引用本文： 王微, 张荣丽, 凌继祖, 余勤. 内质网应激导致间歇低氧模型大鼠肾脏损伤的机制及洛沙坦的干预作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2020, 19(6): 592-597. doi: 10.7507/1671-6205.201901009 复制
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是临床最常见的一种睡眠呼吸障碍性疾病，其特征性的病理生理变化是睡眠过程中反复发生的间歇低氧（intermittent hypoxia，IH），导致体内低氧血症和（或）高碳酸血症，进而引起多器官功能障碍[1-2]。先前的动物实验表明，IH 可通过激活内质网应激介导大鼠肾小管上皮细胞凋亡，使肾脏的超微结构发生改变，进而导致肾脏功能损伤[3-4]，但涉及的相关通路及血管紧张素 Ⅱ 受体拮抗剂（angiotensin Ⅱ receptor blocker，ARB）类药物洛沙坦的干预作用尚不明确。因此，本研究拟建立 IH 模型，腹腔注射洛沙坦给予干预，观察大鼠肾功能血清学指标、肾脏组织形态学及超微结构改变、肾小管上皮细胞凋亡指数，以及肾脏 Caspase-12、JNK、CHOP mRNA 的表达水平，以探讨 IH 通过内质网应激导致肾脏损伤的分子机制以及 ARB 类药物洛沙坦的干预作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及材料
实验动物：60 只 8～10 周龄 SPF 级健康雄性 SD 大鼠，平均体重为（187.3±11.3）g。实验动物及饲料、垫料由兰州大学实验动物中心提供。实验前将动物置于自然光照、安静环境、温度 20～25 ℃、湿度 50%～60%、日温差≤4 ℃ 的条件下适应性饲养 1 周。本实验设计符合兰州大学第一医院实验动物伦理学标准。
主要实验材料：洛沙坦粉剂（大连美仑生物技术有限公司 MB1578）；细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；反转录试剂盒及逆转录–聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）试剂盒（大连 TaKaRa 公司）；医用氧气、高纯度氮气（甘肃省兰州方圆建化有限责任公司）；CY-12C 测氧仪（浙江省建德市梅城电化学分析仪器厂）；全自动生化分析仪（日立 7170A）；TKY-BMB 型石蜡包埋机（湖北泰康医疗设备有限公司）；光学显微镜（日本 Olympus 公司）；JEM-1230 透射电镜（日本 JEOL 电子科技公司）；Light Cycler480 全自动实时定量 PCR 系统（罗氏公司）。
1.2 方法
1.2.1 模型的建立与动物分组
将 60 只大鼠按随机数字表法分为 4 组，每组 15 只。分别为 A 组（空白对照组）：置于常氧环境；B 组（IH 组）：置于间歇低氧舱内；C 组（IH+洛沙坦组）：每日于实验开始前 30 min 腹腔注射洛沙坦液 30 mg/kg，后置于间歇低氧舱内；D 组（IH+生理盐水组）：每日腹腔注射同剂量生理盐水作平衡对照，后置于间歇低氧舱内。
参照文献[5]将洛沙坦粉剂溶于磷酸盐缓冲液后，于每日实验前 30 min 测量大鼠体重后以 30 mg/kg 进行腹腔注射。参照文献[6-7]设计间歇低氧模拟舱，设定程序为 120 s 1 次循环，包括 40 s 的低氧期（纯氮气 30 s+静息状态 10 s）和 80 s 的复氧期（纯氧气 20 s+压缩空气 60 s）。应用测氧仪实时监测舱内氧浓度，使低氧期舱内氧浓度维持在 6%～7%，并在复氧期迅速升至 21%。A 组置于普通饲养舱内间歇输入压缩空气，输入时间及流量同间歇低氧组，氧浓度为 21%。每日造模 8 h（9∶00 至 17∶00），连续 6 周。造模期间室内温度、湿度适宜，饮水自由，无实验动物死亡。
1.2.2 标本处理
