引用本文： 施梦, 黄杰春, 孙笑天, 汪昉睿, 储祥麟, 姜容容, 王宜青, 庞烈文. 凝血因子Xα 抑制剂对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2019, 18(4): 369-376. doi: 10.7507/1671-6205.201810048 复制
急性肺损伤是一种常见的呼吸衰竭疾病，特点是肺毛细血管渗出增加、中性粒细胞浸润和肺气血屏障破坏[1]，其病理变化还包括出血及微血栓形成[2]。在感染性疾病引起的急性肺损伤，细菌性脓毒血症是死亡的主要因素；细菌产生的毒素，如脂多糖和内毒素会导致炎症反应、细胞骨架重构和内皮屏障破坏[3]。急性肺损伤的病理改变包括炎症反应和肺组织内促凝血及抗纤溶功能增强[4]，特别是肺组织内凝血功能激活相对于抗凝和纤溶来说在急性肺损伤的病理生理改变中更加重要[2]。肺组织中的凝血功能增强，会影响组织中炎症反应及损伤修复[5]。研究表明肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）和 IL-6，可以激活外源性凝血途径；同时凝血因子 Xα（coagulation factor Xα，FXα）、α-凝血酶和纤维蛋白的增加也促使 IL-6 和 IL-8 的合成[6]。因此，凝血和炎症反应的相互促进，会导致急性肺损伤程度加重[7]。
研究表明，除了促凝血功能外，FXα 在其他生理过程中也起重要作用，涉及炎症调节、血管重构和组织纤维化[8-9]。急性肺损伤小鼠的肺泡灌洗液中凝血酶和 FXα 升高[10]。FXα 可以增加炎症因子的 mRNA 表达[11-12]。凝血因子的非凝血功能主要通过蛋白酶激活受体（protease-activated receptors，PARs）调节，增加组织炎症反应及抑制组织修复[12-14]。PARs 是一种 G 蛋白结合受体家族，调节凝血系统蛋白酶的功能，例如凝血酶、胰蛋白酶和金属蛋白酶[15]。生理条件下，PAR-2 主要表达在血管内皮细胞上，PAR-2 激活可以促进内皮细胞转变成促炎细胞，使血管通透性增加，促炎症因子分泌及表达增加[16-18]。
利伐沙班是一种口服抗凝药，可以抑制 FXα 和减少体内炎症介质分泌[12]。但是，利伐沙班是否对内毒素诱导的急性肺损伤有影响及相关作用机制研究没有相关报道。本研究旨在小鼠体内证明利伐沙班通过抑制 PAR-2-NF-κB 信号通路改善内毒素引起的急性肺损伤。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂
FXα 购自 Hematologic Technologies 公司，内毒素和伊文思蓝购自 Sigma 公司，利伐沙班购自拜耳药业，上海斯莱克动物饲料公司制备含有利伐沙班 0.4 mg/g 和 0.2 mg/g 啮齿类动物饲料。小鼠的凝血功能用法国 Stago 公司的半自动血凝仪检测。各种单克隆抗体，如 P65、p-P65、β-肌动蛋白（β-actin）购自 Cell Signaling Technology 公司。PAR-2 抗体购自 Abcam 公司；髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）抗体购自 R&D 公司；鼠 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自 R&D 公司。蛋白浓度测量用 BCA 试剂盒。所有试剂及药品均为药物级别。
1.2 动物实验及标本取材
雄性 C57BL/6 小鼠（6～7 周，平均体重 20 g）购自斯莱克实验动物中心［动物生产许可证号：scxk（沪 2017-0005）］。将 C57BL/6 小鼠随机分为对照组（ PBS 组）、标准饲料组（N-LPS 组）、 0.2 mg/g 利伐沙班组（L-LPS 组）和 0.4 mg/g 利伐沙班组（H-LPS 组）。PBS 组给予标准饲料喂养；N-LPS 组、L-LPS 组和 H-LPS 组造模前分别给予标准饲料、含有 0.2 mg/g 或 0.4 mg/g 利伐沙班的饲料共 10 d[14]。饲料喂养前后分别称量各组小鼠体重，评估不同饲料对小鼠营养状态的影响。喂养 10 d 后，N-LPS 组、L-LPS 组和 H-LPS 组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，经气管按体重滴注内毒素（浓度为 2 mg/mL，2.5 μL/g）进行造模，PBS 组给予相同容积的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）。造模 48 h 后，处死小鼠取血浆、支气管肺泡灌洗液及肺组织进行相关实验结果分析。小鼠急性肺损伤建模流程见图 1。每组 6 只小鼠。
