引用本文： 郭璐, 钟振东, 刘晓姝, 蒋才玉, 杨雁, 杨阳, 张静, 蒲红, 李为民. MUC5B 和 TOLLIP 基因多态性对特发性肺纤维化患者预后评估的临床研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2019, 18(6): 543-548. doi: 10.7507/1671-6205.201811081 复制
特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明的慢性进展性肺疾病，死亡率高，治疗方案少[1]。一项 IPF 的多中心全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）报道包括肺防御蛋白（如黏蛋白 5B、MUC5B）、受体调节蛋白（如 Toll 样相互作用蛋白、TOLLIP）等与 IPF 易感性和生存率相关[2-3]。MUC5B 和 TOLLIP 的基因位点均位于染色体 11p15.5 的附近，两者位置非常靠近却具有明显不同的生物学功能，MUC5B 对保护呼吸道表面上皮起着关键作用，其失调机制在 IPF 的发病机制中的作用尚不完全清楚，但可能与这一关联基因对黏蛋白和（或）产黏蛋白细胞的致病作用相关[4-5]。TOLLIP 基因编码 Toll 样相互作用蛋白，是一种抑制性适配器蛋白质，作用下游 Toll 样受体[6]。MUC5B 和 TOLLIP 这两个基因多态性一直与 IPF 的易感性和生存率相关，对肺宿主防御至关重要，且与减缓疾病进展有关[7]。然而，基因多态性大约仅占与 IPF 发病相关的遗传风险的 30%，且具有人种差异，异常调节的分子机制仍有待建立[8]。该基因多态性对中国 IPF 患者人群的相关性和临床价值研究较少，仍需进一步明确。因此，本试验旨在探索中国 IPF 患者 MUC5B 和 TOLLIP 的基因多态性变异状况，识别与 IPF 易感性相关的遗传变异，并为患者提供靶向治疗的理论依据。
1 资料与方法
1.1 临床资料
2012 年 1 月 1 日至 2017 年 12 月 31 日期间在四川省医学科学院·四川省人民医院门诊、住院部诊断和随访的 IPF 患者纳入研究，纳入研究的患者符合 2011 年 ATS/ERS/JRS/ALAT 提出的指南诊断标准[9]，即患者高分辨率计算机断层扫描（high resolution computerized tomography，HRCT）上表现为典型的寻常性间质性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP）；HRCT 表现不典型者接受外科肺活检，且 HRCT 表现与肺活检病理学表现符合 UIP 特定组合。纳入研究患者共 126 例，其中男 95 例（75.4%），女 31 例（24.6%），年龄 50～92 岁，平均年龄（74.4±9.8）岁，对纳入的 IPF 患者定期进行随访，排除患有其他类型间质性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）、肺移植、失去随访及伴有恶性肿瘤的 IPF 患者。本研究通过了四川省医学科学院·四川省人民医院医学伦理委员会审查［编号：伦审（研）2017-171］，纳入研究患者均自愿参加并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 资料收集
收集患者首诊时的各项临床指标，包括年龄、性别、吸烟史等人口学资料，以及临床病史、肺功能、HRCT、外周血检查资料等。非吸烟者是指一生中吸烟<100 支的患者。
1.2.2 随访方案
自 2012 年 1 月 1 日起，对纳入的 IPF 患者定期进行随访，随访 5 年。患者死亡或者在我院就诊的最后一次随访医疗行为，以及患者肺移植手术前的最后一次随访设定为随访终点。其中，急性加重期患者因病情急性加重就医，采集临床症状、肺功能、HRCT、外周血标本检测血清生物标志物等；稳定期患者每隔 3 个月门诊随访，采集临床症状、肺功能、外周血标本检测血清生物标志物，每间隔 6 个月做一次 HRCT。记录末次随访具体时间，再次采集临床症状、肺功能、HRCT 扫描、抽取外周血标本检测血清生物标志物。
1.2.3 HRCT
