引用本文： 陈思, 张伟, 宁允叶, 董宇超, 李强, 白冲. 尼龙刷刮擦机械损伤建立大鼠良性气管狭窄模型的研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2019, 18(3): 265-270. doi: 10.7507/1671-6205.201903073 复制
良性中央气道狭窄是呼吸系统的常见疾病。近年来，随着危重症医学的进步与呼吸支持技术的发展，以及肺移植等手术的开展和普及，良性气道狭窄的发生率呈增高趋势。而良性气道狭窄的治疗手段及疗效均有限，再狭窄率高且需要定期气管镜随访，因此仍是介入呼吸病学领域的一项挑战[1]。建立一种简易、可靠的良性气道狭窄动物模型对于研究发病机制、治疗干预以及评估疗效预后等尤为重要。由于操作便利、发育迅速、繁殖力强、价格低廉等优势，并且在大多数实验室中都很容易获得，基于鼠的动物模型一直是医学研究领域的“主力”。然而，受到动物大小和气道口径等因素的限制，使得该动物未能在良性气道狭窄研究领域被广泛应用。也有一些研究人员坚持利用小鼠模型，以非原位的方法研究气管的生物学功能[2]。我们建立了一种新型的基于大鼠的良性气管狭窄原位模型，该模型模拟临床上常见的继发于插管或气管切开等的黏膜机械损伤，可作为良性气道狭窄致病机制研究和新药疗效探索的可靠实验载体。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
本研究通过第二军医大学长海医院动物伦理委员会同意，所有操作符合实验动物管理条例。实验选用 Sprague Dawley 大鼠 35 只（长海医院实验中心动物房提供），雄性，220～300 g。实验前适应性饲养 1 周，观察动物有无异常表现。按随机数字法将 20 只 SD 大鼠分为模型组（10 只）和伪手术对照组（10 只），观察生存情况，测算并比较狭窄度；另外 15 只大鼠进行实验造模，于造模后不同时间点（第 0、2、4、6、8 d）获取气管组织观察病理改变。
1.2 仪器与设备
3% 戊巴比妥钠溶液（上海试剂二厂）、无菌注射器（美国 BD 公司）、小动物手术器械（德国 Roboz 公司）、3M VetbondTM组织黏胶（美国 3M 公司）、5% 碘伏棉球、75% 的酒精棉球、灭菌干棉球若干（长海医院呼吸科提供）、防护手套、脱毛膏、1.5 mm 直径硬质尼龙刷、新鲜配制的 4% 多聚甲醛溶液、包埋盒、石蜡、二甲苯、100% 酒精、双蒸水、水浴锅、切片机、载玻片、盖玻片、中性树胶、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒、Masson 染色试剂盒等。
1.3 方法
1.3.1 实验方法
实验前所有动物禁食 6～8 h，3% 戊巴比妥钠（0.1～0.2 ml/100 g）经腹腔注射麻醉。将 SD 大鼠仰卧固定，颈前区用脱毛膏被毛，以 0.5% 碘伏消毒，作长约 3 cm 的颈前区正中切口，钝性分离颌下腺及气管旁肌肉，左右两侧分别以弯头止血钳牵拉气管旁肌肉以暴露喉和气管，在距环状软骨 0.4 cm 处横向切开气管，切开 2/3 周径。对照组进行以上操作后即进行后续缝合处理；模型组从切口处向远端伸入 1.5 mm 直径硬质尼龙刷（图 1a），来回刮刷 10 次以刮除黏膜，摩擦区域长约 1 cm（图 1b），若操作过程出现气管内出血，可用镊子钳取少量止血棉球深入管腔压迫止血。两组大鼠均用 6-0 带线缝针进行气管间断缝合。松开止血钳，将气管旁肌肉归位，用 4-0 缝线逐层缝合肌肉、颌下腺、皮下组织。最后，用组织胶（3M VetbondTM）粘合皮肤。所有动物术后置于加热毯，待麻醉苏醒后放归饲养环境。