图1
内毒素气管内滴注建立小鼠急性肺损伤模型流程图
内毒素气管内滴注建立小鼠急性肺损伤模型，造模前给予标准饲料或给予含有不同剂量利伐沙班药物的饲料
从心脏取出全血后，根据全血体积与 3.4% 的枸橼酸钠相混合，用两次离心法制备乏血小板血浆，然后分装血浆保存在–80 ℃冰箱中。行左肺肺泡灌洗，回收支气管肺泡灌洗液分别测炎症细胞数量、蛋白浓度、伊文思蓝浓度和细胞因子含量。一部分右肺组织用福尔马林固定和石蜡包埋。部分肺组织行蛋白印迹法（Western blot）检测分析。所有实验经过复旦大学动物实验及关怀委员会同意。
1.3 检测指标
1.3.1 凝血功能评价
测定鼠尾出血时间。乏血小板血浆用半自动血凝仪测定活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）和凝血酶时间（thrombin time，TT）。
1.3.2 利伐沙班血药浓度的测定
用液相色谱–质谱（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）法测定[19]。用利奈唑胺作为内参照，血清中二甲基亚砜为 0.05%，不影响小鼠凝血功能[20]。
1.3.3 肺湿干重比
取右肺下叶放在事先称重的铝箔纸上，称重减去铝箔纸重量，表示湿重；将其放入 60 ℃ 温箱中烘烤 5 d，再次称重获得此肺组织干重（即两次测量干重质量固定后被确定为肺组织干重）。所得湿重和干重比值为湿干重比[21]。
1.3.4 肺气血屏障的通透性评价
肺组织通透性用肺泡灌洗液中的蛋白浓度、伊文思蓝浓度和肺组织内伊文思蓝含量表示[22]。用 BCA 方法测定肺泡灌洗液中的蛋白浓度。血清白蛋白结合的伊文思蓝复合物可以通过肺泡气血屏障到达损伤的肺组织部位[23]。肺泡灌洗液和肺组织萃取液经 620 nm 波长光测定溶液中的伊文思蓝浓度，计算肺泡灌洗液（μg/mL）及单位质量干肺组织中的伊文思蓝含量（μg/g）。
1.3.5 肺泡灌洗液中的炎症细胞计数
肺泡灌洗液中的细胞沉淀，用小动物血细胞分析仪测定炎症细胞数量。取 10 μL 细胞重悬液滴在载玻片上，用吉姆萨–瑞特染液进行悬浮细胞染色，显微镜下观察及计数有核细胞，确定分类及数量。
1.3.6 肺组织的形态学评价
开胸取右肺部分肺叶，用 10% 的福尔马林固定，石蜡包埋，苏木精–伊红染色，光镜下评价肺损伤程度，计算肺组织病理损伤评分（total histology score，THS）。
1.3.7 放射学分析
小动物 CT 目前已成为一种有效的实验室检查方法。为了评价 LPS 对肺损伤的影响，急性肺损伤小鼠制备 48 h 后用西门子的小动物 CT 扫描小鼠整个胸腔，用 Feldkamp 算法重构图像，用 DICOM 软件读片及获得有效图像。
1.3.8 免疫组织化学分析
石蜡切片进行脱蜡，用梯度乙醇脱水；室温用 10% 小羊血清封闭 30 min，然后相应一抗 4 ℃ 孵育过夜；37 ℃ 二抗孵育 20 min；显微镜观察并记录。
1.3.9 ELISA 检测肺泡灌洗液中炎症因子
采用小鼠的左肺肺泡灌洗液，回收率为 80%，用鼠相应 ELISA 试剂盒，测量炎症细胞因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的浓度。
1.3.10 Western blot 检测
采用深低温冻存的肺组织，匀浆，取上清液；检测肺组织中的 MPO、PAR-2、P65、p-P65 和β-actin 含量。用 1% PMSF 的组织裂解液裂解组织，用 SDS-PAGE 胶分离目标蛋白，一抗 4 ℃ 孵育过夜，二抗室温孵育 2 h，显影和拍照。用 ImageJ 软件检测目标蛋白和内参照蛋白的灰度比值。
1.4 统计学方法
