引用本文： 李考, 宋淑军, 朱敏立, 王瑞娟, 董瑾, 闫如意, 冯凯. LRP5 基因多态性与慢性阻塞性肺疾病并发骨质疏松的关联性研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2019, 18(6): 515-521. doi: 10.7507/1671-6205.201904004 复制
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种生活方式相关的慢性炎症性气道疾病，是全球主要的致死性疾病之一[1]。骨质疏松是慢阻肺患者的重要并发症[2]，其发生机制至今未明。慢阻肺和骨质疏松的基因多态性研究，从分子遗传学角度，探索慢阻肺并发骨质疏松的发生机制。骨质疏松患者的基因多态性研究中，低密度脂蛋白受体相关蛋白 5（low-density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5）基因报道较多[3-5]，但目前该基因罕见于慢阻肺并发骨质疏松患者的研究中。本研究旨在探索中国北方汉族 LRP5 基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与慢阻肺并发骨质疏松的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
本研究纳入的 379 例中国北方汉族慢阻肺病例样本，来自 2007 年 9 月至 2017 年 10 月因慢阻肺急性加重入住战略支援部队特色医学中心（原解放军第 306 医院）呼吸内科治疗的患者。依据慢性阻塞性肺疾病全球倡议，患者既往接受肺功能检查并明确诊断为慢阻肺 3～4 级，评估为 C～D 组。入组 1 个月内均接受了胸部 CT 检查。排除标准：慢阻肺以外的其他呼吸系统疾病；5 年内发生恶性肿瘤史；自身免疫性疾病；甲状腺功能亢进症、甲状旁腺功能亢进症、皮质醇增多症、慢性肝肾功能不全等影响骨质代谢的疾病；应用降钙素、钙剂、维生素 D 等影响骨代谢的药物；口服或静脉使用 1 个月以上的糖皮质激素[6-7]。
研究获得解放军第 306 医院伦理委员会的批准［批准号：（2016）科伦审第（06）号］。所有研究对象均在知情同意的原则下参与研究，并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 分组方法
对所有入选病例，收集其人口统计学资料及临床资料[8]。以腰 1 椎体 CT 值 100 HU 为分组标准[6]，≥100 HU 为非骨质疏松组，<100 HU 为骨质疏松组。
1.2.2 LRP5 基因标签单核苷酸多态性选择
利用美国加州大学圣克鲁斯分校（University of California Santa Cruz，UCSC）基因组浏览器[8-9]，检索 LRP5 基因，显示出基因结构图，LRP5 基因的位置为 chr11: 68080108-68216743（图 1a）。LRP5 基因 5’ 端扩展 5 万碱基对，3’ 端扩展 2 万碱基对（chr11: 68030108-68236743，图 1b）。确定 LRP5 基因在基因组的位置后，在千人基因组计划网站下载中国北方汉族 LRP5 基因 SNP 分型数据，利用 Haploview4.2 软件分析中国北方汉族人群单体型结果和确定标签单核苷酸多态性（tag single nucleotide polymorphism，tagSNP）用于研究。参数如下：选择哈代–温伯格（Hardy-Weinberg equilibrium，HW）平衡 P 值的阈值 0.05，最小次要等位基因频率（minor allele frequency，MAF）0.2。共获得 87 个 LRP5 基因的 SNP。使用 UCSC 基因组浏览器，最后确定了 LRP5 基因的 8 个 tagSNP 用于研究：rs312016 T/C，rs312017 C/T，rs312018 A/G，rs3736228 C/T，rs901823 T/C，rs589963 G/A，rs638051 A/G，rs671494 C/A（图 1c）。