实验 6 周末将禁食 12 h 的大鼠常规称重，用 10% 水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射进行麻醉，经腹主动脉采血，离心后送至兰州大学第一医院检验科，应用全自动生化分析仪检测肾功能。迅速解剖分离大鼠肾脏，左侧肾脏分为两份，一份置于多聚甲醛中固定，用于病理苏木精–伊红染色及 TUNEL 检测；一份置于戊二醛中固定，用于透射电镜检测。右侧肾脏保存于–80 ℃ 冰箱用于 RT-PCR 检测。
1.2.3 TUNEL 法检测肾脏细胞凋亡
实验操作参照 TUNEL 试剂盒说明书，行二氨基联苯胺染色后凋亡的细胞其细胞核呈棕黄色，且大小不一，形态各异，正常细胞的细胞核被苏木素复染成蓝紫色。光镜下（×400 倍）每张切片随机选取 5 个不重叠视野，应用 ImagePro Plus6.0 图像分析系统计数各类细胞数，取其平均值。凋亡指数（apoptotic index，%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.2.4 RT-PCR 检测大鼠肾脏 ERS 通路中相关 mRNA
Trizol 法提取大鼠肾脏总 RNA，逆转录试剂盒合成 cDNA。β-actin、Caspase-12、CHOP 引物由大连 TaKaRa 公司合成，JNK 引物由兰州裕博生物科技有限公司合成。β-actin 上游引物：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物：5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’；caspase-12 上游引物：5’-CAATTCCGACAAACAGCTGAGTTTA-3’，下游引物：5’-CATGGGCCACTCCAACATTTAC-3’；JNK 上游引物：5’-ACTGACAGGACAGGACGAGCAGTA-3’，下游引物：5’-GTGTGGCAGAAACTGACCAATGA-3’；CHOP 上游引物：5’-TGGAAGCCTGGTATGAGGATCTG-3’，下游引物：5’-GAGGTGCTTGTGACCTCTGCTG-3’。扩增条件如下：预变性 95 ℃，30 s，1 个循环；PCR 反应 95 ℃，5 s，40 个循环；融解曲线分析 60 ℃，1 min，1 个循环。每个样本做 3 个复孔，取其平均值，结果经内参 β-actin 均一化处理后，以正常对照组目的基因表达量为参照因子。数据采用 2－ΔΔCt法进行结果分析。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（
±s）表示。各组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），若方差齐，采用最小显著差异法；若方差不齐，采用 Dunnett’s T3 法。细胞凋亡与肾功能损害的相关性用 Pearson 相关性分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠血清肾功能指标
B、D 组大鼠血清尿素氮水平显著高于 A 组（均 P<0.01），C 组血清尿素氮水平较 B、D 组降低（均 P<0.05）；B、D 组大鼠血清肌酐水平均高于 A 组（P<0.01；P<0.05），B、C、D 组间血清肌酐水平差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表 1。
表1
各组大鼠肾功能血清学指标比较（n=6，
）
2.2 大鼠肾脏病理学变化
在光镜下观察，A 组大鼠肾脏组织形态均正常，未见明显病理损害。B 组及 D 组大鼠肾脏组织可见多数肾小管上皮细胞高度水肿，呈气球样变，胞质淡染，结构紊乱，管腔狭窄，以近曲小管为著，肾小球毛细血管内可见大量红细胞。C 组大鼠肾脏组织可见部分近曲小管上皮细胞轻度水肿，管腔无明显狭窄，肾小球毛细血管内可见红细胞，较 B 组及 D 组量少。结果见图 1。
图1
各组大鼠肾脏病理染色像（苏木精–伊红×400）
a. A 组大鼠肾脏组织形态均正常；b 和 d. B 组和 D 组大鼠肾脏组织可见多数肾小管上皮细胞高度水肿，呈气球样变，管腔狭窄；c. C 组大鼠肾脏组织可见部分近曲小管上皮细胞轻度水肿，管腔无明显狭窄