图1
造模用尼龙刷和刮擦示意图
a. 专用 1.5 mm 直径硬质尼龙刷；b. 手术操作中刮擦示意图
1.3.2 观察指标
（1）一般情况：术后每天观察实验大鼠有无气短、喘息、呼吸困难等症状，以及精神状况、饮食情况、活动情况，记录大鼠造模后的生存时间。
（2）病理学改变：动物自然死亡或处死后，取造模段气管组织横切标本进行病例分析，了解黏膜损伤及肉芽组织增生情况。上述造模与对照组 SD 大鼠自然死亡或 CO2 处死箱安乐死后，在颈前区正中作一长约 5 cm 的切口，钝性分离颌下腺及气管旁肌肉，暴露喉和气管，用眼科剪截取环状软骨下 0.4～1.4 cm 的气管段（位置相当于模型组的造模段气管），将气管组织沿着气管软骨环截为若干长约 0.3 cm 的气管段，放入预先标记好的包埋盒，置于 4% 多聚甲醛溶液。取材要迅速，避免组织在空气中暴露过长时间。夹取组织时，避免将镊子伸入气管管腔，破坏管腔内结构。组织固定后进行包埋、切片、HE 染色及 Masson 染色，最后显微镜下观察。
（3）狭窄度测算与比较：参考 Nakagishi 等[3]的方法，狭窄度的计算公式为（1-s/S）×100%。其中，s 为发生狭窄时候气管通气腔的面积，s=π[（d1+d2）/2]2，d1 为通气腔内最长径，d2 为通气腔内最短径；S 为软骨环围成的环形面积，S=π[（D1+D2）/2]2，D1 为软骨围成环的最长径，D2 为最短径。
1.4 统计学方法
应用 Graphpad Prism 7 软件进行统计分析和制图。所有计量资料均以均数±标准差（
±s）表示，组间比较采用 One way ANOVA 分析，P<0.05 为差异有统计学意义。生存曲线的比较用 Log-rank 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验大鼠的基本情况
伪手术组 SD 大鼠（10 只）术后精神状态、活动状态良好；饮水、饮食正常；未观察到气促、呼吸困难等症状；术后第 8 d 存活率为 100%。狭窄模型组（10 只）术后精神萎靡，活动度降低，饮水、饮食均减少；1 只大鼠于术后 2 d 死亡，死因为黏液栓样物质阻塞气道；术后第 3 d 可见该组动物出现气促、憋喘症状；第 4 d 见实验动物蜗居笼具角落，可见呼吸幅度显著增加、呼吸困难、可闻及喘鸣音；术后第 6 d 死亡率 50%，第 8 d 死亡率 100%（图 2）；获取气管组织时肉眼可见管腔内新生肉芽组织及黏液栓样物质。经 Log-rank 检验，两组生存情况差异有统计学意义（P=0.000 1）。
图2
伪手术组及狭窄模型组的生存情况比较
2.2 狭窄度
伪手术组的狭窄度为（6.12±1.78）%，狭窄模型组的狭窄度为（60.28±12.56）%，两组之间的狭窄度差异有统计学意义（P<0.000 1），结果详见图 3。
图3
伪手术组与狭窄模型组的气管狭窄度比较
2.3 病理改变
2.3.1 伪手术组及狭窄模型组大鼠的气管截面 HE 染色
伪手术组（图 4a-c）气道通畅，管腔内上皮组织/黏膜完整而形态规整，纤毛结构清晰可见，为假复层纤毛柱状上皮，符合正常大气道黏膜的特征，未发现有肉芽组织增生或狭窄。而狭窄模型组，在尼龙刷刮擦引起机械损伤的区域均出现不同程度的狭窄（图 4d-f），可见肉芽组织增生显著；未见上皮结构或上皮结构极度异常；可见过度增殖、排列紊乱的成纤维细胞，形态为不规则形、梭形，旋涡状排列；胶原纤维过度沉积、新生毛细血管增多；部分区域还出现软骨错位、塌陷。
图4
伪手术组与狭窄模型组的气管截面病理检查像（HE×10）