图1
LRP5 基因研究区间和连锁不平衡
a. LRP5 基因位于人类第 11 号染色体的位置结构示意图，红线标示为 LRP5 基因所在位置。b. LRP5 基因在 UCSC 基因组注释。全图为本研究 LRP5 基因扩展碱基对后位置图。蓝色长线为 LRP5 基因所在位置；GWAS catalog 是全基因组关联分析目录；GTEx gene 表示基因表达序列；Layered H3K27Ac、DNase Clusters、Txn Factor ChIP 分别表示组氨酸乙酰化、DNase I 超敏反应、转录因子免疫共沉淀，这三种指标代表表观遗传学标记；TEx combined eQTL 表示表达数量性状基因座；100 Vertebrate Multiz Alignment & Conservation（100 Vert. Cons）表示物种序列比对保守性标记。c. LRP5 的 tagSNP 连锁不平衡结构图。tagSNP 所在位置用黑色方框进行了标注
1.2.3 DNA 提取
收集研究对象清晨空腹且用乙二胺四乙酸二钾抗凝的外周血 2 mL，应用异丙醇法提取基因组 DNA 并定量，稀释终浓度为 20 ng/μL，将每份样本分别加入 96 孔 PCR 板制成 DNA 模板，储存在–20 ℃ 冰箱中。
1.2.4 基因型分析
采用 Sequenom 公司的 MassARRAY SNP 基因分型技术平台对挑选出的 8 个 tagSNP 进行分型，引物设计采用 Assay Design 3.1 软件，对所有 SNP 两侧序列进行评价，并优化多重引物间的干扰，选择最优的扩增和延伸引物（表 1）[9]。分析时设阳性质控品和阴性质控品，作为阳性和阴性对照。随机选择两个样本作为阳性质控品，阴性质控品为去离子水。要求样本检出率在 95% 以上，阳性质控品和阴性质控品的检测结果符合预期，阴性质控品无检测结果。
表1
LRP5 基因 tagSNP 引物
1.3 统计学方法
临床资料采用多元变量回归法和随机森林法进行特征筛选，连续变量采用均数±标准差（
±s）表示，行独立样本的 Student’s t 检验，分类变量采用 χ2 检验。关联分析采用 Logistic 回归方法，计算多种遗传模式下各 SNP 的比数比（odds ratio，OR）和 95% 可信区间（confidence interval，CI）。多重检验校正采用 Bonferroni 法，α 值为 0.002 08，P<α 值为差异有统计学意义。在 R 软件 3.3.1 版上进行分析。采用把握度与样本量计算器（Power and Sample Size Circulations，PS）3.1 软件计算检验把握度[9]。
2 结果
2.1 慢阻肺非骨质疏松组与慢阻肺骨质疏松组入组人群临床特征分析
本研究共纳入 379 例患者，对 38 个变量进行特征筛选。其中，非骨质疏松组 155 例，女 30 例，男 125 例，骨质疏松组 224 例，女 103 例，男 121 例，两组间性别构成比比较，差异有统计学意义（χ2=27.36，P=1.7×10–7）。骨质疏松组较非骨质疏松组年龄偏大，差异有统计学意义［（77.9±7.5）岁比（72.9±9.9）岁，t=–5.35，P=1.9×10–7］。患者是否饮酒差异有统计学意义（27.7% 比 38.1%，t=4.08，P=0.04）。两组患者外周血血小板计数、血清磷、血肌酐比较，差异均有统计学意义（均 P<0.05）。采用多元变量回归分析和随机森林法对变量进行特征筛选，线性回归分析时去掉了吸烟、饮酒、肺气肿、肺大疱、肺动脉高压、糖尿病、肺心病和吸入糖皮质激素大于 1 年变量 8 个低共线性变量，从余下的 30 个高共线性变量中，最终确定年龄、血清钾、性别、血清磷、血清肌酐、血清 D 二聚体、血小板、病程、血清总胆固醇、血清氯 10 个变量作为校正因子纳入关联分析（图 2）。
图2