采用 GraphPad Prism 软件进行数据分析。呈正态分布的计量数据用均数±标准差（
±s）表示，用 Student’s 非配对 t 检验和 ANOVA 多参数检验方法进行统计学分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠的基本情况
本实验首先观察用不同含量利伐沙班饲料喂养后的小鼠，三组间体重无明显差异（图 2a）。用 LC-MS 方法检测利伐沙班的血药浓度，给予0.2 mg/g 和 0.4 mg/g 利伐沙班饲料的小鼠利伐沙班血药浓度相应上升（图 2b）。不同饲料喂养的各组小鼠，鼠尾出血时间差异无统计学意义（P=0.03）（图 2c）。检测各组小鼠乏血小板血浆中凝血功能的 PT、APTT 和 TT 值（图 2d~f），各组 TT、APTT 值没有显著差异（P>0.05）；但是，用含 0.4 mg/g 利伐沙班饲料喂养的小鼠与常规饲料小鼠相比，其凝血功能 PT 值延长；低剂量的利伐沙班饲料对小鼠的 PT 值没有明显影响。
图2
不同饲料喂养的小鼠基本情况
a. 小鼠的体重；b. 利伐沙班的血药浓度；c. 鼠尾出血时间；d. PT；e. APTT；f. TT。与 N-LPS 组比较，*
2.2 利伐沙班减轻内毒素引起的急性肺损伤
内毒素刺激 48 h 后，各组小鼠急性肺损伤病理改变明显，炎症细胞浸润，肺间质增厚，组织水肿明显（图 3a）。用 THS 方法半定量评价肺损伤严重程度，发现高剂量利伐沙班饲料喂养的小鼠，与正常饲料喂养的小鼠相比，内毒素气管内滴注后急性肺损伤程度明显减轻；但是，内毒素在低剂量利伐沙班饲料喂养小鼠并没有表现出相应作用（图 3b）。用小动物 CT 扫描检查各组小鼠急性肺组织损伤程度，与对照组小鼠比较，急性肺损伤组表现出双侧肺野广泛渗出，高剂量利伐沙班饲料喂养可以减轻急性肺损伤渗出（图 3c）。
图3
利伐沙班可以减轻急性肺损伤程度
a. 小鼠肺组织病理像（苏木精–伊红染色×100）；b. 小鼠肺组织的 THS 评分；c. 小动物 CT 影像学检测各组小鼠急性肺损伤程度。与 PBS 组比较，*
2.3 利伐沙班减轻肺损伤气血屏障的通透性
对照组小鼠肺湿干重比为 4.30±0.11，内毒素刺激后，急性肺损伤小鼠肺的湿干重比为 5.29±0.25。用标准饲料和含有利伐沙班饲料喂养的各组急性肺损伤小鼠肺湿干重比差异无统计学意义（图 4a）。与对照组相比，内毒素诱导急性肺损伤后肺泡灌洗液的蛋白浓度明显升高（P<0.05）。用含 0.2 mg/g 和 0.4 mg/g 利伐沙班饲料喂养的小鼠，急性肺损伤后肺泡灌洗液蛋白浓度降低（P<0.05，图 4b）。急性肺损伤造模 48 h 后，与对照组相比，内毒素刺激后肺泡灌洗液和肺组织中伊文思蓝含量明显增高（P<0.05）；与 N-LPS 组小鼠相比，L-LPS 及 H-LPS 组小鼠肺泡灌洗液及肺组织中伊文思蓝浓度明显降低（P<0.05）（图 4c、d）。以上结果提示，利伐沙班可以通过改善肺气血屏障通透性减轻急性肺损伤的严重程度。
图4
利伐沙班对急性肺损伤气血屏障通透性的影响
a. 肺湿干重比；b. 肺泡灌洗液中的蛋白浓度；c. 肺泡灌洗液中伊文思蓝浓度；d. 小鼠肺组织中伊文思蓝浓度。与 PBS 组比较，*
2.4 利伐沙班抑制急性肺损伤的炎症反应
急性肺损伤后肺泡灌洗液内炎症细胞数量增加（图 5a）。急性肺损伤组肺泡灌洗液内炎症细胞数量是对照组的 8 倍，H-LPS 与 N-LPS 组相比，炎症细胞减少 45%（P<0.05，图 5b）。用 Western blot 检测肺组织中 MPO 活性（图 5c、d），用免疫组织化学方法观察组织切片中 MPO 阳性细胞的数量，急性肺损伤后 MPO 阳性的棕色细胞数量明显增加（图 5e）。高剂量利伐沙班饲料喂养小鼠后，急性肺损伤的 MPO 水平明显下降（P<0.05）。用 ELISA 方法检测炎症细胞因子 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的水平，发现对照组肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量很低；内毒素气管内滴注后，肺泡灌洗液中炎症因子表达增加明显（P<0.01）；利伐沙班预处理后这些炎症因子表达减低（P<0.05）。结果见图5 f~h。