2.3 大鼠肾脏超微结构变化
在透射电镜下观察大鼠肾脏组织超微结构变化，发现损伤以近曲肾小管上皮细胞为主。A 组：近曲肾小管上皮细胞刷状缘整齐、致密，细胞核呈椭圆形，细胞器无明显变化。B、D 组：肾小球系膜增生，足突局部融合，肾小管上皮细胞游离面微绒毛稀疏、大量脱落，肾小管上皮细胞内出现核固缩、异染色质增多，细胞器肿胀、溶解。C 组：肾小球系膜轻度增生，肾小管上皮细胞游离面微绒毛出现倒伏、稀疏，肾小管上皮细胞呈椭圆形，内可见少量细胞核异型，细胞器轻度肿胀。结果见图 2。
图2
各组大鼠肾脏透射电镜像（×10 000）
a. A 组近曲肾小管上皮细胞刷状缘整齐、致密，细胞核呈椭圆形，细胞器无明显变化；b 和 d. B 组和 D 组肾小管上皮细胞游离面微绒毛稀疏、脱落，细胞内出现核固缩、异染色质增多，细胞器溶解；c. C 组肾小管上皮细胞游离面微绒毛倒伏、稀疏，细胞内可见少量细胞核异型，细胞器轻度肿胀
2.4 大鼠肾小管上皮细胞凋亡
TUNEL 法检测结果显示，A、B、C、D 组肾小管上皮细胞凋亡指数分别为 1.915±0.750、5.997±0.800、3.773±0.709、5.492±0.492。与 A 组比较，B、D 组肾小管上皮细胞凋亡指数显著升高（均 P<0.01）；与 C 组比较，B、D 组肾小管上皮细胞凋亡指数显著升高（均 P<0.01）。结果见图 3。
图3
大鼠肾脏 TUNEL 细胞凋亡像（×400）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；箭头所示为部分凋亡细胞
2.5 细胞凋亡与肾功能损害的相关性
Pearson 相关性分析显示各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数与血清尿素氮呈显著正相关（r=0.831，P<0.01），与血清肌酐亦呈正相关（r=0.581，P<0.01）。
2.6 大鼠肾脏内质网应激凋亡相关的 mRNA 表达
RT-PCR 检测结果显示，与 A 组相比，B、D 组大鼠肾脏组织 Caspase-12、JNK、CHOP mRNA 表达明显上调（均 P<0.01）。给予洛沙坦干预后，C 组 Caspase-12 mRNA 表达水平较 B、D 组下调（P<0.01；P<0.05）；JNK mRNA 表达水平较 B、D 组差异无统计学意义（P>0.05）；CHOP mRNA 表达水平较 B、D 组显著下调（均 P<0.01）。结果见表 2。
表2
大鼠内质网应激通路相关 mRNA 水平（n=6，
）
3 讨论
OSAHS 是以 IH 为主要病理过程，以多系统损害为特点的睡眠呼吸障碍性疾病[8-10]。肾脏是机体内高流量高灌注的脏器，对缺氧极其敏感。OSAHS 所致 IH 与普通慢性持续性缺氧不同，其缺氧是短暂高频间歇性的，存在循环复氧/再氧化，过程类似于缺血再灌注，可导致活性氧和氧化应激产物增多，增加交感神经活动，并伴有内皮功能障碍，与慢性持续性缺氧相比较可产生更严重的影响[9]。IH 可通过激活交感神经系统[11]和肾素–血管紧张素–醛固酮系统[12]、升高血压[13]、产生氧化应激[14]、促进炎症[15]、诱导内皮细胞功能障碍[16]和肾脏细胞凋亡[3-4]等导致肾脏损伤。本研究通过建立公认的 IH 动物模型进一步探究 OSAHS 所致肾脏损伤的潜在机制[17]。实验结果显示 IH 暴露 6 周的大鼠肾功能血清学指标及组织形态学表现较空白对照组均出现了明显的损害，肾小管上皮细胞凋亡指数升高，且 Pearson 相关分析显示凋亡指数与血清肌酐及尿素氮水平呈显著正相关，提示 IH 可能通过诱导肾小管上皮细胞凋亡导致肾功能损伤。目前发现的诱导细胞凋亡的途径主要有三种：内源性途径、外源性途径和内质网应激途径。内质网应激是近年来新发现的细胞凋亡途径，多见于外源性刺激导致内质网的蛋白折叠功能障碍，打破内质网稳态，最终导致内质网应激凋亡通路的激活[18]。内质网应激凋亡途径主要包含三条凋亡通路，即 Caspase-12 的激活、JNK 磷酸化和 CHOP 的合成。