算迁移距离并分析。每组实验重复 6 次。
1.3 统计学方法
应用 SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（
±s）表示，组间比较采用独立样本 t 检验，多组差别比较应用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠 EPC 的培养及鉴定
从小鼠大腿骨和胫骨骨髓分离出单个核细胞，应用 MSC 培养基培养 7 d。如图所示，最初细胞保持悬浮状态，但在 7 d 内逐渐黏附贴壁。MSC 细胞传代后，放置于经纤连蛋白包被预处理的培养瓶中，并更换培养基为内皮细胞专用培养基进行培养，7 d 后细胞逐渐分化贴壁，14 d 后细胞继续增殖、形态为梭形或多边形，并融合成铺路石样的 EPC 细胞（图 1）。
图1
骨髓中分离出的单个核细胞在细胞培养不同时间点的相差显微镜像（×200）
a. MSC 培养第 1 d；b. MSC 培养第 7 d；c. EPC 培养第 7 d；d. EPC 培养第 14 d
选择干细胞的表面标志 CD133 及 CD31，以及内皮细胞的表面标志 CD34 及 Flk-1 分不同时间点对 EPC 进行检测鉴定，结果发现在应用内皮细胞专用培养基培养 7 d 后细胞 CD133 及 CD31 表达阳性，随着培养时间的延长在 14 d 时 CD34 及 Flk-1 出现表达阳性（图 2）。上述结果提示，经 MSC 内皮分化培养后的 EPC，最初表现出干细胞特征，随着培养的延长，逐渐表现出内皮细胞特征。
图2
对不同时间点 EPC 进行内皮细胞表面标志物的免疫荧光鉴定
a. 免疫荧光检测像（×400），其中绿色表示不同内皮细胞表面标志物阳性结果，蓝色表示 DAPI 核染色；b. 免疫荧光检测结果分析
2.2 在不同组别 EPC 中 AQP1 的表达验证
对 AQP1 WT 和 KO 小鼠经第一次传代的 EPC 细胞进行 AQP1 免疫荧光检测结果发现，仅在 AQP1 WT 小鼠中 AQP1 表达阳性（图 3）。
图3
AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 细胞中 AQP1 表达的免疫 荧光检测像（×400）
a. KO 小鼠；b. WT 小鼠
2.3 不同组别 EPC 增殖和迁移能力比较
Cell IQ 结果显示，培养 72 h 的 AQP1 WT 小鼠与 KO 小鼠 EPC 细胞增殖数目无显著差异（图 4）。进一步的 Transwell 检测结果显示，AQP1 KO 小鼠 EPC 迁移能力较 WT 小鼠明显减弱（图 5）。细胞划痕实验检测结果显示，AQP1 KO 小鼠 EPC 的划痕愈合能力明显低于 WT 小鼠（图 6）。
图4
Cell IQ 检测 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 细胞增殖能力
图5
Transwell 检测 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 细胞侵袭能力
a. Transwell 检测像（×400）；b. Transwell 检测结果分析
图6
Cell IQ 检测 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 细胞划痕愈合 能力
3 讨论
ALI 临床上表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫，由于缺乏有效的治疗措施导致其病死率高[13]。ALI 是各种直接和间接因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全，其共同的基础是肺泡毛细血管膜急性损伤[14]。
我们前期研究发现 AQP1 在小鼠肺缺血再灌注损伤中表达增加，并且与内皮细胞标志物 CD31 共定位，AQP1 KO 小鼠肺组织有较明显的白细胞浸润、胶原沉积、微血管通透性增加及血管生成因子表达减少，这提示 AQP1 缺失抑制血管生成延缓了再灌注肺组织的修复过程[15]。而 EPC 是血管内皮细胞的前体细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。AQP1 对 EPC 的增殖迁移功能是否有影响，目前未有研究。对此进行研究有助于从更早阶段分析 AQP1 对损伤修复的影响，为降低 ALI 尤其是老年危重 ALI 的死亡率寻求新的治疗方法。