随机森林法计算变量在骨质疏松中的重要性分析图
2.2 LRP5 基因多态性与慢阻肺并骨质疏松的易感性的关联分析
采用 Logistic 回归法进行关联分析，校正了年龄、血清钾、性别、血清磷、血清肌酐、血清 D 二聚体、血小板、病程、总胆固醇、血清氯 10 个变量，计算出 8 个 tagSNP 的不同遗传模式下的检验值。经多重检验校正后，两组患者 LRP5 基因中的 rs901823 比较，差异有统计学意义（P<0.002 08），结果见表 2。
表2
LRP5 基因多态性与慢阻肺并发骨质疏松的易感性的关联分析
3 讨论
骨质疏松作为慢阻肺的重要合并症，对慢阻肺患者预后起着重要作用。由于临床上常常忽视慢阻肺患者并发骨质疏松[10]，所以一般不会将双能 X 线纳入常规检查。由于椎体的 CT 值与双能 X 线检查骨密度存在相关性[11]，特别是腰 1 椎体的 CT 值与骨密度有较好的相关性[6]，本研究以腰 1 椎体 CT 值分为非骨质疏松组和骨质疏松组，对缺乏双能 X 线检测数据的慢阻肺并骨质疏松患者的回顾性研究提供了一种可行的替代方法。
LRP5 属于低密度脂蛋白受体家族，在 Wnt/β-catenin 信号通路中起着重要作用。LRP5 通过参与调控成骨细胞的生长和分化[4]，调节骨代谢，影响骨密度。LRP5 基因与骨质疏松的发生密切相关[3, 5, 12]。本研究发现 rs901823 携带 C/C 基因型的慢阻肺患者，发生骨质疏松的风险较 T/T 和 C/T 高，提示 rs901823 位点 C 等位基因可能增加慢阻肺患者患骨质疏松的风险。在 UCSC 基因组浏览器可以发现，该 tagSNP 位于 LRP5 的第 19 个内含子上，该区域在人骨骼肌成肌细胞（human skeletal muscle myoblasts，HSMM）系中为组蛋白乙酰化赖氨酸 27（acetylated histone 3 lysine 27，H3K27Ac）功能活跃区域，提示可能与转录因子功能相关。该 tagSNP 在东亚人群中 C 等位基因的分布频率为 27.2%。本研究中，中国北方汉族慢阻肺患者中 C 等位基因分布频率为 25.9%（196/758），与东亚人群的 C 等位基因分布频率相仿，骨质疏松组等位基因 C 分布频率为 29.0%（130/448），非骨质疏松组中 C 等位基因分布频率为 21.3%（66/310），骨质疏松组中 C 等位基因分布频率明显高于非骨质疏松组，并且本研究骨质疏松组 C/C 纯合子的比例（9.4%）明显高于非骨质疏松组患者（1.3%）。在 Koay 等[13]的研究中，发现 rs556442 基因多态性与椎骨骨密度相关，隐性遗传模式中的基因型 G/G 的椎骨骨密度值大于基因型 A/A 或 A/G 的骨密度。rs901823 与 rs556442 均位于 19 内含子上，两者的功能可能存在相关性。遗憾的是我们的研究中没有纳入 rs556442 位点。
LRP5 基因中的 rs3736228 的基因多态性在骨质疏松的研究中有较多的报道[12, 14-15]。rs3736228 位于 LRP5 基因的第 18 个外显子。本研究中经校正其他临床因素后发现，携带基因型 T/T 的慢阻肺患者中，发生骨质疏松的风险高于携带 C/C 和 T/C 基因型的患者（在隐性遗传模式下，P=0.003 342），携带 T 等位基因增加骨质疏松的风险，与其他研究的结果是一致的[5, 16]，差异虽然未达到统计学意义，但接近本研究设定的 α 值（0.002 08）。差异未达到统计学意义的可能原因分析与样本量不足有关。在本研究中，骨质疏松组携带 C/C 基因型为 62.1%，T/C 基因型为 30.4%，T/T 基因型仅为 7.6%，与 Chubachi 等[17]研究的日本慢阻肺并发骨质疏松的患者是一致的。从图 1c 中可以看出 rs901823、rs556442 与 rs3736228 均在同一连锁不平衡区域内，前两者的连锁不平衡系数为 0.97，rs3736228 与余两者的连锁不平衡系数为 1，三者的连锁不平衡系数较高，提示在慢阻肺患者发生骨质疏松的机制上，其功能可能存在相关性，后续的研究可以进一步探索三者的功能。