其中，CHOP 和 JNK 是内质网应激与细胞凋亡之间相互联系的重要中间信号分子，Caspase-12 是细胞凋亡命令的最终执行者[19]。本研究结果显示，上述三条促凋亡通路中的标志性信号分子 Caspase-12、JNK、CHOP 的 mRNA 在 IH 暴露下均出现了明显上调，提示 IH 暴露下的大鼠肾脏组织中的内质网应激凋亡通路被激活，IH 可能通过激活上述三条内质网应激凋亡通路导致肾脏细胞凋亡，进而损伤肾功能。由于光镜下观察肾脏的病理改变主要表现在肾小管上皮细胞，电镜下肾小管上皮细胞损失极为明显，可见核固缩、凋亡小体，因此推测 IH 所致肾脏损伤主要是肾小管上皮细胞的损伤；且 TUNEL 法检测肾脏细胞凋亡可见黄褐色的凋亡细胞主要分布在肾小管区，考虑 IH 主要引起肾小管上皮细胞凋亡，对肾小球上皮细胞影响较小。因此，我们认为 IH 可通过内质网应激导致肾小管上皮细胞损伤，进而出现肾脏结构和功能学的异常。
IH 可导致肾素–血管紧张素系统的激活[20]，是慢性肾脏损伤的主要机制之一。其产物血管紧张素Ⅱ的激活可能引起内质网功能失调，进而导致内质网应激介导的细胞凋亡，从而引起组织损伤[21-22]。但阻断肾素–血管紧张素系统是否可通过抑制内质网应激而减轻 IH 的损伤作用，尚不得而知。本实验应用临床常见的 ARB 类药物洛沙坦进行干预，旨在抑制肾素–血管紧张素系统。结果显示，经 ARB 类药物洛沙坦干预后，IH 大鼠血清尿素氮水平下降，肾脏组织病理及超微结构损伤减轻，肾小管上皮细胞凋亡指数下降，结合肾功能血清学指标与凋亡指数的相关性分析，提示洛沙坦可通过抑制肾小管上皮细胞凋亡保护肾功能。RT-PCR 结果显示，经洛沙坦干预后肾脏 Caspase-12、CHOP mRNA 的表达降低，说明洛沙坦可能通过下调内质网应激凋亡通路中 Caspase-12、CHOP mRNA 的表达而减轻 IH 对大鼠肾脏的损伤作用。
综上所述，IH 可通过激活内质网应激介导的 Caspase-12、JNK 及 CHOP 三条凋亡通路导致大鼠肾脏组织功能的损伤及形态学的变化，而 ARB 类药物洛沙坦可能通过抑制内质网应激介导的 Caspase-12 和 CHOP 凋亡通路起到保护作用。这可能为今后 ARB 类药物治疗 OSAHS 所致肾脏损伤提供一个新的理论依据。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是临床最常见的一种睡眠呼吸障碍性疾病，其特征性的病理生理变化是睡眠过程中反复发生的间歇低氧（intermittent hypoxia，IH），导致体内低氧血症和（或）高碳酸血症，进而引起多器官功能障碍[1-2]。先前的动物实验表明，IH 可通过激活内质网应激介导大鼠肾小管上皮细胞凋亡，使肾脏的超微结构发生改变，进而导致肾脏功能损伤[3-4]，但涉及的相关通路及血管紧张素 Ⅱ 受体拮抗剂（angiotensin Ⅱ receptor blocker，ARB）类药物洛沙坦的干预作用尚不明确。因此，本研究拟建立 IH 模型，腹腔注射洛沙坦给予干预，观察大鼠肾功能血清学指标、肾脏组织形态学及超微结构改变、肾小管上皮细胞凋亡指数，以及肾脏 Caspase-12、JNK、CHOP mRNA 的表达水平，以探讨 IH 通过内质网应激导致肾脏损伤的分子机制以及 ARB 类药物洛沙坦的干预作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及材料
实验动物：60 只 8～10 周龄 SPF 级健康雄性 SD 大鼠，平均体重为（187.3±11.3）g。实验动物及饲料、垫料由兰州大学实验动物中心提供。实验前将动物置于自然光照、安静环境、温度 20～25 ℃、湿度 50%～60%、日温差≤4 ℃ 的条件下适应性饲养 1 周。本实验设计符合兰州大学第一医院实验动物伦理学标准。