a-c. 伪手术组；d-f. 狭窄模型组。伪手术组气管管腔通畅，上皮黏膜组织完整而光滑，纤毛结构清晰可见，未发现有肉芽组织增生或管腔狭窄。模型组机械损伤后，可见管腔显著狭窄，狭窄成分主要为增生的肉芽组织，未见上皮结构或上皮结构极度异常
2.3.2 狭窄模型组造模后不同时间点大鼠气管截面 HE 和 Masson 染色
结果见图 5。损伤后第 2 d（图 5c、d）即可观察到肉芽组织，其间可见散在成纤维细胞及炎性细胞。成纤维细胞在第 4 d（图 5e、f）左右呈爆发式增殖，为多突起的纺锤形或星形的扁平细胞，漩涡样排列，胞核较大呈椭圆形；伴大量炎症细胞浸润。成纤维细胞于第 6 d（图 5g、h）左右达最大量。在第 8 d（图 5i、j）部分成纤维细胞胞体变小变狭长，细胞核变小，转化为纤维细胞。Masson 染色结果显示，造模后损伤部位的胶原纤维（蓝色）随着时间呈逐渐增多的趋势。
图5
黏膜机械损伤后不同时间点气管截面病理检查像（×20）
a、c、e、g、i. HE 染色；b、d、f、h、j. Masson 染色。a、b. 手术当日；c、d. 术后第 2 d；e、f. 术后第 4 d；g、h. 术后第 6 d；i、j. 术后第 8 d。手术当日气管管腔通畅，上皮黏膜组织完整而光滑，未发现有肉芽组织增生或管腔狭窄。机械损伤后第 2 d 即可观察到肉芽组织，其间可见散在成纤维细胞及炎性细胞，成纤维细胞在第 4 d 左右呈爆发式增殖，伴大量炎症细胞浸润，在第 8 d 部分成纤维细胞胞体变小变狭长，细胞核变小，转化为纤维细胞。Masson 染色见损伤部位的成纤维细胞呈先增多后下降趋势，损伤部位的胶原纤维随着时间而逐渐增多
3 讨论
国外气道狭窄的病因构成中主要以肺移植及长期气管插管或造口术后狭窄为主[1, 4]。我国既往以气管结核居首位，占所有病因的 60% 以上；长期气管插管或气管造口所致气管狭窄居第二位，约占 15.0%[5-6]。近年来，随着危重症医学的发展、呼吸支持技术在危重患者救治中的广泛运用，以及肺移植、气道手术的开展和普及，严重气道并发症的发生率逐渐提高[7-10]。气管插管或切开所占良性中央气道狭窄的病因比重大大提高，或将取代结核成为首要致病因素。Myer 等[11]根据阻塞情况将气道狭窄分为 4 度。通常患者在狭窄超过 50%，即 2 度以上狭窄后才出现相关症状，很多患者直到突发感染、水肿、黏液栓塞等致死性气道阻塞时才得以诊断。有将近 10% 的良性气道狭窄患者被漏诊或误诊[12-13]。当前，良性气道狭窄的治疗手段主要为手术切除狭窄段及断端吻合、球囊扩张、支架置入、热消融、冷冻治疗、局部丝裂霉素 C 等药物治疗、局部/全身应用类固醇激素、腔内近距离放疗等[1-22]，但疗效均有限，再狭窄率极高且需要定期气管镜随访。因此迫切需要建立一种简易、可靠的良性气道狭窄动物模型，以研究其发病机制、治疗干预以及评估疗效预后等。
本实验结果提示：机械损伤可引起上皮结构的破坏及肉芽组织的过度增生，尼龙刷刮擦可以成功制作获得性良性气道狭窄模型。气管插管引发良性气道狭窄的病理机制主要为长时间插管，安全气囊对气管壁产生机械压迫，引起黏膜缺血、坏死，甚至引起深达软骨的炎症。坏死的黏膜脱落后，损伤部位容易合并病原体感染，进一步加重炎症。损伤处的微环境中促炎因子大量释放，炎症细胞增多，成纤维细胞被广泛募集并通过有丝分裂的方式大量增殖，导致成纤维细胞主导的异常修复。肉芽组织增生可于插管后数小时内开始发生[23-24]，而狭窄则通常则在 5 d 之后才开始出现[25]。肉芽组织为幼稚阶段的纤维结缔组织，由增生的成纤维细胞以及新生薄壁的毛细血管构成，并伴有大量炎症细胞的浸润。