所有纳入研究的患者采用仰卧位，吸气相末屏气时行 HRCT，采用 64 多探头 CT 扫描仪（SOMATOM Definition Flash，Siemens，德国；LightSpeed VCT，GM Medical Systems，美国），技术参数：120 kV，窗宽（window width，WW）1 000～1 200 HU；窗位（window level，WL）–700～–600 HU；厚度 1 mm，间隔 1 cm，高空间频率（骨）算法重建。连续随访在同一品牌的扫描仪上进行。
1.2.4 计算机辅助系统组织量化
计算机辅助系统（采用软件系统 MeVis PULMO 3D 3.11，MeVIS Research GmbH，Bremen，德国和 CALIPER 计算机分析技术软件）自动分析 HRCT 扫描中的异常肺结构并加以标记和量化、根据气道解剖特点进行肺段分析[10]。首先，CALIPER 计算机分析技术软件自动根据像素不同将肺段分为正常或异常（肺气肿、网格状影和蜂窝病变）；其次，软件自动计算各病变的绝对值和占肺总容积的百分比，并用不同的颜色编码标识出来，使用三维成像进行演示。总体 ILD 病变容积被定义为磨玻璃影、网格状影和蜂窝病变异常的体积总量。对比首次与末次的组织量化指标，结合观察时限分析指标的差值，计算年变化程度。
1.2.5 肺功能测定
患者的首次肺功能测定在 HRCT 检查前后 1 周内进行，由技术人员负责操作（MS PFT，VIASYS 系列，美国），操作遵循 ATS/ERS 的指南标准[11]。分别记录肺总量（total lung capacity，TLC）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、一氧化碳弥散功能（carbon monoxide diffusion function，DLCO）。对比首次与末次的测定指标，结合观察时限分析指标的差值，计算年变化程度。
1.2.6 MUC5B 和 TOLLIP 的单核苷酸多态性提取及检测
纳入研究的 126 例 IPF 患者均在入组时提取血标本做 DNA 检测。血液经 10 000 r/min 离心，取血清在–80 ℃ 冰箱保存，血液 DNA 提取后采用实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），将 PCR 产物纯化后测序，分别测试 MUC5B rs35705950 及 TOLLIP rs5743890、rs5743894 的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。
PCR 引物设计使用 Primer 引物设计软件设计筛选各基因特异性引物。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，并以 ULTRAPAGE 纯化。rs5743890 引物序列上游：5′-TCGTCCAGTAGGGAGTCTCGTAGGTA-3′，下游：5′-AGAAGTAACATTCCGTCGGGAGCC-3′；rs5743894 引物序列上游：5′-TTCCGTTCCCGTAGTCACGTTCTCCA-3′，下游：5′-TCGTCGGTTCACGTGTGTCCGTAG-3′；rs35705950 引物序列上游：5′-AACCGGCGTGTTCCCTTTCCTTCCT-3′，下游：5′-GACTTGTCCCTCGTCCCTCCCACTA-3′。
PCR 反应体系为 20 μL，在 EP 管中分别加入 SYBR Primix Ex TaqⅡ（2×），10.0 μL；正向引物（0.4 μmol/L），0.8 μL；反向引物（0.4 μmol/L），0.8 μL；cDNA，2.0 μL；ddH2O，6.4 μL。将 EP 管放入离心机进行瞬时离心。PCR 反应程序：95 ℃ 预变性 30 s，95 ℃ 变性 5 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 个循环，4 ℃ 保存。
1.2.7 血清 KL-6 和 CXCL13 的测定
采集外周血标本，经 3 000 r/min 离心，取血清在–80 ℃ 冰箱保存，分别采用化学发光酶免疫检测法和酶联免疫吸附法检测血清涎液化糖链抗原-6（Krebs Von den Lungen-6，KL-6）和 B 淋巴细胞趋化因子 CXCL13（C-X-C motif chemokine ligand 13）水平[12-13]。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（
