引用本文： 孙亮, 李鑫, 姬文婕, 魏路清. KLF4、单核/巨噬细胞亚群在间质性肺疾病中的变化及可能的作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2020, 19(5): 467-473. doi: 10.7507/1671-6205.201907018 复制
Krüppel 样因子 4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是参与单核巨噬细胞亚群调控的重要转录因子。本课题组的前期研究证实 KLF4、单核巨噬细胞亚群在博来霉素致肺纤维化进程中均呈现动态变化，同时发现阿托伐他汀能够影响博来霉素小鼠肺纤维化模型肺组织 KLF4 的表达[1]。但 KLF4 参与的单核巨噬细胞亚群调控是否在肺纤维化患者发病过程中发挥作用，目前仍未阐明。因此本课题意图从临床基础角度出发，观察肺纤维化患者 KLF4、单核– 巨噬细胞亚群变化与肺功能的关系；并进一步深化前期的研究工作，探讨 KLF4 参与的单核巨噬细胞亚群调控与肺纤维化发生发展的关系，为寻找肺纤维化治疗的新靶点奠定基础。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
选取武警特色医学中心 2015 年 5 月至 2017 年 1 月住院治疗的患者（肺纤维化组）、同期健康体检者（外周血单核细胞亚群及 KLF4 对照组，对照 A 组）以及需行支气管镜检查的慢性咳嗽且无肺纤维化患者（肺泡灌洗液巨噬细胞亚群对照组，对照 B 组）。本研究由武警特色医学中心研究伦理委员会批准，保证患者入院后的各项检查措施符合诊疗常规，包括常规抽血、高分辨率 CT、肺功能检测及支气管镜检查），各项检查前均签署书面知情同意书。所有检查结果回报后，病例在武警特色医学中心呼吸与重症医学科医生办公室讨论决定最终诊断，讨论医生包括呼吸科医师、风湿免疫科医师、病理科医师以及放射科医师。诊断依据：美国胸科协会/欧洲呼吸学会的特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）诊断及治疗指南（2011 版）以及干燥综合征（圣地亚哥标准）、多发性肌炎/皮肌炎［1975 年 Bohn 和 Peter 提出的诊断标准］、类风湿性关节炎［美国风湿病协会 1987 年修正的分类标准］等疾病的诊疗标准，决定患者为原发或继发性间质性肺疾病，并根据高分辨率 CT 诊断典型的 IPF。
肺纤维化组：肺纤维化组包括特发性间质性肺炎和继发性间质性肺炎，特发性间质性肺炎包括新发的 IPF 和非特异性间质性肺炎（nonspecific interstitial pneumonia，NSIP）；继发性间质性肺炎主要选取继发于结缔组织病、影像学主要表现为 NSIP 的间质性肺疾病患者。纳入标准：① 均为初诊患者；② 年龄 18～70 岁；③ 无严重心脑血管疾病；④ 无胸廓畸形及肺部基础病。排除标准：① 不能耐受支气管镜检查；② 不能耐受肺功能检查。
外周血单核细胞对照组（对照 A 组）：选取正常人群（在武警特色医学中心健康体检者），抽取外周血检测单核细胞亚群作为对照。纳入标准：① 既往体健，无吸烟史，体检胸部 X 线片及心电图正常；② 年龄 18～70 岁。排除标准：① 近期出现感冒、肺部感染等疾病；② 肥胖患者（肥胖影响单核细胞分化）[2]。
肺泡灌洗液巨噬细胞对照组（对照 B 组）：需行支气管镜检查的慢性咳嗽且无肺纤维化患者。纳入标准：① 既往体健，无吸烟史，不明原因咳嗽超过 8 周，胸部 X 线片及心电图检查正常；② 年龄 18～70 岁；③ 支气管镜下检查未见异常；④ 肺功能检查正常。排除标准：① 近期出现肺部感染；② 不能耐受支气管镜检查。