炎性细胞中常以巨噬细胞为主，分泌大量转化生长因子-β、白细胞介素-1 及肿瘤坏死因子-α，进一步刺激成纤维细胞及毛细血管的增生。在损伤修复的整个过程中，成纤维细胞发挥着举足轻重的作用。损伤后前 3 d，成纤维细胞以有丝分裂的方式大量增殖；4～5 d 后，成纤维细胞开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织填补伤口；在修复后期，表现为收缩表型—肌成纤维细胞，造成创面收缩，并通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建引起瘢痕挛缩，最终形成瘢痕狭窄[26-30]。本实验模拟了临床上常见的继发于插管或气管切开等的黏膜机械损伤，各时间截点的大鼠气管中成纤维细胞及胶原纤维沉积情况与文献报道的病理病程相符，作为研究良性气道狭窄的动物模型十分适宜。
不同的实验目的有不同的造模方法，基本原理相仿，均以破坏黏膜为主。目前常用的制造动物气道狭窄模型的方法有：机械损伤，包括用毛刷或者活检钳等刮擦、咬检气管黏膜，气管内置入球囊导管、金属支架等[31-33]；化学损伤，黏膜下注射盐酸、NaOH、酒精等[34-36]；热损伤、高频电烧、氩气刀、激光等[37]。这些方法可单独使用，亦可联合应用。良性气道狭窄常用的造模动物有兔子[3, 38]、犬类[39]、山羊、猪等[40-41]。本模型采用 SD 大鼠，其体积较小，造模操作更加方便省时，重复性好且价格低廉。但本模型也有一定的局限性，由于大鼠气管管腔面积基数小，造模后（无任何治疗）肉芽组织在造模后第 8 d 几乎充满管腔，导致气道完全闭塞、动物窒息死亡。因此，该模型仅适用于狭窄早期阶段（肉芽组织增生期）的研究，不适用于瘢痕狭窄阶段。
综合以上实验结果可以得出，尼龙刷刮擦机械损伤气管黏膜的方式可以成功建立稳定、可靠的良性气道狭窄急性模型。其病理进程与临床上插管、造口等引起的良性气道狭窄相仿，可用于良性气道狭窄致病机制的研究和新药疗效的探索。
良性中央气道狭窄是呼吸系统的常见疾病。近年来，随着危重症医学的进步与呼吸支持技术的发展，以及肺移植等手术的开展和普及，良性气道狭窄的发生率呈增高趋势。而良性气道狭窄的治疗手段及疗效均有限，再狭窄率高且需要定期气管镜随访，因此仍是介入呼吸病学领域的一项挑战[1]。建立一种简易、可靠的良性气道狭窄动物模型对于研究发病机制、治疗干预以及评估疗效预后等尤为重要。由于操作便利、发育迅速、繁殖力强、价格低廉等优势，并且在大多数实验室中都很容易获得，基于鼠的动物模型一直是医学研究领域的“主力”。然而，受到动物大小和气道口径等因素的限制，使得该动物未能在良性气道狭窄研究领域被广泛应用。也有一些研究人员坚持利用小鼠模型，以非原位的方法研究气管的生物学功能[2]。我们建立了一种新型的基于大鼠的良性气管狭窄原位模型，该模型模拟临床上常见的继发于插管或气管切开等的黏膜机械损伤，可作为良性气道狭窄致病机制研究和新药疗效探索的可靠实验载体。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
本研究通过第二军医大学长海医院动物伦理委员会同意，所有操作符合实验动物管理条例。实验选用 Sprague Dawley 大鼠 35 只（长海医院实验中心动物房提供），雄性，220～300 g。实验前适应性饲养 1 周，观察动物有无异常表现。按随机数字法将 20 只 SD 大鼠分为模型组（10 只）和伪手术对照组（10 只），观察生存情况，测算并比较狭窄度；另外 15 只大鼠进行实验造模，于造模后不同时间点（第 0、2、4、6、8 d）获取气管组织观察病理改变。
1.2 仪器与设备