±s）表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；计数资料以率和构成比表示，采用 Pearson χ2 检验，利用 Kaplan-Meier 法对生存函数进行估计，并通过对数秩检验进行比较。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 IPF 患者 MUC5B SNP rs35705950 及 TOLLIP SNP rs5743890、rs5743894 基因亚型的表达
纳入研究的 126 例 IPF 患者中，TOLLIP SNP rs5743890 和 rs5743894 均表达为具有两个主要等位基因 A 的纯合子（AA 型），占总人数的 100.0%，未检测到次要等位基因 G；116 例患者的 MUC5B SNP rs35705950 表达为具有两个主要等位基因 G 的纯合子（GG 型），占总人数的 92.1%，携带一个次要等位基因 T 的杂合子（GT 型）类型的患者仅有 10 例，占总人数的 7.9%，而且均为男性，未检测到携带两个次要等位基因 T 的纯合子类型（TT 型）。根据 MUC5B rs35705950 SNP 的不同，纳入研究的 IPF 患者分为 G 组（基因表型为 GG）和 T 组（基因表型为 GT）。
2.2 不同 MUC5B rs35705950 SNP 表达的 IPF 患者临床特征比较
两组年龄和未吸烟者的分布趋势无明显差异（P>0.05）。与 G 组相比，T 组患者肺功能 DLCO 和 TCL 的年下降水平、血清生物标志物 KL-6 和 CXCL13 的基线水平、影像学的网格状影和蜂窝病变病变年增加程度相对较低（P<0.05）。随访期间两组死亡率比较，G 组明显高于 T 组（χ2=29.069，P=0.02）。结果见表 1。
表1
不同 rs35705950 SNP 类型的 IPF 患者的临床特征比较（
）
2.3 不同 MUC5B rs35705950 SNP 表达的 IPF 患者中位生存时间的比较
携带 MUC5B SNP rs35705950 次要等位基因（GT 型）杂合子的 IPF 患者的中位生存时间明显高于基因表型均为 GG 的纯合子 IPF 患者（45.3 个月，95% 可信区间 40.172～46.220 比 36.0 个月，95% 可信区间 35.659～43.341，P=0.02）。结果见图 1。
图1
不同 MUC5B rs35705950 SNP 的 IPF 患者 Kaplan-Meier 生存曲线比较
3 讨论
IPF 是原因不明并以普通型间质性肺炎为特征性病理改变的一种慢性炎症性间质性肺疾病。近年研究表明，IPF 是一种“二次打击”疾病，是基因调控与环境压力相结合的具有遗传倾向疾病[14]。GWAS 研究采用候选基因及病例对照研究已证实 IPF 与黏蛋白基因 MUC5B 启动子 rs35705950 及 TOLLIP 启动子 rs5743890、rs5743894 基因多态性相关，具有遗传易感倾向；基因变异参与宿主防御、细胞与细胞间的黏附和 DNA 修复，与 IPF 疾病进展风险相关[2]，这为研究 IPF 遗传易感及发病机制探索了一条新的途径。
美国华盛顿大学首次采用全基因组测序 1 例 61 岁临床确诊的 IPF 患者，发现在 MUC5B 启动子区未发现除 rs35705950 以外的其他相邻的序列，并发现 rs35705950 位于 MUC5B 启动子区干扰 DNA 酶与转录因子结合位点，上调 MUC5B 表达，表明 MUC5B 启动子区单核苷酸多态性可能是与 IPF 发病相关的重要遗传因素[15]。此外，Scholand 等[16]研究发现咳嗽的严重程度与 MUC5B rs35705950 启动子 G>T 多态性显著相关，提示了 IPF 表型遗传学异质性的可能机制。有研究纳入 438 例 IPF 患者，被检出携带 MUC5B 基因多态性的患者共 37%，且未校正 2 年累计死亡率低于未携带 MUC5B 多态性的患者[17]。TOLLIP 与 MUC5B 位于同一基因位点，rs5743890、rs5743894 位于非编码的 TOLLIP 调控区域内，rs5743890 作为保护性的次要等位基因可降低 IPF 患病的易感性，但与 IPF 患者的死亡率增加相关[18]。提示 MUC5B、TOLLIP 多态性在统计学上仍是生存的显著预测因素，对于患有亚临床或早期疾病的患者，在肺功能明显下降前，通过综合 MUC5B 及其他因素的预测能力来预测预后可能有所帮助。