图5
利伐沙班抑制急性肺损伤的炎症反应
a. 肺泡灌洗液中炎症细胞病理像（吉姆萨–瑞特×100）；b. 肺泡灌洗液中细胞数量；c、d. 肺组织中 MPO 含量 Western blot 检测像和定量分析；e. 肺组织中 MPO 表达病理像（免疫组织化学×100）；f. 肺泡灌洗液中 IL-1β 含量；g. 肺泡灌洗液中 TNF-α 含量；h. 肺泡灌洗液中 IL-6 含量。与 PBS 组比较，*
2.5 利伐沙班通过 PAR-2-NF-κB 信号通路抑制炎症反应
与 PBS 组相比，内毒素处理组小鼠肺组织中 PAR-2 表达增加，PAR-2 阳性的棕色细胞明显增多（图 6a）；与 N-LPS 组相比，利伐沙班可以降低肺组织中 PAR-2 和 p-P65 的蛋白表达（图 6b~d）。这些结果表明 PAR-2 和 FXa 与急性肺损伤的病理改变相关。利伐沙班可以通过抑制 PAR-2-NF-κB 信号通路减轻内毒素诱导的肺损伤。
图6
利伐沙班抑制炎症信号通路 PAR-2-NF-κB 的激活
a. 肺组织 PAR-2 表达病理像（免疫组织化学染色×100 及×400）；b. 肺组织 PAR-2、P65 和 p-P65 蛋白表达 Western blot 检测像（β-actin作为内参照）；c. 肺组织中 PAR-2 含量；d. 肺组织中 p-P65 含量。与 PBS 组比较，*
3 讨论
本研究证实利伐沙班有抗凝作用，影响外源性凝血途径，并可以抑制炎症反应，改善内毒素引起的小鼠急性肺损伤。用含有 0.4 mg/g 利伐沙班饲料喂养小鼠，凝血功能 PT 时间明显延长。抑制 FXα 可以减轻急性肺损伤程度，降低肺组织中炎症因子含量，如 IL-1β、TNF-α 和 IL-6。利伐沙班抑制急性肺损伤组织中 PAR-2 表达，从而通过对核转录因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）炎症信号通路抑制改善急性肺损伤严重程度。
凝血级联反应的主要功能是促进止血和减少血液丢失，在炎症反应和组织损伤修复过程中也起重要作用。凝血蛋白酶如 FXα 和凝血酶，除了有促凝血功能以外，也可以促进多种炎症反应[24]。急性肺损伤与肺组织内局部的炎症反应和凝血功能异常都相关。炎症反应和凝血功能相互促进可以进一步加重急性肺损伤，如果抑制一方面的异常可以打破这种相互促进的状态，从而减轻急性肺损伤的病理改变。本研究发现，应用 FXα 抑制剂不仅可以抑制小鼠的外源性凝血功能，也可以抑制急性肺损伤的局部炎症反应，因此推测它通过抑制促凝血状态来抑制炎症反应。既往研究已发现，内毒素气管内滴注引起的急性肺损伤小鼠凝血功能没有明显变化，即急性肺损伤小鼠的 PT、APTT 和 TT 值与正常小鼠相比没有明显变化[5]。用含有高剂量利伐沙班饲料喂养小鼠，其体内血药浓度可达到 141 ng/mL，远高于治疗作用人体内的血药浓度，小鼠凝血功能中的 PT 值延长。但本研究并不能明确证实利伐沙班是否仅通过抗凝血途径发挥抗炎作用，从而来减轻小鼠急性肺损伤的严重程度。
肺血管内皮细胞损伤和气血屏障通透性增高在内毒素诱导急性肺损伤中起重要作用。急性肺损伤病变中有大量的细胞因子和炎症因子表达增加[25]。炎症因子促进白细胞黏附、凝血功能激活和肺气血屏障通透性增加。肺毛细血管内皮细胞屏障的完整性在保持血管和肺组织功能稳定方面起关键作用[26]。本研究探究利伐沙班对炎症信号通路 NF-κB 的作用，NF-κB 信号途径已被证实在炎症反应中起重要作用，本研究证明了利伐沙班对内毒素诱导急性肺损伤的抑制作用。PAR-2 可以被 TF-VIIα 复合物和 FXα 激活，同时 PAR-2 在炎症反应和血管内皮细胞功能中起作用。本研究用急性肺损伤小鼠模型阐述 FXα 抑制剂和 PAR-2 之间的关系，发现内毒素激活 PAR-2 和促进炎症细胞因子分泌。利伐沙班可以抑制 NF-κB 信号通路的激活，可以通过抑制 PAR-2-NF-κB 信号通路来抑制急性肺损伤的严重程度。
综上所述，本研究利用内毒素气管内滴注成功地建立了小鼠急性肺损伤模型，进一步在基础实验方面证实了急性肺损伤和凝血功能之间相互促进的关系。直接抑制 FXα 可以通过对炎症信号通路 PAR-2-NF-κB 的抑制来改善急性肺损伤的炎症反应。利伐沙班除了有抗凝作用外，也可以抑制内毒素引起的炎症反应。关于 FXα 抑制剂改善急性肺损伤的具体机制还需进一步细胞学方面的研究。