主要实验材料：洛沙坦粉剂（大连美仑生物技术有限公司 MB1578）；细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；反转录试剂盒及逆转录–聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）试剂盒（大连 TaKaRa 公司）；医用氧气、高纯度氮气（甘肃省兰州方圆建化有限责任公司）；CY-12C 测氧仪（浙江省建德市梅城电化学分析仪器厂）；全自动生化分析仪（日立 7170A）；TKY-BMB 型石蜡包埋机（湖北泰康医疗设备有限公司）；光学显微镜（日本 Olympus 公司）；JEM-1230 透射电镜（日本 JEOL 电子科技公司）；Light Cycler480 全自动实时定量 PCR 系统（罗氏公司）。
1.2 方法
1.2.1 模型的建立与动物分组
将 60 只大鼠按随机数字表法分为 4 组，每组 15 只。分别为 A 组（空白对照组）：置于常氧环境；B 组（IH 组）：置于间歇低氧舱内；C 组（IH+洛沙坦组）：每日于实验开始前 30 min 腹腔注射洛沙坦液 30 mg/kg，后置于间歇低氧舱内；D 组（IH+生理盐水组）：每日腹腔注射同剂量生理盐水作平衡对照，后置于间歇低氧舱内。
参照文献[5]将洛沙坦粉剂溶于磷酸盐缓冲液后，于每日实验前 30 min 测量大鼠体重后以 30 mg/kg 进行腹腔注射。参照文献[6-7]设计间歇低氧模拟舱，设定程序为 120 s 1 次循环，包括 40 s 的低氧期（纯氮气 30 s+静息状态 10 s）和 80 s 的复氧期（纯氧气 20 s+压缩空气 60 s）。应用测氧仪实时监测舱内氧浓度，使低氧期舱内氧浓度维持在 6%～7%，并在复氧期迅速升至 21%。A 组置于普通饲养舱内间歇输入压缩空气，输入时间及流量同间歇低氧组，氧浓度为 21%。每日造模 8 h（9∶00 至 17∶00），连续 6 周。造模期间室内温度、湿度适宜，饮水自由，无实验动物死亡。
1.2.2 标本处理
实验 6 周末将禁食 12 h 的大鼠常规称重，用 10% 水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射进行麻醉，经腹主动脉采血，离心后送至兰州大学第一医院检验科，应用全自动生化分析仪检测肾功能。迅速解剖分离大鼠肾脏，左侧肾脏分为两份，一份置于多聚甲醛中固定，用于病理苏木精–伊红染色及 TUNEL 检测；一份置于戊二醛中固定，用于透射电镜检测。右侧肾脏保存于–80 ℃ 冰箱用于 RT-PCR 检测。
1.2.3 TUNEL 法检测肾脏细胞凋亡
实验操作参照 TUNEL 试剂盒说明书，行二氨基联苯胺染色后凋亡的细胞其细胞核呈棕黄色，且大小不一，形态各异，正常细胞的细胞核被苏木素复染成蓝紫色。光镜下（×400 倍）每张切片随机选取 5 个不重叠视野，应用 ImagePro Plus6.0 图像分析系统计数各类细胞数，取其平均值。凋亡指数（apoptotic index，%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.2.4 RT-PCR 检测大鼠肾脏 ERS 通路中相关 mRNA
Trizol 法提取大鼠肾脏总 RNA，逆转录试剂盒合成 cDNA。β-actin、Caspase-12、CHOP 引物由大连 TaKaRa 公司合成，JNK 引物由兰州裕博生物科技有限公司合成。β-actin 上游引物：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物：5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’；caspase-12 上游引物：5’-CAATTCCGACAAACAGCTGAGTTTA-3’，下游引物：5’-CATGGGCCACTCCAACATTTAC-3’；JNK 上游引物：5’-ACTGACAGGACAGGACGAGCAGTA-3’，下游引物：5’-GTGTGGCAGAAACTGACCAATGA-3’；CHOP 上游引物：5’-TGGAAGCCTGGTATGAGGATCTG-3’，下游引物：5’-GAGGTGCTTGTGACCTCTGCTG-3’。扩增条件如下：预变性 95 ℃，30 s，1 个循环；PCR 反应 95 ℃，5 s，40 个循环；融解曲线分析 60 ℃，1 min，1 个循环。每个样本做 3 个复孔，取其平均值，结果经内参 β-actin 均一化处理后，以正常对照组目的基因表达量为参照因子。