本研究结果提示中国 IPF 患者中，对预后相关的 MUC5B SNP rs35705950 及 TOLLIP SNP rs5743890 和 rs5743894 的基因多态性分布上绝大多数是由主要基因位点组成的纯合子类型；在 rs35705950 表达中，有少数 GT 杂合子分布，而以次要基因位点 T 为纯合子的 SNP 出现概率最小。而一项多中心临床研究中报道韩国 IPF 患者中 TOLLIP rs5743890 基因位点具有次要等位基因 G 的频率为 6%，在欧美白种 IPF 患者中报道分别接近 11% 和 29%[19]，提示黄种 IPF 患者 TOLLIP 和 MUC5B 的 SNP 携带次要基因位点的概率明显低于白种 IPF 患者。本研究中具有基因变异的人群均为男性，与吸烟史及年龄无相关性，提示这种基因变异的分布可能具有性别优势，但本研究为单中心研究，因此，中国 IPF 患者间的差异尚需要多中心大样本量的研究进一步证实。
许多肺功能测试的生理变量是用来评估 IPF 疾病严重程度和预测 IPF 生存的重要指标，其中与预后确切相关的指标有 FVC、TLC、DLCO[20]。研究表明 6～12 个月 FVC 和 DLCO 的动态变化与 IPF 的预后高度相关，且比大多数基线特征更能预测预后[21]。另有研究表明携带 rs35705950 SNP 主要和次要等位基因的 IPF 患者具有不同的纤维化影像模式，携带 T 等位基因（T 组）与 CT 影像和组织学 UIP 诊断一致的患者密切相关，GG 纯合子亚型具有更显著的磨玻璃影表现，T 组显示更为显著的胸膜下轴线分布的纤维化病变，G 组和 T 组对于蜂窝病变病变表现无差异[22]。提示 MUC5B 启动子多态性可识别 UIP/IPF 模式而区别其他原因导致的肺纤维化的模式。但既往研究尚未提及 HRCT 病变的动态变化与 MUC5B 启动子多态性的相关性，我们的研究表明，两个基因组患者的影像学的网格状和蜂窝病变病变进展及肺功能变化有差异。这一结论与 Best 等[23]的研究结论一致，提示基因型与预后存在相关性。
KL-6 在 IPF 中一直作为纤维化的非特异性标志物被研究，报道指出 IPF 患者血清 KL-6 水平比健康志愿者明显升高，作为一种黏液样糖蛋白表达于Ⅱ型肺泡细胞的细胞外表面和细支气管上皮细胞，并作为一种趋化因子促进了肺成纤维细胞的迁移、增殖和存活[24]。CXCL13 是引导 B 细胞到炎性病灶的关键中介因子，循环 CXCL13 水平在许多自身免疫综合征中有明显升高，CXCL13 的 B 细胞配体 C-X-C 趋化因子受体 5 具有介导淋巴细胞趋化性的作用，其出现与 IPF 具有临床相关性。此外，IPF 自身抗体直接促进纤维化增生，促进炎症反应或细胞毒性效应并与患者的临床表现和预后高度相关[25]。最近研究发现 IPF 发病机制中出现异常 B 细胞，提示 CXCL13 可能是一种与 IPF 病因相关，反映纤维化进程的生物标志物[26]。本研究结果显示 GT 基因型患者血清 KL-6、CXCL13 水平明显低于 GG 基因型患者，然而在 5 年的随访期间其随着病情波动起伏，变化缺少规律，因此其临床应用价值尚需进一步研究。
GWAS 研究显示基因型为 GT 和 TT 的 IPF 患者死亡风险明显低于基因型为 GG 的患者，MUC5B rs35705950 SNP 与 IPF 的患者死亡率减少有关[2]。Peljto 等[19]认为潜在的创伤修复等因素使 MUC5B 的基因突变，虽然可导致 IPF 发病风险增高但其危害程度较小，因而其携带者疾病发病率增高而死亡率相对较低。Jiang 等[27]研究同样证实了 MUC5B rs35705950 基因多态性增加 IPF 的易感性，但却发现携带次要基因组的 IPF 患者肺功能 FVC 和 DLCO 有明显下降，其 5 年生存率也有所降低，携带不同 MUC5B rs35705950 基因多态性的 IPF 患者预后差异也符合疾病异质性特点。我们的研究表明 GT 基因型较 GG 基因型的 IPF 患者具有更长的中位生存期，死亡人数明显低于 GG 组。由于临床过程复杂，机制不清，MUC5B 启动子的基因多态性可能具有特异的病理学过程，包括具有更高的疾病易感性风险和不同的生存状态，基因参与程度亦有个体性和复杂性，因而识别基因多态性对 IPF 预后的相关性有助于制定患者精准化治疗策略。