1.2 方法
1.2.1 主要仪器
肺功能仪（Master Screen Diffusion，德国）；WS-H200 型自动超声波人体秤（上海，中国）；电子天平-FA 1104（上海，中国）；–80 ℃ 冰箱（Sanyo，日本）；CytomicsFC500 流式细胞仪（Beckman coulter，美国）；漩涡混匀器（IKA，德国）；流式分析试管（BD，美国）；双人单面净化工作台-SW-CJ-2FD 型（苏州，中国）；血气分析仪（GEM premier 3000；Instrumentation Laboratory，Bedford，IL，美国）。
1.2.2 主要试剂
（1）异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记鼠抗人 CD45（BD，美国）；（2）藻红蛋白（phycoerhthrin，PE）标记鼠抗人 CD14（BD，美国）；（3）藻红蛋白-Cy5 结合物（phycoerhthrin-Cy5 conjugate，PE/Cy5）标记鼠抗人 CD16（BD，美国）；（4）红细胞裂解（BD，美国）；（5）PE/Cy7 标记鼠抗人 CD41（BD，美国）；（6）Flow-CountTM 荧光微球（Beckman coulter，美国）；（7）磷酸盐缓冲液（BD，美国）；（8）FITC 标记鼠抗人 CD11b（BD，美国）；（9）PE 标记鼠抗人 CD169（BD，美国）；（10）PE/Cy5 标记大鼠抗小鼠 mIgG1（BD，美国）；（11）PE/Cy5 标记鼠抗人 CD206（BD，美国）；（12）7-氨基放线菌素 D（7-amino-actinomycin D，7-AAD；BD，美国）。
1.2.3 肺功能检测
（1）准确测量身高和体重；（2）检查前询问受试者病史，嘱在检查过程中保持坐位并尽量避免运动；（3）肺弥散功能检查前先准确测定受试者的肺活量或用力肺活量；（4）向受试者介绍检查动作，指导受试者依次练习呼气—深吸气—屏气—呼气等动作。（5）给患者夹上鼻夹；（6）将咬嘴含口上，平静呼吸 4～5 个循环，待潮气末基线平稳后，让患者呼气至残气量位；（7）令受试者在 2 s 内均匀吸气至肺总量位；（8）接着屏气 10 s，最后在 2～4 s 内均匀持续中速呼气完全至残气量位。
1.2.4 动脉氧分压的检测
清晨留取动脉血，轻轻混匀，应用 GEM premier 3000 血气自动分析仪行血气检测。
1.2.5 流式细胞术检测外周血单核细胞亚群
1.2.5.1 血液标本制备
（1）研究对象入院后抽取空腹外周静脉血 5 mL 至抗凝管中，送至实验室，准备制备血液标本上机检测；（2）取 600 μL EP 管，标记并编号；（3）检测管加 2 μL CD45-FITC、3 μL CD14-PE、2 μLCD16-PE-Cy5 单克隆抗体，对照管加 2 μL CD45-FITC、3 μL CD14-PE、2 μL mIgG1 PE-Cy5 单克隆抗体，各管再加 30 μL 静脉全血，混匀（漩涡），室温、避光，孵育 15 min；（4）溶解红细胞，向流式试管中加 600 μL 红细胞裂解液，漩涡混匀，室温避光反应 10 min；（5）取出 Flow-CountTM 荧光微球，漩涡混匀 10 s，反向加样法在各标本管中加入 30 μL 荧光微球，漩涡混匀。
1.2.5.2 上机检测步骤