急性肺损伤是一种常见的呼吸衰竭疾病，特点是肺毛细血管渗出增加、中性粒细胞浸润和肺气血屏障破坏[1]，其病理变化还包括出血及微血栓形成[2]。在感染性疾病引起的急性肺损伤，细菌性脓毒血症是死亡的主要因素；细菌产生的毒素，如脂多糖和内毒素会导致炎症反应、细胞骨架重构和内皮屏障破坏[3]。急性肺损伤的病理改变包括炎症反应和肺组织内促凝血及抗纤溶功能增强[4]，特别是肺组织内凝血功能激活相对于抗凝和纤溶来说在急性肺损伤的病理生理改变中更加重要[2]。肺组织中的凝血功能增强，会影响组织中炎症反应及损伤修复[5]。研究表明肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）和 IL-6，可以激活外源性凝血途径；同时凝血因子 Xα（coagulation factor Xα，FXα）、α-凝血酶和纤维蛋白的增加也促使 IL-6 和 IL-8 的合成[6]。因此，凝血和炎症反应的相互促进，会导致急性肺损伤程度加重[7]。
研究表明，除了促凝血功能外，FXα 在其他生理过程中也起重要作用，涉及炎症调节、血管重构和组织纤维化[8-9]。急性肺损伤小鼠的肺泡灌洗液中凝血酶和 FXα 升高[10]。FXα 可以增加炎症因子的 mRNA 表达[11-12]。凝血因子的非凝血功能主要通过蛋白酶激活受体（protease-activated receptors，PARs）调节，增加组织炎症反应及抑制组织修复[12-14]。PARs 是一种 G 蛋白结合受体家族，调节凝血系统蛋白酶的功能，例如凝血酶、胰蛋白酶和金属蛋白酶[15]。生理条件下，PAR-2 主要表达在血管内皮细胞上，PAR-2 激活可以促进内皮细胞转变成促炎细胞，使血管通透性增加，促炎症因子分泌及表达增加[16-18]。
利伐沙班是一种口服抗凝药，可以抑制 FXα 和减少体内炎症介质分泌[12]。但是，利伐沙班是否对内毒素诱导的急性肺损伤有影响及相关作用机制研究没有相关报道。本研究旨在小鼠体内证明利伐沙班通过抑制 PAR-2-NF-κB 信号通路改善内毒素引起的急性肺损伤。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂
FXα 购自 Hematologic Technologies 公司，内毒素和伊文思蓝购自 Sigma 公司，利伐沙班购自拜耳药业，上海斯莱克动物饲料公司制备含有利伐沙班 0.4 mg/g 和 0.2 mg/g 啮齿类动物饲料。小鼠的凝血功能用法国 Stago 公司的半自动血凝仪检测。各种单克隆抗体，如 P65、p-P65、β-肌动蛋白（β-actin）购自 Cell Signaling Technology 公司。PAR-2 抗体购自 Abcam 公司；髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）抗体购自 R&D 公司；鼠 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自 R&D 公司。蛋白浓度测量用 BCA 试剂盒。所有试剂及药品均为药物级别。
1.2 动物实验及标本取材
雄性 C57BL/6 小鼠（6～7 周，平均体重 20 g）购自斯莱克实验动物中心［动物生产许可证号：scxk（沪 2017-0005）］。将 C57BL/6 小鼠随机分为对照组（ PBS 组）、标准饲料组（N-LPS 组）、 0.2 mg/g 利伐沙班组（L-LPS 组）和 0.4 mg/g 利伐沙班组（H-LPS 组）。PBS 组给予标准饲料喂养；N-LPS 组、L-LPS 组和 H-LPS 组造模前分别给予标准饲料、含有 0.2 mg/g 或 0.4 mg/g 利伐沙班的饲料共 10 d[14]。饲料喂养前后分别称量各组小鼠体重，评估不同饲料对小鼠营养状态的影响。喂养 10 d 后，N-LPS 组、L-LPS 组和 H-LPS 组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，经气管按体重滴注内毒素（浓度为 2 mg/mL，2.5 μL/g）进行造模，PBS 组给予相同容积的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）。造模 48 h 后，处死小鼠取血浆、支气管肺泡灌洗液及肺组织进行相关实验结果分析。小鼠急性肺损伤建模流程见图 1。每组 6 只小鼠。