综上所述，中国 IPF 患者存在基因多态性现象；MUC5B rs35705950 和 TOLLIP rs5743890、rs5743894 基因亚型在中国 IPF 患者中突变率较低，可能预示中国 IPF 患者死亡率高且靶向药物治疗效果不佳。然而，本研究系单中心研究，且基因多态性具有人种差异，其与 IPF 发病相关的遗传风险仍需多中心及扩大病例数进一步证实，异常调节的分子机制仍有待建立，基因多态性对中国 IPF 患者的相关性和临床价值研究仍需一步明确。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明的慢性进展性肺疾病，死亡率高，治疗方案少[1]。一项 IPF 的多中心全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）报道包括肺防御蛋白（如黏蛋白 5B、MUC5B）、受体调节蛋白（如 Toll 样相互作用蛋白、TOLLIP）等与 IPF 易感性和生存率相关[2-3]。MUC5B 和 TOLLIP 的基因位点均位于染色体 11p15.5 的附近，两者位置非常靠近却具有明显不同的生物学功能，MUC5B 对保护呼吸道表面上皮起着关键作用，其失调机制在 IPF 的发病机制中的作用尚不完全清楚，但可能与这一关联基因对黏蛋白和（或）产黏蛋白细胞的致病作用相关[4-5]。TOLLIP 基因编码 Toll 样相互作用蛋白，是一种抑制性适配器蛋白质，作用下游 Toll 样受体[6]。MUC5B 和 TOLLIP 这两个基因多态性一直与 IPF 的易感性和生存率相关，对肺宿主防御至关重要，且与减缓疾病进展有关[7]。然而，基因多态性大约仅占与 IPF 发病相关的遗传风险的 30%，且具有人种差异，异常调节的分子机制仍有待建立[8]。该基因多态性对中国 IPF 患者人群的相关性和临床价值研究较少，仍需进一步明确。因此，本试验旨在探索中国 IPF 患者 MUC5B 和 TOLLIP 的基因多态性变异状况，识别与 IPF 易感性相关的遗传变异，并为患者提供靶向治疗的理论依据。
1 资料与方法
1.1 临床资料
2012 年 1 月 1 日至 2017 年 12 月 31 日期间在四川省医学科学院·四川省人民医院门诊、住院部诊断和随访的 IPF 患者纳入研究，纳入研究的患者符合 2011 年 ATS/ERS/JRS/ALAT 提出的指南诊断标准[9]，即患者高分辨率计算机断层扫描（high resolution computerized tomography，HRCT）上表现为典型的寻常性间质性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP）；HRCT 表现不典型者接受外科肺活检，且 HRCT 表现与肺活检病理学表现符合 UIP 特定组合。纳入研究患者共 126 例，其中男 95 例（75.4%），女 31 例（24.6%），年龄 50～92 岁，平均年龄（74.4±9.8）岁，对纳入的 IPF 患者定期进行随访，排除患有其他类型间质性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）、肺移植、失去随访及伴有恶性肿瘤的 IPF 患者。本研究通过了四川省医学科学院·四川省人民医院医学伦理委员会审查［编号：伦审（研）2017-171］，纳入研究患者均自愿参加并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 资料收集
收集患者首诊时的各项临床指标，包括年龄、性别、吸烟史等人口学资料，以及临床病史、肺功能、HRCT、外周血检查资料等。非吸烟者是指一生中吸烟<100 支的患者。
1.2.2 随访方案
自 2012 年 1 月 1 日起，对纳入的 IPF 患者定期进行随访，随访 5 年。患者死亡或者在我院就诊的最后一次随访医疗行为，以及患者肺移植手术前的最后一次随访设定为随访终点。其中，急性加重期患者因病情急性加重就医，采集临床症状、肺功能、HRCT、外周血标本检测血清生物标志物等；稳定期患者每隔 3 个月门诊随访，采集临床症状、肺功能、外周血标本检测血清生物标志物，每间隔 6 个月做一次 HRCT。记录末次随访具体时间，再次采集临床症状、肺功能、HRCT 扫描、抽取外周血标本检测血清生物标志物。
1.2.3 HRCT
所有纳入研究的患者采用仰卧位，吸气相末屏气时行 HRCT，采用 64 多探头 CT 扫描仪（SOMATOM Definition Flash，Siemens，德国；LightSpeed VCT，GM Medical Systems，美国），技术参数：120 kV，窗宽（window width，WW）1 000～1 200 HU；窗位（window level，WL）–700～–600 HU；厚度 1 mm，间隔 1 cm，高空间频率（骨）算法重建。连续随访在同一品牌的扫描仪上进行。