（1）用荧光微球（Flow-CountTM）校正机器；（2）侧向角散射光（side scatter，SSC）和前向角散射光（forward scatter，FSC）双参数点图检测外周血单核细胞亚群；（3）根据 SSC 为纵坐标，CD86-FITC 为横坐标，建立 SSC-CD86-FITC 散点图，反向设门法圈出单核细胞亚群；（4）利用 CD16 抗体对照抗体 mIgG1-PE-Cy5 界定阴性细胞；（5）抗 CD86-FITC、CD14-PE、CD16-PE-Cy5 单阳细胞调节补偿；（6）利用单核细胞 CD14 和 CD16 表达水平将单核细胞分为 3 个亚群，分别为 CD14++CD16– 亚群（Mon1），CD14++CD16+亚群（Mon2）及 CD14+CD16++亚群（Mon3）；（7）利用 Flowjo 6.2 软件获取并分析数据；（8）分析流程图见图 1。
图1
外周血单核细胞分析流程图
1.2.6 流式细胞术检测肺泡灌洗液巨噬细胞亚群
1.2.6.1 肺泡灌洗液的获取及制备
（1）向患者及家属说明支气管镜检查的目的及意义，取得患者配合后行支气管镜检查，生理盐水灌洗病变肺，回收肺泡灌洗液；（2）将回收肺泡灌洗液立即用双层无菌纱布过滤除去黏液，记录总量；（3）将肺泡灌洗液装入硅塑瓶灭菌玻璃容器中，置于含有冰块的保温瓶中，立即送往实验室；（4）取肺泡灌洗液 10 mL，经 300 目金属网过滤去掉杂质和痰液，300 g、5 min 离心后弃上清；（5）用含有 0.5% 胎牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液洗 2 次；（6）取肺泡灌洗液 100 μL 加入 20 μL 荧光抗体，室温避光孵育 20 min，300 g、5 min 离心后弃上清；（7）加 1∶9 配制的溶血素 2 mL，避光 10 min，200 g、5 min 离心后弃上清；（8）加入磷酸盐缓冲液 300 g、5 min 离心后弃上清，加 0.5 mL 磷酸盐缓冲液重悬细胞上机待测。
1.2.6.2 上机检测
（1）Flow-CountTM 荧光微球校正仪器使其达到最佳工作状态；（2）经 7-AAD 染色，区分死亡和成活细胞；（3）三色荧光/侧向散射光设门（CD11b/SSC-Gating），设置巨噬细胞门并分析巨噬细胞免疫表型；（4）建立 CD11b /SSC 荧光点图，用 CD11b+细胞群圈门以排除其他成分的干扰，调节 FSC、SSC 电压，FSC 阈值，FL1-FL2% 、FL2-FL1% 荧光补偿，建立 CD206++/CD169+散点图，根据同型对照设门分析巨噬细胞（CD163+/CD163++）的表达情况，同时计算出 M1/M2 比值；（5）利用 Flowjo 6.2 软件获取并分析数据；（6）分选流程图见图 2。
图2
肺泡灌洗液巨噬细胞亚型流式细胞术分选流程图
1.2.7 酶联免疫吸附试验法检测血清 KLF4 的表达
根据试剂盒说明，在 15 min 内以 450 nm 波长依序测量各样本的吸光度值；得出并描绘标准物的浓度与吸光度值，计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的吸光度值代入方程，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，得出样品的实际浓度。
1.3 统计学方法
不符合正态分布的数据以中位数表示，组间中位数的比较采用 Mann–Whitney U 检验。符合正态分布者的数据，以均数±标准差（
±s）表示，采用成组 t 检验，否则进行秩和检验。检验水准为双侧 P<0.05。KLF4 与肺功能（弥散功能）、单核细胞亚群以及肺泡巨噬细胞亚群之间的关系采用相关分析法进行分析。
2 结果
2.1 外周血单核细胞检测结果
2.1.1 一般情况