图1
内毒素气管内滴注建立小鼠急性肺损伤模型流程图
内毒素气管内滴注建立小鼠急性肺损伤模型，造模前给予标准饲料或给予含有不同剂量利伐沙班药物的饲料
从心脏取出全血后，根据全血体积与 3.4% 的枸橼酸钠相混合，用两次离心法制备乏血小板血浆，然后分装血浆保存在–80 ℃冰箱中。行左肺肺泡灌洗，回收支气管肺泡灌洗液分别测炎症细胞数量、蛋白浓度、伊文思蓝浓度和细胞因子含量。一部分右肺组织用福尔马林固定和石蜡包埋。部分肺组织行蛋白印迹法（Western blot）检测分析。所有实验经过复旦大学动物实验及关怀委员会同意。
1.3 检测指标
1.3.1 凝血功能评价
测定鼠尾出血时间。乏血小板血浆用半自动血凝仪测定活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）和凝血酶时间（thrombin time，TT）。
1.3.2 利伐沙班血药浓度的测定
用液相色谱–质谱（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）法测定[19]。用利奈唑胺作为内参照，血清中二甲基亚砜为 0.05%，不影响小鼠凝血功能[20]。
1.3.3 肺湿干重比
取右肺下叶放在事先称重的铝箔纸上，称重减去铝箔纸重量，表示湿重；将其放入 60 ℃ 温箱中烘烤 5 d，再次称重获得此肺组织干重（即两次测量干重质量固定后被确定为肺组织干重）。所得湿重和干重比值为湿干重比[21]。
1.3.4 肺气血屏障的通透性评价
肺组织通透性用肺泡灌洗液中的蛋白浓度、伊文思蓝浓度和肺组织内伊文思蓝含量表示[22]。用 BCA 方法测定肺泡灌洗液中的蛋白浓度。血清白蛋白结合的伊文思蓝复合物可以通过肺泡气血屏障到达损伤的肺组织部位[23]。肺泡灌洗液和肺组织萃取液经 620 nm 波长光测定溶液中的伊文思蓝浓度，计算肺泡灌洗液（μg/mL）及单位质量干肺组织中的伊文思蓝含量（μg/g）。
1.3.5 肺泡灌洗液中的炎症细胞计数
肺泡灌洗液中的细胞沉淀，用小动物血细胞分析仪测定炎症细胞数量。取 10 μL 细胞重悬液滴在载玻片上，用吉姆萨–瑞特染液进行悬浮细胞染色，显微镜下观察及计数有核细胞，确定分类及数量。
1.3.6 肺组织的形态学评价
开胸取右肺部分肺叶，用 10% 的福尔马林固定，石蜡包埋，苏木精–伊红染色，光镜下评价肺损伤程度，计算肺组织病理损伤评分（total histology score，THS）。
1.3.7 放射学分析
小动物 CT 目前已成为一种有效的实验室检查方法。为了评价 LPS 对肺损伤的影响，急性肺损伤小鼠制备 48 h 后用西门子的小动物 CT 扫描小鼠整个胸腔，用 Feldkamp 算法重构图像，用 DICOM 软件读片及获得有效图像。
1.3.8 免疫组织化学分析
石蜡切片进行脱蜡，用梯度乙醇脱水；室温用 10% 小羊血清封闭 30 min，然后相应一抗 4 ℃ 孵育过夜；37 ℃ 二抗孵育 20 min；显微镜观察并记录。
1.3.9 ELISA 检测肺泡灌洗液中炎症因子
采用小鼠的左肺肺泡灌洗液，回收率为 80%，用鼠相应 ELISA 试剂盒，测量炎症细胞因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的浓度。
1.3.10 Western blot 检测
采用深低温冻存的肺组织，匀浆，取上清液；检测肺组织中的 MPO、PAR-2、P65、p-P65 和β-actin 含量。用 1% PMSF 的组织裂解液裂解组织，用 SDS-PAGE 胶分离目标蛋白，一抗 4 ℃ 孵育过夜，二抗室温孵育 2 h，显影和拍照。用 ImageJ 软件检测目标蛋白和内参照蛋白的灰度比值。
1.4 统计学方法
采用 GraphPad Prism 软件进行数据分析。呈正态分布的计量数据用均数±标准差（±s）表示，用 Student’s 非配对 t 检验和 ANOVA 多参数检验方法进行统计学分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠的基本情况