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种生活方式相关的慢性炎症性气道疾病，是全球主要的致死性疾病之一[1]。骨质疏松是慢阻肺患者的重要并发症[2]，其发生机制至今未明。慢阻肺和骨质疏松的基因多态性研究，从分子遗传学角度，探索慢阻肺并发骨质疏松的发生机制。骨质疏松患者的基因多态性研究中，低密度脂蛋白受体相关蛋白 5（low-density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5）基因报道较多[3-5]，但目前该基因罕见于慢阻肺并发骨质疏松患者的研究中。本研究旨在探索中国北方汉族 LRP5 基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与慢阻肺并发骨质疏松的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
本研究纳入的 379 例中国北方汉族慢阻肺病例样本，来自 2007 年 9 月至 2017 年 10 月因慢阻肺急性加重入住战略支援部队特色医学中心（原解放军第 306 医院）呼吸内科治疗的患者。依据慢性阻塞性肺疾病全球倡议，患者既往接受肺功能检查并明确诊断为慢阻肺 3～4 级，评估为 C～D 组。入组 1 个月内均接受了胸部 CT 检查。排除标准：慢阻肺以外的其他呼吸系统疾病；5 年内发生恶性肿瘤史；自身免疫性疾病；甲状腺功能亢进症、甲状旁腺功能亢进症、皮质醇增多症、慢性肝肾功能不全等影响骨质代谢的疾病；应用降钙素、钙剂、维生素 D 等影响骨代谢的药物；口服或静脉使用 1 个月以上的糖皮质激素[6-7]。
研究获得解放军第 306 医院伦理委员会的批准［批准号：（2016）科伦审第（06）号］。所有研究对象均在知情同意的原则下参与研究，并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 分组方法
对所有入选病例，收集其人口统计学资料及临床资料[8]。以腰 1 椎体 CT 值 100 HU 为分组标准[6]，≥100 HU 为非骨质疏松组，<100 HU 为骨质疏松组。
1.2.2 LRP5 基因标签单核苷酸多态性选择
利用美国加州大学圣克鲁斯分校（University of California Santa Cruz，UCSC）基因组浏览器[8-9]，检索 LRP5 基因，显示出基因结构图，LRP5 基因的位置为 chr11: 68080108-68216743（图 1a）。LRP5 基因 5’ 端扩展 5 万碱基对，3’ 端扩展 2 万碱基对（chr11: 68030108-68236743，图 1b）。确定 LRP5 基因在基因组的位置后，在千人基因组计划网站下载中国北方汉族 LRP5 基因 SNP 分型数据，利用 Haploview4.2 软件分析中国北方汉族人群单体型结果和确定标签单核苷酸多态性（tag single nucleotide polymorphism，tagSNP）用于研究。参数如下：选择哈代–温伯格（Hardy-Weinberg equilibrium，HW）平衡 P 值的阈值 0.05，最小次要等位基因频率（minor allele frequency，MAF）0.2。共获得 87 个 LRP5 基因的 SNP。使用 UCSC 基因组浏览器，最后确定了 LRP5 基因的 8 个 tagSNP 用于研究：rs312016 T/C，rs312017 C/T，rs312018 A/G，rs3736228 C/T，rs901823 T/C，rs589963 G/A，rs638051 A/G，rs671494 C/A（图 1c）。
图1
LRP5 基因研究区间和连锁不平衡