1.2.4 计算机辅助系统组织量化
计算机辅助系统（采用软件系统 MeVis PULMO 3D 3.11，MeVIS Research GmbH，Bremen，德国和 CALIPER 计算机分析技术软件）自动分析 HRCT 扫描中的异常肺结构并加以标记和量化、根据气道解剖特点进行肺段分析[10]。首先，CALIPER 计算机分析技术软件自动根据像素不同将肺段分为正常或异常（肺气肿、网格状影和蜂窝病变）；其次，软件自动计算各病变的绝对值和占肺总容积的百分比，并用不同的颜色编码标识出来，使用三维成像进行演示。总体 ILD 病变容积被定义为磨玻璃影、网格状影和蜂窝病变异常的体积总量。对比首次与末次的组织量化指标，结合观察时限分析指标的差值，计算年变化程度。
1.2.5 肺功能测定
患者的首次肺功能测定在 HRCT 检查前后 1 周内进行，由技术人员负责操作（MS PFT，VIASYS 系列，美国），操作遵循 ATS/ERS 的指南标准[11]。分别记录肺总量（total lung capacity，TLC）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、一氧化碳弥散功能（carbon monoxide diffusion function，DLCO）。对比首次与末次的测定指标，结合观察时限分析指标的差值，计算年变化程度。
1.2.6 MUC5B 和 TOLLIP 的单核苷酸多态性提取及检测
纳入研究的 126 例 IPF 患者均在入组时提取血标本做 DNA 检测。血液经 10 000 r/min 离心，取血清在–80 ℃ 冰箱保存，血液 DNA 提取后采用实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），将 PCR 产物纯化后测序，分别测试 MUC5B rs35705950 及 TOLLIP rs5743890、rs5743894 的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。
PCR 引物设计使用 Primer 引物设计软件设计筛选各基因特异性引物。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，并以 ULTRAPAGE 纯化。rs5743890 引物序列上游：5′-TCGTCCAGTAGGGAGTCTCGTAGGTA-3′，下游：5′-AGAAGTAACATTCCGTCGGGAGCC-3′；rs5743894 引物序列上游：5′-TTCCGTTCCCGTAGTCACGTTCTCCA-3′，下游：5′-TCGTCGGTTCACGTGTGTCCGTAG-3′；rs35705950 引物序列上游：5′-AACCGGCGTGTTCCCTTTCCTTCCT-3′，下游：5′-GACTTGTCCCTCGTCCCTCCCACTA-3′。
PCR 反应体系为 20 μL，在 EP 管中分别加入 SYBR Primix Ex TaqⅡ（2×），10.0 μL；正向引物（0.4 μmol/L），0.8 μL；反向引物（0.4 μmol/L），0.8 μL；cDNA，2.0 μL；ddH2O，6.4 μL。将 EP 管放入离心机进行瞬时离心。PCR 反应程序：95 ℃ 预变性 30 s，95 ℃ 变性 5 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 个循环，4 ℃ 保存。
1.2.7 血清 KL-6 和 CXCL13 的测定
采集外周血标本，经 3 000 r/min 离心，取血清在–80 ℃ 冰箱保存，分别采用化学发光酶免疫检测法和酶联免疫吸附法检测血清涎液化糖链抗原-6（Krebs Von den Lungen-6，KL-6）和 B 淋巴细胞趋化因子 CXCL13（C-X-C motif chemokine ligand 13）水平[12-13]。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；计数资料以率和构成比表示，采用 Pearson χ2 检验，利用 Kaplan-Meier 法对生存函数进行估计，并通过对数秩检验进行比较。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 IPF 患者 MUC5B SNP rs35705950 及 TOLLIP SNP rs5743890、rs5743894 基因亚型的表达