本实验首先观察用不同含量利伐沙班饲料喂养后的小鼠，三组间体重无明显差异（图 2a）。用 LC-MS 方法检测利伐沙班的血药浓度，给予0.2 mg/g 和 0.4 mg/g 利伐沙班饲料的小鼠利伐沙班血药浓度相应上升（图 2b）。不同饲料喂养的各组小鼠，鼠尾出血时间差异无统计学意义（P=0.03）（图 2c）。检测各组小鼠乏血小板血浆中凝血功能的 PT、APTT 和 TT 值（图 2d~f），各组 TT、APTT 值没有显著差异（P>0.05）；但是，用含 0.4 mg/g 利伐沙班饲料喂养的小鼠与常规饲料小鼠相比，其凝血功能 PT 值延长；低剂量的利伐沙班饲料对小鼠的 PT 值没有明显影响。
图2
不同饲料喂养的小鼠基本情况
a. 小鼠的体重；b. 利伐沙班的血药浓度；c. 鼠尾出血时间；d. PT；e. APTT；f. TT。与 N-LPS 组比较，*
2.2 利伐沙班减轻内毒素引起的急性肺损伤
内毒素刺激 48 h 后，各组小鼠急性肺损伤病理改变明显，炎症细胞浸润，肺间质增厚，组织水肿明显（图 3a）。用 THS 方法半定量评价肺损伤严重程度，发现高剂量利伐沙班饲料喂养的小鼠，与正常饲料喂养的小鼠相比，内毒素气管内滴注后急性肺损伤程度明显减轻；但是，内毒素在低剂量利伐沙班饲料喂养小鼠并没有表现出相应作用（图 3b）。用小动物 CT 扫描检查各组小鼠急性肺组织损伤程度，与对照组小鼠比较，急性肺损伤组表现出双侧肺野广泛渗出，高剂量利伐沙班饲料喂养可以减轻急性肺损伤渗出（图 3c）。
图3
利伐沙班可以减轻急性肺损伤程度
a. 小鼠肺组织病理像（苏木精–伊红染色×100）；b. 小鼠肺组织的 THS 评分；c. 小动物 CT 影像学检测各组小鼠急性肺损伤程度。与 PBS 组比较，*
2.3 利伐沙班减轻肺损伤气血屏障的通透性
对照组小鼠肺湿干重比为 4.30±0.11，内毒素刺激后，急性肺损伤小鼠肺的湿干重比为 5.29±0.25。用标准饲料和含有利伐沙班饲料喂养的各组急性肺损伤小鼠肺湿干重比差异无统计学意义（图 4a）。与对照组相比，内毒素诱导急性肺损伤后肺泡灌洗液的蛋白浓度明显升高（P<0.05）。用含 0.2 mg/g 和 0.4 mg/g 利伐沙班饲料喂养的小鼠，急性肺损伤后肺泡灌洗液蛋白浓度降低（P<0.05，图 4b）。急性肺损伤造模 48 h 后，与对照组相比，内毒素刺激后肺泡灌洗液和肺组织中伊文思蓝含量明显增高（P<0.05）；与 N-LPS 组小鼠相比，L-LPS 及 H-LPS 组小鼠肺泡灌洗液及肺组织中伊文思蓝浓度明显降低（P<0.05）（图 4c、d）。以上结果提示，利伐沙班可以通过改善肺气血屏障通透性减轻急性肺损伤的严重程度。
图4
利伐沙班对急性肺损伤气血屏障通透性的影响
a. 肺湿干重比；b. 肺泡灌洗液中的蛋白浓度；c. 肺泡灌洗液中伊文思蓝浓度；d. 小鼠肺组织中伊文思蓝浓度。与 PBS 组比较，*
2.4 利伐沙班抑制急性肺损伤的炎症反应
急性肺损伤后肺泡灌洗液内炎症细胞数量增加（图 5a）。急性肺损伤组肺泡灌洗液内炎症细胞数量是对照组的 8 倍，H-LPS 与 N-LPS 组相比，炎症细胞减少 45%（P<0.05，图 5b）。用 Western blot 检测肺组织中 MPO 活性（图 5c、d），用免疫组织化学方法观察组织切片中 MPO 阳性细胞的数量，急性肺损伤后 MPO 阳性的棕色细胞数量明显增加（图 5e）。高剂量利伐沙班饲料喂养小鼠后，急性肺损伤的 MPO 水平明显下降（P<0.05）。用 ELISA 方法检测炎症细胞因子 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的水平，发现对照组肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量很低；内毒素气管内滴注后，肺泡灌洗液中炎症因子表达增加明显（P<0.01）；利伐沙班预处理后这些炎症因子表达减低（P<0.05）。结果见图5 f~h。
图5
利伐沙班抑制急性肺损伤的炎症反应