肺纤维化组共搜集 36 例，男 12 例，女 24 例，平均年龄（64.3±9.8）岁；进一步亚组分析，发现其中特发性间质性肺炎组患者 18 例（IPF 患者 6 例，NSIP 患者 12 例），简称 IPF/NSIP 亚组；继发性间质性肺炎组患者 18 例，均继发于结缔组织病（干燥综合征 10 例，继发于类风湿性关节炎 6 例，继发于多发性肌炎/皮肌炎 2 例），简称 CTD-ILD 亚组；对照 A 组 30 例，男 25 例，女 5 例，平均年龄（35.6±11.5）岁。
2.1.2 肺纤维化组及对照 A 组单核细胞亚群比例结果
肺纤维化组 Mon1 为（79.21±11.51）%，对照 A 组为（84.32±4.67）%，差异有统计学意义（P<0.05）；肺纤维化组 Mon2 为（6.42±4.04）%，对照 A 组为（3.95±0.94）%，差异有统计学意义（P<0.05）；肺纤维化组 Mon3 为（10.12±8.37）%，对照 A 组为（7.41±3.50）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.1.3 IPF/NSIP 亚组与对照 A 组单核细胞亚群比例结果
亚组分析发现，IPF/NSIP 亚组 Mon1 为（80.73±10.47）%，对照 A 组为（84.32±4.67）%，差异无统计学意义（P>0.05）；IPF/NSIP 亚组 Mon2 为（5.80±3.25）%，对照 A 组为（3.95±0.94）%，差异有统计学意义（P<0.05）；IPF/NSIP 亚组 Mon3 为（10.54±7.60）%，对照 A 组为（7.41±3.50）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.1.4 CTD-ILD 亚组与对照 A 组单核细胞亚群比例结果
亚组分析发现，CTD-ILD 亚组 Mon1 为（77.68±12.90）%，对照 A 组为（84.32±4.67）%，差异有统计学意义（P<0.05）；CTD-ILD 亚组 Mon2 为（7.03±4.83）%，对照 A 组为（3.95±0.94）%，差异无统计学意义（P>0.05）；CTD-ILD 亚组 Mon3 为（9.70±9.52）%，对照 A 组为（7.41±3.50）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.1.5 CTD-ILD 亚组与 IPF/NSIP 亚组单核细胞亚群比例结果
亚组分析发现，CTD-ILD 亚组 Mon1 为（77.68±12.90）%，IPF/NSIP 亚组为（80.73±10.47）%，差异无统计学意义（P>0.05）；CTD-ILD 亚组 Mon2 为（7.03±4.83）%，IPF/NSIP 亚组为（5.80±3.25）%，差异无统计学意义（P>0.05）；CTD-ILD 亚组 Mon3 为（9.70±9.52）%，IPF/NSIP 亚组为（10.54±7.60）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.1.6 肺纤维化组外周血单核细胞亚群与 DLCO 及 PaO2 的相关关系
相关分析发现单核细胞三个亚型分化比例与患者 DLCO 及 PaO2 之间无相关性。结果见表 1。
表1
肺纤维化组外周血单核细胞亚群与 DLCO 及 PaO2 的相关关系
2.2 肺泡灌洗液巨噬细胞细胞检测结果
2.2.1 一般情况
肺纤维化组共搜集 23 例支气管肺泡灌洗液，男 10 例，女 13 例，平均年龄（63.6±7.5）岁；进一步亚组分析发现，其中特发性间质性肺炎 14 例（IPF 4 例，NSIP 10 例），简称 IPF/NSIP 亚组；继发性间质性肺炎患者 9 例，均继发于结缔组织病（继发于干燥综合征 4 例，继发于类风湿性关节炎 3 例，继发于多发性肌炎/皮肌炎 2 例），简称 CTD-ILD 亚组；对照 B 组 10 例，男 5 例，女 5 例，平均年龄（41.4±10.7）岁。