a. LRP5 基因位于人类第 11 号染色体的位置结构示意图，红线标示为 LRP5 基因所在位置。b. LRP5 基因在 UCSC 基因组注释。全图为本研究 LRP5 基因扩展碱基对后位置图。蓝色长线为 LRP5 基因所在位置；GWAS catalog 是全基因组关联分析目录；GTEx gene 表示基因表达序列；Layered H3K27Ac、DNase Clusters、Txn Factor ChIP 分别表示组氨酸乙酰化、DNase I 超敏反应、转录因子免疫共沉淀，这三种指标代表表观遗传学标记；TEx combined eQTL 表示表达数量性状基因座；100 Vertebrate Multiz Alignment & Conservation（100 Vert. Cons）表示物种序列比对保守性标记。c. LRP5 的 tagSNP 连锁不平衡结构图。tagSNP 所在位置用黑色方框进行了标注
1.2.3 DNA 提取
收集研究对象清晨空腹且用乙二胺四乙酸二钾抗凝的外周血 2 mL，应用异丙醇法提取基因组 DNA 并定量，稀释终浓度为 20 ng/μL，将每份样本分别加入 96 孔 PCR 板制成 DNA 模板，储存在–20 ℃ 冰箱中。
1.2.4 基因型分析
采用 Sequenom 公司的 MassARRAY SNP 基因分型技术平台对挑选出的 8 个 tagSNP 进行分型，引物设计采用 Assay Design 3.1 软件，对所有 SNP 两侧序列进行评价，并优化多重引物间的干扰，选择最优的扩增和延伸引物（表 1）[9]。分析时设阳性质控品和阴性质控品，作为阳性和阴性对照。随机选择两个样本作为阳性质控品，阴性质控品为去离子水。要求样本检出率在 95% 以上，阳性质控品和阴性质控品的检测结果符合预期，阴性质控品无检测结果。
表1
LRP5 基因 tagSNP 引物
1.3 统计学方法
临床资料采用多元变量回归法和随机森林法进行特征筛选，连续变量采用均数±标准差（±s）表示，行独立样本的 Student’s t 检验，分类变量采用 χ2 检验。关联分析采用 Logistic 回归方法，计算多种遗传模式下各 SNP 的比数比（odds ratio，OR）和 95% 可信区间（confidence interval，CI）。多重检验校正采用 Bonferroni 法，α 值为 0.002 08，P<α 值为差异有统计学意义。在 R 软件 3.3.1 版上进行分析。采用把握度与样本量计算器（Power and Sample Size Circulations，PS）3.1 软件计算检验把握度[9]。
2 结果
2.1 慢阻肺非骨质疏松组与慢阻肺骨质疏松组入组人群临床特征分析
本研究共纳入 379 例患者，对 38 个变量进行特征筛选。其中，非骨质疏松组 155 例，女 30 例，男 125 例，骨质疏松组 224 例，女 103 例，男 121 例，两组间性别构成比比较，差异有统计学意义（χ2=27.36，P=1.7×10–7）。骨质疏松组较非骨质疏松组年龄偏大，差异有统计学意义［（77.9±7.5）岁比（72.9±9.9）岁，t=–5.35，P=1.9×10–7］。患者是否饮酒差异有统计学意义（27.7% 比 38.1%，t=4.08，P=0.04）。两组患者外周血血小板计数、血清磷、血肌酐比较，差异均有统计学意义（均 P<0.05）。采用多元变量回归分析和随机森林法对变量进行特征筛选，线性回归分析时去掉了吸烟、饮酒、肺气肿、肺大疱、肺动脉高压、糖尿病、肺心病和吸入糖皮质激素大于 1 年变量 8 个低共线性变量，从余下的 30 个高共线性变量中，最终确定年龄、血清钾、性别、血清磷、血清肌酐、血清 D 二聚体、血小板、病程、血清总胆固醇、血清氯 10 个变量作为校正因子纳入关联分析（图 2）。
图2
随机森林法计算变量在骨质疏松中的重要性分析图
2.2 LRP5 基因多态性与慢阻肺并骨质疏松的易感性的关联分析