3% 戊巴比妥钠溶液（上海试剂二厂）、无菌注射器（美国 BD 公司）、小动物手术器械（德国 Roboz 公司）、3M VetbondTM组织黏胶（美国 3M 公司）、5% 碘伏棉球、75% 的酒精棉球、灭菌干棉球若干（长海医院呼吸科提供）、防护手套、脱毛膏、1.5 mm 直径硬质尼龙刷、新鲜配制的 4% 多聚甲醛溶液、包埋盒、石蜡、二甲苯、100% 酒精、双蒸水、水浴锅、切片机、载玻片、盖玻片、中性树胶、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒、Masson 染色试剂盒等。
1.3 方法
1.3.1 实验方法
实验前所有动物禁食 6～8 h，3% 戊巴比妥钠（0.1～0.2 ml/100 g）经腹腔注射麻醉。将 SD 大鼠仰卧固定，颈前区用脱毛膏被毛，以 0.5% 碘伏消毒，作长约 3 cm 的颈前区正中切口，钝性分离颌下腺及气管旁肌肉，左右两侧分别以弯头止血钳牵拉气管旁肌肉以暴露喉和气管，在距环状软骨 0.4 cm 处横向切开气管，切开 2/3 周径。对照组进行以上操作后即进行后续缝合处理；模型组从切口处向远端伸入 1.5 mm 直径硬质尼龙刷（图 1a），来回刮刷 10 次以刮除黏膜，摩擦区域长约 1 cm（图 1b），若操作过程出现气管内出血，可用镊子钳取少量止血棉球深入管腔压迫止血。两组大鼠均用 6-0 带线缝针进行气管间断缝合。松开止血钳，将气管旁肌肉归位，用 4-0 缝线逐层缝合肌肉、颌下腺、皮下组织。最后，用组织胶（3M VetbondTM）粘合皮肤。所有动物术后置于加热毯，待麻醉苏醒后放归饲养环境。
图1
造模用尼龙刷和刮擦示意图
a. 专用 1.5 mm 直径硬质尼龙刷；b. 手术操作中刮擦示意图
1.3.2 观察指标
（1）一般情况：术后每天观察实验大鼠有无气短、喘息、呼吸困难等症状，以及精神状况、饮食情况、活动情况，记录大鼠造模后的生存时间。
（2）病理学改变：动物自然死亡或处死后，取造模段气管组织横切标本进行病例分析，了解黏膜损伤及肉芽组织增生情况。上述造模与对照组 SD 大鼠自然死亡或 CO2 处死箱安乐死后，在颈前区正中作一长约 5 cm 的切口，钝性分离颌下腺及气管旁肌肉，暴露喉和气管，用眼科剪截取环状软骨下 0.4～1.4 cm 的气管段（位置相当于模型组的造模段气管），将气管组织沿着气管软骨环截为若干长约 0.3 cm 的气管段，放入预先标记好的包埋盒，置于 4% 多聚甲醛溶液。取材要迅速，避免组织在空气中暴露过长时间。夹取组织时，避免将镊子伸入气管管腔，破坏管腔内结构。组织固定后进行包埋、切片、HE 染色及 Masson 染色，最后显微镜下观察。
（3）狭窄度测算与比较：参考 Nakagishi 等[3]的方法，狭窄度的计算公式为（1-s/S）×100%。其中，s 为发生狭窄时候气管通气腔的面积，s=π[（d1+d2）/2]2，d1 为通气腔内最长径，d2 为通气腔内最短径；S 为软骨环围成的环形面积，S=π[（D1+D2）/2]2，D1 为软骨围成环的最长径，D2 为最短径。
1.4 统计学方法
应用 Graphpad Prism 7 软件进行统计分析和制图。所有计量资料均以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用 One way ANOVA 分析，P<0.05 为差异有统计学意义。生存曲线的比较用 Log-rank 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验大鼠的基本情况