2.2.2 肺纤维化组及对照 B 组巨噬细胞亚群比例结果
肺纤维化组 M1 为（24.42±13.95）%，对照 B 组为（47.02±21.67）%，差异有统计学意义（P<0.05）；肺纤维化组 M2 为（75.30±13.76）%，对照 B 组为（52.54±21.12）%，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2.3 IPF/NSIP 亚组与对照 B 组巨噬细胞亚群比例结果
亚组分析发现，IPF/NSIP 亚组 M1 为（27.46±11.47）%，对照 B 组为（47.02±21.67）%，差异有统计学意义（P<0.05）；IPF/NSIP 亚组 M2 为（72.24±11.22）%，对照 B 组为（52.54±21.12）%，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2.4 CTD-ILD 亚组与对照 B 组巨噬细胞亚群比例结果
亚组分析发现，继发性间质性肺炎组 M1 为（19.68±16.73）%，对照 B 组为（47.02±21.67）%，差异有统计学意义（P<0.05）；继发性间质性肺炎组 M2 为（80.07±16.55）%，对照 B 组为（52.54±21.12）%，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2.5 CTD-ILD 亚组与 IPF/NSIP 亚组巨噬细胞亚群比例结果
亚组分析发现，CTD-ILD 亚组 M1 为（19.68±16.73）%，IPF/NSIP 亚组为（27.46±11.47）%，差异无统计学意义（P>0.05）；CTD-ILD 亚组 M2 为（80.07±16.55）%，IPF/NSIP 亚组为（72.24±11.22）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2.6 肺纤维化组肺泡灌洗液巨噬细胞亚群与 DLCO 及 PaO2的相关关系
pearson 相关分析发现肺纤维化组 M2 亚型分化比例与患者 DLCO 及 PaO2 之间呈负相关（P<0.05）。结果见表 2。
表2
肺纤维化组肺泡灌洗液巨噬细胞亚群与 DLCO 及 PaO2 的相关关系
2.3 外周血 KLF4 蛋白检测结果
2.3.1 一般情况
肺纤维化组收集到 23 份外周血标本，用于检测 KLF4 蛋白表达量，其中有效数据 18 份，男 10 例，女 8 例，平均年龄（63.4±9.1）岁，特发性间质性肺炎 9 例（其中 IPF 2 例，NSIP 7 例），继发性间质性肺炎 9 例（继发于干燥综合征 4 例，继发于类风湿性关节炎 3 例，继发于多发性肌炎/皮肌炎 2 例）；对照 A 组30 例，男 25 例，女 5 例，平均年龄（35.6±11.5）岁。
2.3.2 肺纤维化组与对照 A 组外周血 KLF4 检测结果
肺纤维化组为 18 例，对照 A 组为 30 例，肺纤维化组 KLF4 为（17.13±6.47）ng/mL，对照 A 组为（13.95±0.85）ng/mL，两者相比差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3.3 肺纤维化组外周血 KLF4 的表达与巨噬细胞亚群分化的相关关系
pearson 相关分析发现 KLF4 的表达与 M2 型巨噬细胞的数量呈正相关（ρ=0.378，P=0.122），与 M1 型巨噬细胞的数量呈负相关（ρ=–0.380，P=0.119）。