数据采用 2－ΔΔCt法进行结果分析。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示。各组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），若方差齐，采用最小显著差异法；若方差不齐，采用 Dunnett’s T3 法。细胞凋亡与肾功能损害的相关性用 Pearson 相关性分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠血清肾功能指标
B、D 组大鼠血清尿素氮水平显著高于 A 组（均 P<0.01），C 组血清尿素氮水平较 B、D 组降低（均 P<0.05）；B、D 组大鼠血清肌酐水平均高于 A 组（P<0.01；P<0.05），B、C、D 组间血清肌酐水平差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表 1。
表1
各组大鼠肾功能血清学指标比较（n=6，）
2.2 大鼠肾脏病理学变化
在光镜下观察，A 组大鼠肾脏组织形态均正常，未见明显病理损害。B 组及 D 组大鼠肾脏组织可见多数肾小管上皮细胞高度水肿，呈气球样变，胞质淡染，结构紊乱，管腔狭窄，以近曲小管为著，肾小球毛细血管内可见大量红细胞。C 组大鼠肾脏组织可见部分近曲小管上皮细胞轻度水肿，管腔无明显狭窄，肾小球毛细血管内可见红细胞，较 B 组及 D 组量少。结果见图 1。
图1
各组大鼠肾脏病理染色像（苏木精–伊红×400）
a. A 组大鼠肾脏组织形态均正常；b 和 d. B 组和 D 组大鼠肾脏组织可见多数肾小管上皮细胞高度水肿，呈气球样变，管腔狭窄；c. C 组大鼠肾脏组织可见部分近曲小管上皮细胞轻度水肿，管腔无明显狭窄
2.3 大鼠肾脏超微结构变化
在透射电镜下观察大鼠肾脏组织超微结构变化，发现损伤以近曲肾小管上皮细胞为主。A 组：近曲肾小管上皮细胞刷状缘整齐、致密，细胞核呈椭圆形，细胞器无明显变化。B、D 组：肾小球系膜增生，足突局部融合，肾小管上皮细胞游离面微绒毛稀疏、大量脱落，肾小管上皮细胞内出现核固缩、异染色质增多，细胞器肿胀、溶解。C 组：肾小球系膜轻度增生，肾小管上皮细胞游离面微绒毛出现倒伏、稀疏，肾小管上皮细胞呈椭圆形，内可见少量细胞核异型，细胞器轻度肿胀。结果见图 2。
图2
各组大鼠肾脏透射电镜像（×10 000）
a. A 组近曲肾小管上皮细胞刷状缘整齐、致密，细胞核呈椭圆形，细胞器无明显变化；b 和 d. B 组和 D 组肾小管上皮细胞游离面微绒毛稀疏、脱落，细胞内出现核固缩、异染色质增多，细胞器溶解；c. C 组肾小管上皮细胞游离面微绒毛倒伏、稀疏，细胞内可见少量细胞核异型，细胞器轻度肿胀
2.4 大鼠肾小管上皮细胞凋亡
TUNEL 法检测结果显示，A、B、C、D 组肾小管上皮细胞凋亡指数分别为 1.915±0.750、5.997±0.800、3.773±0.709、5.492±0.492。与 A 组比较，B、D 组肾小管上皮细胞凋亡指数显著升高（均 P<0.01）；与 C 组比较，B、D 组肾小管上皮细胞凋亡指数显著升高（均 P<0.01）。结果见图 3。
图3
大鼠肾脏 TUNEL 细胞凋亡像（×400）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；箭头所示为部分凋亡细胞
2.5 细胞凋亡与肾功能损害的相关性
Pearson 相关性分析显示各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数与血清尿素氮呈显著正相关（r=0.831，P<0.01），与血清肌酐亦呈正相关（r=0.581，P<0.01）。
2.6 大鼠肾脏内质网应激凋亡相关的 mRNA 表达
RT-PCR 检测结果显示，与 A 组相比，B、D 组大鼠肾脏组织 Caspase-12、JNK、CHOP mRNA 表达明显上调（均 P<0.01）。给予洛沙坦干预后，C 组 Caspase-12 mRNA 表达水平较 B、D 组下调（P<0.01；P<0.05）；JNK mRNA 表达水平较 B、D 组差异无统计学意义（P>0.05）；CHOP mRNA 表达水平较 B、D 组显著下调（均 P<0.01）。结果见表 2。