AQP 是一类位于细胞膜上的可介导水转运的蛋白家族。AQP1 是最早发现的 AQP 家族成员，早期发现其主要功能是介导渗透压驱动下的跨膜水转运，分别参与了乳汁生成、软骨容积管理、滑液分泌、尿液浓缩、脑脊液平衡、房水平衡、胆汁分泌等多个生理及病理过程。而在呼吸系统，AQP1 参与包括气道内气体的水化、胎儿肺水的吸收、心力衰竭、肺损伤肺水肿的形成、各种病理条件下胸膜液体的分泌和聚集等过程。最近的研究发现，AQP1 多在全身各系统的微血管内皮细胞中表达，在损伤修复、血管生成的过程中发挥了非常重要的调节作用。Saadoun 等[16]在 2005 年发表于 Nature 的一项研究应用 AQP1 KO 小鼠和细胞培养体系，首次证明细胞膜 AQP 在血管生成和细胞迁移中发挥重要作用。内皮细胞损伤后无论从其结构还是功能等各方面都会引起一系列的改变。Mun 等[17]研究认为内皮细胞中的板式剪切力变化可以诱导 AQP1 的表达增加，该研究通过检测内皮细胞的板式剪切力发现其可以增加 AQP1 的表达量，而应用 siRNA AQP1 处理后可以减轻内皮细胞的损伤反应。另外，AQP1 还与肝硬化患者肝血窦肝动脉毛细血管增殖相关，在对照组 AQP1 主要定位于肝门静脉、肝小动脉、胆管区等处，肝血窦处毛细血管含量较少，而在肝硬化患者肝血窦处的内皮细胞上 AQP1 表达显著增加，增加肝硬化的微血管抵抗[18]。而另外一项对肝硬化的研究同样表明，在肝硬化纤维区小的血管源性的以及新生血管系统中 AQP1 表达增高，促进成纤维生长因子诱导肝脏内皮细胞动态膜起泡，从而促进其在基质中侵袭[19]。我们前期的研究也发现 AQP1 在小鼠肺缺血再灌注损伤中表达增加，并且与内皮细胞标志物 CD31 共定位，AQP1 KO 小鼠肺组织有较明显的白细胞浸润、胶原沉积、微血管通透性增加及血管生成因子表达减少，这提示 AQP1 缺失抑制血管生成，延缓了再灌注肺组织的修复过程。
EPC 是可以分化为成熟内皮细胞的前体细胞，参与血管生成、损伤修复等各种修复过程[6]。目前有关 EPC 的培养方法选择众多，可以从骨髓、脐血、外周血等来源提取并分离 EPC，而在骨髓中其含量最高。我们的研究选取了 4～6 周龄小鼠的股骨、胫骨分离获取单核细胞，并应用特定的内皮细胞专用培养基进行诱导分化，该培养方法具有高效、简便的特点。在我们的研究中，骨髓分离中出单个核细胞后，首先应用 MSC 培养基培养 7 d，最初细胞保持悬浮状态，但在 7 d 内逐渐黏附贴壁。MSC 细胞传代后，放置于经纤连蛋白包被预处理的培养瓶中，并更换培养基为内皮细胞专用培养基进行培养，7 d 后细胞逐渐分化贴壁，14 d 后细胞继续增殖，形态为梭形或多边形，并融合成典型的铺路石样的 EPC 细胞。关于 EPC 的鉴定目前也缺乏公认的金标准。综合文献检索及预实验结果[20-21]，我们选择了细胞形态学鉴定和细胞表面抗原鉴定的方法。鉴定结果显示，内皮分化培养后的 EPC，最初表现出 CD133 及 CD31 阳性的干细胞特征，随着培养时间的延长，逐渐表现出 CD34 及 Flk-1 阳性的内皮细胞样特征。
对 EPC 培养鉴定成功后，我们进一步研究了 AQP1 不同状态下 EPC 的功能差异研究，应用 Cell IQ 技术对 EPC 进行增殖能力检测，结果发现培养 72 h 的 AQP1 WT 小鼠与 KO 小鼠 EPC 细胞增殖数目无显著差异。而进一步应用 Transwell 检测发现，AQP1 KO 小鼠 EPC 迁移能力较 WT 小鼠明显减弱，且 AQP1 KO 小鼠 EPC 的划痕愈合能力明显低于 WT 小鼠。结果提示 AQP1 影响可 EPC 的侵袭迁移能力而非增殖能力。该结果也与先前内皮细胞在损伤修复中 AQP1 主要影响内皮细胞迁移能力相一致。
综上，本研究通过培养并鉴定 EPC，应用 Cell IQ、Transwell 迁移实验及划痕实验比较 AQP1 WT 和 KO 小鼠中 EPC 的功能差异。研究发现 AQP1 可影响 EPC 的侵袭迁移能力而非增殖能力。本研究从更早阶段分析 AQP1 对损伤修复的影响，对于 ALI 的防治具有重要意义。后续可模拟体外 ALI 缺氧复氧模型并进一步观察 AQP1 对 EPC 的功能影响机制。