3 讨论
本研究选取确诊的肺纤维化患者 36 例作为研究对象，患者中包括特发性间质性肺炎和继发性间质性肺炎患者；同时，还选取 10 例需行支气管镜检查的无肺纤维化患者以及 30 例正常人群作为对照。通过分析肺纤维化组肺泡巨噬细胞亚群及外周血单核细胞亚群与相应对照组肺泡巨噬细胞亚群及外周血单核细胞亚群的关系，以及肺纤维化组外周血 KLF4 的表达量及其与巨噬细胞亚群分化的关系，进一步观察肺纤维化组单核细胞亚群及巨噬细胞亚群分化与肺功能的关系。
根据目前常用的分类原则，利用单核细胞 CD14 和 CD16 表达水平将人体中的单核细胞分为 3 个亚群，分别为 CD14++CD16–亚群（Mon1），CD14++CD16+亚群（Mon2）及 CD14+CD16++亚群（Mon3）[3]。三群单核细胞分别代表单核细胞不同的分化阶段，Mon1 亚群和 Mon3 亚群是单核细胞分化发育的两极，即相对低分化和高分化阶段，而 Mon2 是过渡亚型。在健康人群中，Mon1 约占外周血单核细胞总数的 80%～90%，而 Mon2、Mon3 亚型均占外周血单核细胞总数的 5%～10%[4]。我们测定的对照 A 组外周血 Mon1 亚型占比为（84.32±4.67）%，Mon2、Mon3 亚型占比分别是（3.95±0.94）%、（7.41±3.50）%，与文献报道基本一致。
研究发现 CD16+单核细胞呈炎症表型，能够分泌 TGF-α 等促炎因子[4]，在机体出现炎症时，外周血中 CD16+单核细胞显著增高[5]，可能参与纤维化早起的炎症反应。我们课题组的动物实验也证明，博来霉素诱导的肺损伤小鼠，Ly6Chi主要是在炎症早期升高，而在纤维化进展期 Ly6Chi单核细胞比例较早期呈下降趋势[6]。但人单核细胞哪个亚群与肺纤维化关系密切，并在肺纤维化的进展中起主要作用，目前临床研究较少。我们发现，肺纤维化组患者 Mon1 亚型为（79.21±11.51）%，较对照 A 组下降，而 Mon2 及 Mon3 亚型较对照 A 组升高。这可能说明，在肺纤维化进程中，随着炎症反应的加重，单核细胞由 CD16– 亚型向更为成熟的 CD16+、CD16++亚型发展，CD16+单核细胞确实参与了肺组织由炎症向纤维化方向的发展。
但应该指出，虽然肺纤维化组 Mon2、Mon3 亚型较对照 A 组升高，但差异无统计学意义。而且通过相关性分析发现，三个亚型的单核细胞与肺间质纤维化程度均没有相关关系，我们主要考虑本次所纳入的患者虽然肺间质纤维化程度不同，但均已发展至纤维化期，这与早期的炎症反应存在差异，或许在间质性肺炎早期，Mon2、Mon3 亚型升高更为明显，其次，本次纳入的样本数量较少，可能对结果产生一定影响，下一步需要大样本的临床数据证实。
在炎症、损伤、修复过程中，不同亚型的单核细胞在组织局部浸润过程中亦分化为不同亚型及功能的巨噬细胞[7-8]。M1 型巨噬细胞由典型单核细胞（CD14++CD16– 或 CD11b+CD115+Ly6Chigh）分化产生；M2 型巨噬细胞由非典型单核细胞（CD14+CD16++或 CD11b+CD115+Ly6Clow）分化而来，不同的巨噬细胞亚型对组织损伤、修复所起的作用不同。目前认为 M1 型巨噬细胞在炎症早期具有抗菌、抗炎作用，炎症后期巨细胞通过多种途径，逐渐分化为 M2 型巨噬细胞，而 M2 型巨噬细胞则以旁分泌的形式引起成纤维细胞的过度增殖、细胞外基质沉积，逐渐发展为不可逆的肺间质纤维化，但关于肺纤维化患者肺泡灌洗液中巨噬细胞的分布及其可能的调控因素，目前尚少见研究报道。我们的结果显示，在肺纤维化组肺泡巨噬细胞以 M2 亚型为主，该结果提示在间质性肺疾病发展至肺纤维化阶段，巨噬细胞存在向 M2 亚型分化的倾向。