伪手术组 SD 大鼠（10 只）术后精神状态、活动状态良好；饮水、饮食正常；未观察到气促、呼吸困难等症状；术后第 8 d 存活率为 100%。狭窄模型组（10 只）术后精神萎靡，活动度降低，饮水、饮食均减少；1 只大鼠于术后 2 d 死亡，死因为黏液栓样物质阻塞气道；术后第 3 d 可见该组动物出现气促、憋喘症状；第 4 d 见实验动物蜗居笼具角落，可见呼吸幅度显著增加、呼吸困难、可闻及喘鸣音；术后第 6 d 死亡率 50%，第 8 d 死亡率 100%（图 2）；获取气管组织时肉眼可见管腔内新生肉芽组织及黏液栓样物质。经 Log-rank 检验，两组生存情况差异有统计学意义（P=0.000 1）。
图2
伪手术组及狭窄模型组的生存情况比较
2.2 狭窄度
伪手术组的狭窄度为（6.12±1.78）%，狭窄模型组的狭窄度为（60.28±12.56）%，两组之间的狭窄度差异有统计学意义（P<0.000 1），结果详见图 3。
图3
伪手术组与狭窄模型组的气管狭窄度比较
2.3 病理改变
2.3.1 伪手术组及狭窄模型组大鼠的气管截面 HE 染色
伪手术组（图 4a-c）气道通畅，管腔内上皮组织/黏膜完整而形态规整，纤毛结构清晰可见，为假复层纤毛柱状上皮，符合正常大气道黏膜的特征，未发现有肉芽组织增生或狭窄。而狭窄模型组，在尼龙刷刮擦引起机械损伤的区域均出现不同程度的狭窄（图 4d-f），可见肉芽组织增生显著；未见上皮结构或上皮结构极度异常；可见过度增殖、排列紊乱的成纤维细胞，形态为不规则形、梭形，旋涡状排列；胶原纤维过度沉积、新生毛细血管增多；部分区域还出现软骨错位、塌陷。
图4
伪手术组与狭窄模型组的气管截面病理检查像（HE×10）
a-c. 伪手术组；d-f. 狭窄模型组。伪手术组气管管腔通畅，上皮黏膜组织完整而光滑，纤毛结构清晰可见，未发现有肉芽组织增生或管腔狭窄。模型组机械损伤后，可见管腔显著狭窄，狭窄成分主要为增生的肉芽组织，未见上皮结构或上皮结构极度异常
2.3.2 狭窄模型组造模后不同时间点大鼠气管截面 HE 和 Masson 染色
结果见图 5。损伤后第 2 d（图 5c、d）即可观察到肉芽组织，其间可见散在成纤维细胞及炎性细胞。成纤维细胞在第 4 d（图 5e、f）左右呈爆发式增殖，为多突起的纺锤形或星形的扁平细胞，漩涡样排列，胞核较大呈椭圆形；伴大量炎症细胞浸润。成纤维细胞于第 6 d（图 5g、h）左右达最大量。在第 8 d（图 5i、j）部分成纤维细胞胞体变小变狭长，细胞核变小，转化为纤维细胞。Masson 染色结果显示，造模后损伤部位的胶原纤维（蓝色）随着时间呈逐渐增多的趋势。
图5
黏膜机械损伤后不同时间点气管截面病理检查像（×20）
a、c、e、g、i. HE 染色；b、d、f、h、j. Masson 染色。a、b. 手术当日；c、d. 术后第 2 d；e、f. 术后第 4 d；g、h. 术后第 6 d；i、j. 术后第 8 d。手术当日气管管腔通畅，上皮黏膜组织完整而光滑，未发现有肉芽组织增生或管腔狭窄。机械损伤后第 2 d 即可观察到肉芽组织，其间可见散在成纤维细胞及炎性细胞，成纤维细胞在第 4 d 左右呈爆发式增殖，伴大量炎症细胞浸润，在第 8 d 部分成纤维细胞胞体变小变狭长，细胞核变小，转化为纤维细胞。Masson 染色见损伤部位的成纤维细胞呈先增多后下降趋势，损伤部位的胶原纤维随着时间而逐渐增多
3 讨论