采用 Logistic 回归法进行关联分析，校正了年龄、血清钾、性别、血清磷、血清肌酐、血清 D 二聚体、血小板、病程、总胆固醇、血清氯 10 个变量，计算出 8 个 tagSNP 的不同遗传模式下的检验值。经多重检验校正后，两组患者 LRP5 基因中的 rs901823 比较，差异有统计学意义（P<0.002 08），结果见表 2。
表2
LRP5 基因多态性与慢阻肺并发骨质疏松的易感性的关联分析
3 讨论
骨质疏松作为慢阻肺的重要合并症，对慢阻肺患者预后起着重要作用。由于临床上常常忽视慢阻肺患者并发骨质疏松[10]，所以一般不会将双能 X 线纳入常规检查。由于椎体的 CT 值与双能 X 线检查骨密度存在相关性[11]，特别是腰 1 椎体的 CT 值与骨密度有较好的相关性[6]，本研究以腰 1 椎体 CT 值分为非骨质疏松组和骨质疏松组，对缺乏双能 X 线检测数据的慢阻肺并骨质疏松患者的回顾性研究提供了一种可行的替代方法。
LRP5 属于低密度脂蛋白受体家族，在 Wnt/β-catenin 信号通路中起着重要作用。LRP5 通过参与调控成骨细胞的生长和分化[4]，调节骨代谢，影响骨密度。LRP5 基因与骨质疏松的发生密切相关[3, 5, 12]。本研究发现 rs901823 携带 C/C 基因型的慢阻肺患者，发生骨质疏松的风险较 T/T 和 C/T 高，提示 rs901823 位点 C 等位基因可能增加慢阻肺患者患骨质疏松的风险。在 UCSC 基因组浏览器可以发现，该 tagSNP 位于 LRP5 的第 19 个内含子上，该区域在人骨骼肌成肌细胞（human skeletal muscle myoblasts，HSMM）系中为组蛋白乙酰化赖氨酸 27（acetylated histone 3 lysine 27，H3K27Ac）功能活跃区域，提示可能与转录因子功能相关。该 tagSNP 在东亚人群中 C 等位基因的分布频率为 27.2%。本研究中，中国北方汉族慢阻肺患者中 C 等位基因分布频率为 25.9%（196/758），与东亚人群的 C 等位基因分布频率相仿，骨质疏松组等位基因 C 分布频率为 29.0%（130/448），非骨质疏松组中 C 等位基因分布频率为 21.3%（66/310），骨质疏松组中 C 等位基因分布频率明显高于非骨质疏松组，并且本研究骨质疏松组 C/C 纯合子的比例（9.4%）明显高于非骨质疏松组患者（1.3%）。在 Koay 等[13]的研究中，发现 rs556442 基因多态性与椎骨骨密度相关，隐性遗传模式中的基因型 G/G 的椎骨骨密度值大于基因型 A/A 或 A/G 的骨密度。rs901823 与 rs556442 均位于 19 内含子上，两者的功能可能存在相关性。遗憾的是我们的研究中没有纳入 rs556442 位点。
LRP5 基因中的 rs3736228 的基因多态性在骨质疏松的研究中有较多的报道[12, 14-15]。rs3736228 位于 LRP5 基因的第 18 个外显子。本研究中经校正其他临床因素后发现，携带基因型 T/T 的慢阻肺患者中，发生骨质疏松的风险高于携带 C/C 和 T/C 基因型的患者（在隐性遗传模式下，P=0.003 342），携带 T 等位基因增加骨质疏松的风险，与其他研究的结果是一致的[5, 16]，差异虽然未达到统计学意义，但接近本研究设定的 α 值（0.002 08）。差异未达到统计学意义的可能原因分析与样本量不足有关。在本研究中，骨质疏松组携带 C/C 基因型为 62.1%，T/C 基因型为 30.4%，T/T 基因型仅为 7.6%，与 Chubachi 等[17]研究的日本慢阻肺并发骨质疏松的患者是一致的。从图 1c 中可以看出 rs901823、rs556442 与 rs3736228 均在同一连锁不平衡区域内，前两者的连锁不平衡系数为 0.97，rs3736228 与余两者的连锁不平衡系数为 1，三者的连锁不平衡系数较高，提示在慢阻肺患者发生骨质疏松的机制上，其功能可能存在相关性，后续的研究可以进一步探索三者的功能。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