虽然没有直接的研究表明，肺间质纤维化患者肺组织 M2 型巨噬细胞明显增高，但有研究发现，在 IPF 患者及继发于系统性硬化症的间质性肺炎患者中，M2 型巨噬细胞表明标志物 CCL-18 明显增高，同时与肺纤维化程度呈正相关[9-10]。根据相关分析，我们的研究同样发现，M2 型巨噬细胞所占比例与 PaO2 呈明显的负相关，这说明，巨噬细胞向 M2 型分化与肺纤维化的进程呈正相关，这与既往研究相符。因此可以认为，在间质性肺疾病发展至肺纤维化阶段的过程中，M2 型巨噬细胞在其中起到重要作用。
但必须指出，有研究发现人类肺组织巨噬细胞与小鼠发展和分化基本相同[11]，而我们课题组的前期结果显示，博来霉素诱导的肺损伤小鼠从炎症期到损伤修复期，肺泡灌洗液 M1 巨噬细胞逐渐减少，M2 型巨噬细胞逐渐增多，但 M2 型巨噬细胞比例均未超过 70%[12]。
而本次我们检测肺泡灌洗液中的巨噬细胞，M2 亚型占（75.30±13.76）%，而 M1 亚型占（24.42±13.95）%。这可能与本研究对象为患者，且其肺纤维化程度较高，与药物所致肺损伤存在差异。且肺泡灌洗液中巨噬细胞并不能完全反映肺组织的巨噬细胞分布有关[13]。而对纤维化程度不同的结节病、外源性过敏性肺泡炎、NSIP 及 IPF 患者支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞亚型分析发现[14]，在以炎症反应为主的结节病中 CD40 表型的巨噬细胞（M1 巨噬细胞表型标志物）明显增高，而在纤维化程度较重的过敏性肺泡炎、NSIP、IPF 中以 CD163 表型的巨噬细胞（M2 巨噬细胞表型标志物）明显增高，虽然 CD163 表型的巨噬细胞低于本研究，但都表明 M2 型巨噬细胞比例与肺纤维化存在相关性。综上，间质性肺疾病患者的 M2 型巨噬细胞明显增高，并与肺纤维化程度呈正相关，这些研究结果均表明，M2 型巨噬细胞在肺间质纤维化的发生、发展中起重要作用。
研究表明，KLF4 是调控肺纤维化的重要调控因子，可通过调控成纤维细胞细胞分化[15]，调节平滑肌细胞分化及调控 alpha-SMA 的表达影响肺纤维化的进程[16]。新近研究显示，KLF4 也是调节单核巨噬细胞亚群偏移的关键因子，其上调可促使单核细胞向非典型方向分化，并使巨噬细胞向 M2 型偏移，其下调则抑制单核细胞向非典型方向分化，并可使巨噬细胞向 M1 偏移[17]。我们的前期研究发现，小鼠肺组织中 KLF4 mRNA 和蛋白的表达水平在博来霉素致肺纤维化过程中呈现明显的动态变化，第 1 d 开始升高，而后降低，第 3 d 达最低后逐渐升高直至第 28 d[1]。因此认为，KLF4 对巨噬细胞的这种双向调控作用，可能在肺纤维化的发生、发展中其中重要作用，而其影响肺纤维化进程的机制之一可能是通过调控单核巨噬细胞亚型的分化。
本组观察中，我们应用酶联免疫吸附试验法检测了间质性肺疾病患者外周血 KLF4 的表达量，试图寻找 KLF4 的表达与单核巨噬细胞分化的关系。但遗憾的是，虽然间质性肺疾病组 KLF4 蛋白较对照 A 组明显增高，KLF4 的表达与 M2 型巨噬细胞的数量呈正相关关系（ρ=0.378），但这种相关性未达到统计学意义。分析原因，我们认为可能与以下因素有关：第一，KLF4 的表达可能在组织或细胞中表达量较高，其分泌入血的量较少；第二，我们的检测方法粗糙，可能应用 PCR 技术，得到的结果更为可靠；第三，纳入患者的肺纤维化发展的阶段不一，影响了 KLF4 与单核巨噬细胞的相关性分析。或许动态观察 KLF4 的表达与肺间质纤维化发生、发展的关系更为可靠。因此我们推测 KLF4 参与的单核巨噬细胞亚群调控可能参与了肺纤维化发生、发展，关于其具体机制，以及在何种程度上影响纤维化的进程仍需要进一步研究。