a. 肺泡灌洗液中炎症细胞病理像（吉姆萨–瑞特×100）；b. 肺泡灌洗液中细胞数量；c、d. 肺组织中 MPO 含量 Western blot 检测像和定量分析；e. 肺组织中 MPO 表达病理像（免疫组织化学×100）；f. 肺泡灌洗液中 IL-1β 含量；g. 肺泡灌洗液中 TNF-α 含量；h. 肺泡灌洗液中 IL-6 含量。与 PBS 组比较，*
2.5 利伐沙班通过 PAR-2-NF-κB 信号通路抑制炎症反应
与 PBS 组相比，内毒素处理组小鼠肺组织中 PAR-2 表达增加，PAR-2 阳性的棕色细胞明显增多（图 6a）；与 N-LPS 组相比，利伐沙班可以降低肺组织中 PAR-2 和 p-P65 的蛋白表达（图 6b~d）。这些结果表明 PAR-2 和 FXa 与急性肺损伤的病理改变相关。利伐沙班可以通过抑制 PAR-2-NF-κB 信号通路减轻内毒素诱导的肺损伤。
图6
利伐沙班抑制炎症信号通路 PAR-2-NF-κB 的激活
a. 肺组织 PAR-2 表达病理像（免疫组织化学染色×100 及×400）；b. 肺组织 PAR-2、P65 和 p-P65 蛋白表达 Western blot 检测像（β-actin作为内参照）；c. 肺组织中 PAR-2 含量；d. 肺组织中 p-P65 含量。与 PBS 组比较，*
3 讨论
本研究证实利伐沙班有抗凝作用，影响外源性凝血途径，并可以抑制炎症反应，改善内毒素引起的小鼠急性肺损伤。用含有 0.4 mg/g 利伐沙班饲料喂养小鼠，凝血功能 PT 时间明显延长。抑制 FXα 可以减轻急性肺损伤程度，降低肺组织中炎症因子含量，如 IL-1β、TNF-α 和 IL-6。利伐沙班抑制急性肺损伤组织中 PAR-2 表达，从而通过对核转录因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）炎症信号通路抑制改善急性肺损伤严重程度。
凝血级联反应的主要功能是促进止血和减少血液丢失，在炎症反应和组织损伤修复过程中也起重要作用。凝血蛋白酶如 FXα 和凝血酶，除了有促凝血功能以外，也可以促进多种炎症反应[24]。急性肺损伤与肺组织内局部的炎症反应和凝血功能异常都相关。炎症反应和凝血功能相互促进可以进一步加重急性肺损伤，如果抑制一方面的异常可以打破这种相互促进的状态，从而减轻急性肺损伤的病理改变。本研究发现，应用 FXα 抑制剂不仅可以抑制小鼠的外源性凝血功能，也可以抑制急性肺损伤的局部炎症反应，因此推测它通过抑制促凝血状态来抑制炎症反应。既往研究已发现，内毒素气管内滴注引起的急性肺损伤小鼠凝血功能没有明显变化，即急性肺损伤小鼠的 PT、APTT 和 TT 值与正常小鼠相比没有明显变化[5]。用含有高剂量利伐沙班饲料喂养小鼠，其体内血药浓度可达到 141 ng/mL，远高于治疗作用人体内的血药浓度，小鼠凝血功能中的 PT 值延长。但本研究并不能明确证实利伐沙班是否仅通过抗凝血途径发挥抗炎作用，从而来减轻小鼠急性肺损伤的严重程度。
肺血管内皮细胞损伤和气血屏障通透性增高在内毒素诱导急性肺损伤中起重要作用。急性肺损伤病变中有大量的细胞因子和炎症因子表达增加[25]。炎症因子促进白细胞黏附、凝血功能激活和肺气血屏障通透性增加。肺毛细血管内皮细胞屏障的完整性在保持血管和肺组织功能稳定方面起关键作用[26]。本研究探究利伐沙班对炎症信号通路 NF-κB 的作用，NF-κB 信号途径已被证实在炎症反应中起重要作用，本研究证明了利伐沙班对内毒素诱导急性肺损伤的抑制作用。PAR-2 可以被 TF-VIIα 复合物和 FXα 激活，同时 PAR-2 在炎症反应和血管内皮细胞功能中起作用。本研究用急性肺损伤小鼠模型阐述 FXα 抑制剂和 PAR-2 之间的关系，发现内毒素激活 PAR-2 和促进炎症细胞因子分泌。利伐沙班可以抑制 NF-κB 信号通路的激活，可以通过抑制 PAR-2-NF-κB 信号通路来抑制急性肺损伤的严重程度。
综上所述，本研究利用内毒素气管内滴注成功地建立了小鼠急性肺损伤模型，进一步在基础实验方面证实了急性肺损伤和凝血功能之间相互促进的关系。直接抑制 FXα 可以通过对炎症信号通路 PAR-2-NF-κB 的抑制来改善急性肺损伤的炎症反应。利伐沙班除了有抗凝作用外，也可以抑制内毒素引起的炎症反应。关于 FXα 抑制剂改善急性肺损伤的具体机制还需进一步细胞学方面的研究。