国外气道狭窄的病因构成中主要以肺移植及长期气管插管或造口术后狭窄为主[1, 4]。我国既往以气管结核居首位，占所有病因的 60% 以上；长期气管插管或气管造口所致气管狭窄居第二位，约占 15.0%[5-6]。近年来，随着危重症医学的发展、呼吸支持技术在危重患者救治中的广泛运用，以及肺移植、气道手术的开展和普及，严重气道并发症的发生率逐渐提高[7-10]。气管插管或切开所占良性中央气道狭窄的病因比重大大提高，或将取代结核成为首要致病因素。Myer 等[11]根据阻塞情况将气道狭窄分为 4 度。通常患者在狭窄超过 50%，即 2 度以上狭窄后才出现相关症状，很多患者直到突发感染、水肿、黏液栓塞等致死性气道阻塞时才得以诊断。有将近 10% 的良性气道狭窄患者被漏诊或误诊[12-13]。当前，良性气道狭窄的治疗手段主要为手术切除狭窄段及断端吻合、球囊扩张、支架置入、热消融、冷冻治疗、局部丝裂霉素 C 等药物治疗、局部/全身应用类固醇激素、腔内近距离放疗等[1-22]，但疗效均有限，再狭窄率极高且需要定期气管镜随访。因此迫切需要建立一种简易、可靠的良性气道狭窄动物模型，以研究其发病机制、治疗干预以及评估疗效预后等。
本实验结果提示：机械损伤可引起上皮结构的破坏及肉芽组织的过度增生，尼龙刷刮擦可以成功制作获得性良性气道狭窄模型。气管插管引发良性气道狭窄的病理机制主要为长时间插管，安全气囊对气管壁产生机械压迫，引起黏膜缺血、坏死，甚至引起深达软骨的炎症。坏死的黏膜脱落后，损伤部位容易合并病原体感染，进一步加重炎症。损伤处的微环境中促炎因子大量释放，炎症细胞增多，成纤维细胞被广泛募集并通过有丝分裂的方式大量增殖，导致成纤维细胞主导的异常修复。肉芽组织增生可于插管后数小时内开始发生[23-24]，而狭窄则通常则在 5 d 之后才开始出现[25]。肉芽组织为幼稚阶段的纤维结缔组织，由增生的成纤维细胞以及新生薄壁的毛细血管构成，并伴有大量炎症细胞的浸润。炎性细胞中常以巨噬细胞为主，分泌大量转化生长因子-β、白细胞介素-1 及肿瘤坏死因子-α，进一步刺激成纤维细胞及毛细血管的增生。在损伤修复的整个过程中，成纤维细胞发挥着举足轻重的作用。损伤后前 3 d，成纤维细胞以有丝分裂的方式大量增殖；4～5 d 后，成纤维细胞开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织填补伤口；在修复后期，表现为收缩表型—肌成纤维细胞，造成创面收缩，并通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建引起瘢痕挛缩，最终形成瘢痕狭窄[26-30]。本实验模拟了临床上常见的继发于插管或气管切开等的黏膜机械损伤，各时间截点的大鼠气管中成纤维细胞及胶原纤维沉积情况与文献报道的病理病程相符，作为研究良性气道狭窄的动物模型十分适宜。
不同的实验目的有不同的造模方法，基本原理相仿，均以破坏黏膜为主。目前常用的制造动物气道狭窄模型的方法有：机械损伤，包括用毛刷或者活检钳等刮擦、咬检气管黏膜，气管内置入球囊导管、金属支架等[31-33]；化学损伤，黏膜下注射盐酸、NaOH、酒精等[34-36]；热损伤、高频电烧、氩气刀、激光等[37]。这些方法可单独使用，亦可联合应用。良性气道狭窄常用的造模动物有兔子[3, 38]、犬类[39]、山羊、猪等[40-41]。本模型采用 SD 大鼠，其体积较小，造模操作更加方便省时，重复性好且价格低廉。但本模型也有一定的局限性，由于大鼠气管管腔面积基数小，造模后（无任何治疗）肉芽组织在造模后第 8 d 几乎充满管腔，导致气道完全闭塞、动物窒息死亡。因此，该模型仅适用于狭窄早期阶段（肉芽组织增生期）的研究，不适用于瘢痕狭窄阶段。
综合以上实验结果可以得出，尼龙刷刮擦机械损伤气管黏膜的方式可以成功建立稳定、可靠的良性气道狭窄急性模型。其病理进程与临床上插管、造口等引起的良性气道狭窄相仿，可用于良性气道狭窄致病机制的研究和新药疗效的探索。