表2
大鼠内质网应激通路相关 mRNA 水平（n=6，）
3 讨论
OSAHS 是以 IH 为主要病理过程，以多系统损害为特点的睡眠呼吸障碍性疾病[8-10]。肾脏是机体内高流量高灌注的脏器，对缺氧极其敏感。OSAHS 所致 IH 与普通慢性持续性缺氧不同，其缺氧是短暂高频间歇性的，存在循环复氧/再氧化，过程类似于缺血再灌注，可导致活性氧和氧化应激产物增多，增加交感神经活动，并伴有内皮功能障碍，与慢性持续性缺氧相比较可产生更严重的影响[9]。IH 可通过激活交感神经系统[11]和肾素–血管紧张素–醛固酮系统[12]、升高血压[13]、产生氧化应激[14]、促进炎症[15]、诱导内皮细胞功能障碍[16]和肾脏细胞凋亡[3-4]等导致肾脏损伤。本研究通过建立公认的 IH 动物模型进一步探究 OSAHS 所致肾脏损伤的潜在机制[17]。实验结果显示 IH 暴露 6 周的大鼠肾功能血清学指标及组织形态学表现较空白对照组均出现了明显的损害，肾小管上皮细胞凋亡指数升高，且 Pearson 相关分析显示凋亡指数与血清肌酐及尿素氮水平呈显著正相关，提示 IH 可能通过诱导肾小管上皮细胞凋亡导致肾功能损伤。目前发现的诱导细胞凋亡的途径主要有三种：内源性途径、外源性途径和内质网应激途径。内质网应激是近年来新发现的细胞凋亡途径，多见于外源性刺激导致内质网的蛋白折叠功能障碍，打破内质网稳态，最终导致内质网应激凋亡通路的激活[18]。内质网应激凋亡途径主要包含三条凋亡通路，即 Caspase-12 的激活、JNK 磷酸化和 CHOP 的合成。其中，CHOP 和 JNK 是内质网应激与细胞凋亡之间相互联系的重要中间信号分子，Caspase-12 是细胞凋亡命令的最终执行者[19]。本研究结果显示，上述三条促凋亡通路中的标志性信号分子 Caspase-12、JNK、CHOP 的 mRNA 在 IH 暴露下均出现了明显上调，提示 IH 暴露下的大鼠肾脏组织中的内质网应激凋亡通路被激活，IH 可能通过激活上述三条内质网应激凋亡通路导致肾脏细胞凋亡，进而损伤肾功能。由于光镜下观察肾脏的病理改变主要表现在肾小管上皮细胞，电镜下肾小管上皮细胞损失极为明显，可见核固缩、凋亡小体，因此推测 IH 所致肾脏损伤主要是肾小管上皮细胞的损伤；且 TUNEL 法检测肾脏细胞凋亡可见黄褐色的凋亡细胞主要分布在肾小管区，考虑 IH 主要引起肾小管上皮细胞凋亡，对肾小球上皮细胞影响较小。因此，我们认为 IH 可通过内质网应激导致肾小管上皮细胞损伤，进而出现肾脏结构和功能学的异常。
IH 可导致肾素–血管紧张素系统的激活[20]，是慢性肾脏损伤的主要机制之一。其产物血管紧张素Ⅱ的激活可能引起内质网功能失调，进而导致内质网应激介导的细胞凋亡，从而引起组织损伤[21-22]。但阻断肾素–血管紧张素系统是否可通过抑制内质网应激而减轻 IH 的损伤作用，尚不得而知。本实验应用临床常见的 ARB 类药物洛沙坦进行干预，旨在抑制肾素–血管紧张素系统。结果显示，经 ARB 类药物洛沙坦干预后，IH 大鼠血清尿素氮水平下降，肾脏组织病理及超微结构损伤减轻，肾小管上皮细胞凋亡指数下降，结合肾功能血清学指标与凋亡指数的相关性分析，提示洛沙坦可通过抑制肾小管上皮细胞凋亡保护肾功能。RT-PCR 结果显示，经洛沙坦干预后肾脏 Caspase-12、CHOP mRNA 的表达降低，说明洛沙坦可能通过下调内质网应激凋亡通路中 Caspase-12、CHOP mRNA 的表达而减轻 IH 对大鼠肾脏的损伤作用。
综上所述，IH 可通过激活内质网应激介导的 Caspase-12、JNK 及 CHOP 三条凋亡通路导致大鼠肾脏组织功能的损伤及形态学的变化，而 ARB 类药物洛沙坦可能通过抑制内质网应激介导的 Caspase-12 和 CHOP 凋亡通路起到保护作用。这可能为今后 ARB 类药物治疗 OSAHS 所致肾脏损伤提供一个新的理论依据。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