纳入研究的 126 例 IPF 患者中，TOLLIP SNP rs5743890 和 rs5743894 均表达为具有两个主要等位基因 A 的纯合子（AA 型），占总人数的 100.0%，未检测到次要等位基因 G；116 例患者的 MUC5B SNP rs35705950 表达为具有两个主要等位基因 G 的纯合子（GG 型），占总人数的 92.1%，携带一个次要等位基因 T 的杂合子（GT 型）类型的患者仅有 10 例，占总人数的 7.9%，而且均为男性，未检测到携带两个次要等位基因 T 的纯合子类型（TT 型）。根据 MUC5B rs35705950 SNP 的不同，纳入研究的 IPF 患者分为 G 组（基因表型为 GG）和 T 组（基因表型为 GT）。
2.2 不同 MUC5B rs35705950 SNP 表达的 IPF 患者临床特征比较
两组年龄和未吸烟者的分布趋势无明显差异（P>0.05）。与 G 组相比，T 组患者肺功能 DLCO 和 TCL 的年下降水平、血清生物标志物 KL-6 和 CXCL13 的基线水平、影像学的网格状影和蜂窝病变病变年增加程度相对较低（P<0.05）。随访期间两组死亡率比较，G 组明显高于 T 组（χ2=29.069，P=0.02）。结果见表 1。
表1
不同 rs35705950 SNP 类型的 IPF 患者的临床特征比较（）
2.3 不同 MUC5B rs35705950 SNP 表达的 IPF 患者中位生存时间的比较
携带 MUC5B SNP rs35705950 次要等位基因（GT 型）杂合子的 IPF 患者的中位生存时间明显高于基因表型均为 GG 的纯合子 IPF 患者（45.3 个月，95% 可信区间 40.172～46.220 比 36.0 个月，95% 可信区间 35.659～43.341，P=0.02）。结果见图 1。
图1
不同 MUC5B rs35705950 SNP 的 IPF 患者 Kaplan-Meier 生存曲线比较
3 讨论
IPF 是原因不明并以普通型间质性肺炎为特征性病理改变的一种慢性炎症性间质性肺疾病。近年研究表明，IPF 是一种“二次打击”疾病，是基因调控与环境压力相结合的具有遗传倾向疾病[14]。GWAS 研究采用候选基因及病例对照研究已证实 IPF 与黏蛋白基因 MUC5B 启动子 rs35705950 及 TOLLIP 启动子 rs5743890、rs5743894 基因多态性相关，具有遗传易感倾向；基因变异参与宿主防御、细胞与细胞间的黏附和 DNA 修复，与 IPF 疾病进展风险相关[2]，这为研究 IPF 遗传易感及发病机制探索了一条新的途径。
美国华盛顿大学首次采用全基因组测序 1 例 61 岁临床确诊的 IPF 患者，发现在 MUC5B 启动子区未发现除 rs35705950 以外的其他相邻的序列，并发现 rs35705950 位于 MUC5B 启动子区干扰 DNA 酶与转录因子结合位点，上调 MUC5B 表达，表明 MUC5B 启动子区单核苷酸多态性可能是与 IPF 发病相关的重要遗传因素[15]。此外，Scholand 等[16]研究发现咳嗽的严重程度与 MUC5B rs35705950 启动子 G>T 多态性显著相关，提示了 IPF 表型遗传学异质性的可能机制。有研究纳入 438 例 IPF 患者，被检出携带 MUC5B 基因多态性的患者共 37%，且未校正 2 年累计死亡率低于未携带 MUC5B 多态性的患者[17]。TOLLIP 与 MUC5B 位于同一基因位点，rs5743890、rs5743894 位于非编码的 TOLLIP 调控区域内，rs5743890 作为保护性的次要等位基因可降低 IPF 患病的易感性，但与 IPF 患者的死亡率增加相关[18]。提示 MUC5B、TOLLIP 多态性在统计学上仍是生存的显著预测因素，对于患有亚临床或早期疾病的患者，在肺功能明显下降前，通过综合 MUC5B 及其他因素的预测能力来预测预后可能有所帮助。本研究结果提示中国 IPF 患者中，对预后相关的 MUC5B SNP rs35705950 及 TOLLIP SNP rs5743890 和 rs5743894 的基因多态性分布上绝大多数是由主要基因位点组成的纯合子类型；在 rs35705950 表达中，有少数 GT 杂合子分布，而以次要基因位点 T 为纯合子的 SNP 出现概率最小。而一项多中心临床研究中报道韩国 IPF 患者中 TOLLIP rs5743890 基因位点具有次要等位基因 G 的频率为 6%，在欧美白种 IPF 患者中报道分别接近 11% 和 29%[19]，提示黄种 IPF 患者 TOLLIP 和 MUC5B 的 SNP 携带次要基因位点的概率明显低于白种 IPF 患者。本研究中具有基因变异的人群均为男性，与吸烟史及年龄无相关性，提示这种基因变异的分布可能具有性别优势，但本研究为单中心研究，因此，中国 IPF 患者间的差异尚需要多中心大样本量的研究进一步证实。
许多肺功能测试的生理变量是用来评估 IPF 疾病严重程度和预测 IPF 生存的重要指标，其中与预后确切相关的指标有 FVC、TLC、DLCO[20]。研究表明 6～12 个月 FVC 和 DLCO 的动态变化与 IPF 的预后高度相关，且比大多数基线特征更能预测预后[21]。另有研究表明携带 rs35705950 SNP 主要和次要等位基因的 IPF 患者具有不同的纤维化影像模式，携带 T 等位基因（T 组）与 CT 影像和组织学 UIP 诊断一致的患者密切相关，GG 纯合子亚型具有更显著的磨玻璃影表现，T 组显示更为显著的胸膜下轴线分布的纤维化病变，G 组和 T 组对于蜂窝病变病变表现无差异[22]。提示 MUC5B 启动子多态性可识别 UIP/IPF 模式而区别其他原因导致的肺纤维化的模式。但既往研究尚未提及 HRCT 病变的动态变化与 MUC5B 启动子多态性的相关性，我们的研究表明，两个基因组患者的影像学的网格状和蜂窝病变病变进展及肺功能变化有差异。这一结论与 Best 等[23]的研究结论一致，提示基因型与预后存在相关性。
KL-6 在 IPF 中一直作为纤维化的非特异性标志物被研究，报道指出 IPF 患者血清 KL-6 水平比健康志愿者明显升高，作为一种黏液样糖蛋白表达于Ⅱ型肺泡细胞的细胞外表面和细支气管上皮细胞，并作为一种趋化因子促进了肺成纤维细胞的迁移、增殖和存活[24]。CXCL13 是引导 B 细胞到炎性病灶的关键中介因子，循环 CXCL13 水平在许多自身免疫综合征中有明显升高，CXCL13 的 B 细胞配体 C-X-C 趋化因子受体 5 具有介导淋巴细胞趋化性的作用，其出现与 IPF 具有临床相关性。此外，IPF 自身抗体直接促进纤维化增生，促进炎症反应或细胞毒性效应并与患者的临床表现和预后高度相关[25]。最近研究发现 IPF 发病机制中出现异常 B 细胞，提示 CXCL13 可能是一种与 IPF 病因相关，反映纤维化进程的生物标志物[26]。本研究结果显示 GT 基因型患者血清 KL-6、CXCL13 水平明显低于 GG 基因型患者，然而在 5 年的随访期间其随着病情波动起伏，变化缺少规律，因此其临床应用价值尚需进一步研究。
GWAS 研究显示基因型为 GT 和 TT 的 IPF 患者死亡风险明显低于基因型为 GG 的患者，MUC5B rs35705950 SNP 与 IPF 的患者死亡率减少有关[2]。Peljto 等[19]认为潜在的创伤修复等因素使 MUC5B 的基因突变，虽然可导致 IPF 发病风险增高但其危害程度较小，因而其携带者疾病发病率增高而死亡率相对较低。Jiang 等[27]研究同样证实了 MUC5B rs35705950 基因多态性增加 IPF 的易感性，但却发现携带次要基因组的 IPF 患者肺功能 FVC 和 DLCO 有明显下降，其 5 年生存率也有所降低，携带不同 MUC5B rs35705950 基因多态性的 IPF 患者预后差异也符合疾病异质性特点。我们的研究表明 GT 基因型较 GG 基因型的 IPF 患者具有更长的中位生存期，死亡人数明显低于 GG 组。由于临床过程复杂，机制不清，MUC5B 启动子的基因多态性可能具有特异的病理学过程，包括具有更高的疾病易感性风险和不同的生存状态，基因参与程度亦有个体性和复杂性，因而识别基因多态性对 IPF 预后的相关性有助于制定患者精准化治疗策略。
综上所述，中国 IPF 患者存在基因多态性现象；MUC5B rs35705950 和 TOLLIP rs5743890、rs5743894 基因亚型在中国 IPF 患者中突变率较低，可能预示中国 IPF 患者死亡率高且靶向药物治疗效果不佳。然而，本研究系单中心研究，且基因多态性具有人种差异，其与 IPF 发病相关的遗传风险仍需多中心及扩大病例数进一步证实，异常调节的分子机制仍有待建立，基因多态性对中国 IPF 患者的相关性和临床价值研究仍需一步明确。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