另外，由于本组观察是临床研究，在支气管镜检查过程中，操作者不同，所得到的支气管肺泡灌洗液质量不同，可能对结果造成一定的影响。此外本研究样本量较少，且肺纤维化类型不同，也对结果造成一定影响，关于 KLF4 参与的单核/巨噬细胞亚群调控在间质性肺疾病中的变化及可能的作用仍需大样本的临床研究进一步观察。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
Krüppel 样因子 4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是参与单核巨噬细胞亚群调控的重要转录因子。本课题组的前期研究证实 KLF4、单核巨噬细胞亚群在博来霉素致肺纤维化进程中均呈现动态变化，同时发现阿托伐他汀能够影响博来霉素小鼠肺纤维化模型肺组织 KLF4 的表达[1]。但 KLF4 参与的单核巨噬细胞亚群调控是否在肺纤维化患者发病过程中发挥作用，目前仍未阐明。因此本课题意图从临床基础角度出发，观察肺纤维化患者 KLF4、单核– 巨噬细胞亚群变化与肺功能的关系；并进一步深化前期的研究工作，探讨 KLF4 参与的单核巨噬细胞亚群调控与肺纤维化发生发展的关系，为寻找肺纤维化治疗的新靶点奠定基础。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
选取武警特色医学中心 2015 年 5 月至 2017 年 1 月住院治疗的患者（肺纤维化组）、同期健康体检者（外周血单核细胞亚群及 KLF4 对照组，对照 A 组）以及需行支气管镜检查的慢性咳嗽且无肺纤维化患者（肺泡灌洗液巨噬细胞亚群对照组，对照 B 组）。本研究由武警特色医学中心研究伦理委员会批准，保证患者入院后的各项检查措施符合诊疗常规，包括常规抽血、高分辨率 CT、肺功能检测及支气管镜检查），各项检查前均签署书面知情同意书。所有检查结果回报后，病例在武警特色医学中心呼吸与重症医学科医生办公室讨论决定最终诊断，讨论医生包括呼吸科医师、风湿免疫科医师、病理科医师以及放射科医师。诊断依据：美国胸科协会/欧洲呼吸学会的特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）诊断及治疗指南（2011 版）以及干燥综合征（圣地亚哥标准）、多发性肌炎/皮肌炎［1975 年 Bohn 和 Peter 提出的诊断标准］、类风湿性关节炎［美国风湿病协会 1987 年修正的分类标准］等疾病的诊疗标准，决定患者为原发或继发性间质性肺疾病，并根据高分辨率 CT 诊断典型的 IPF。
肺纤维化组：肺纤维化组包括特发性间质性肺炎和继发性间质性肺炎，特发性间质性肺炎包括新发的 IPF 和非特异性间质性肺炎（nonspecific interstitial pneumonia，NSIP）；继发性间质性肺炎主要选取继发于结缔组织病、影像学主要表现为 NSIP 的间质性肺疾病患者。纳入标准：① 均为初诊患者；② 年龄 18～70 岁；③ 无严重心脑血管疾病；④ 无胸廓畸形及肺部基础病。排除标准：① 不能耐受支气管镜检查；② 不能耐受肺功能检查。
外周血单核细胞对照组（对照 A 组）：选取正常人群（在武警特色医学中心健康体检者），抽取外周血检测单核细胞亚群作为对照。纳入标准：① 既往体健，无吸烟史，体检胸部 X 线片及心电图正常；② 年龄 18～70 岁。排除标准：① 近期出现感冒、肺部感染等疾病；② 肥胖患者（肥胖影响单核细胞分化）[2]。
肺泡灌洗液巨噬细胞对照组（对照 B 组）：需行支气管镜检查的慢性咳嗽且无肺纤维化患者。纳入标准：① 既往体健，无吸烟史，不明原因咳嗽超过 8 周，胸部 X 线片及心电图检查正常；② 年龄 18～70 岁；③ 支气管镜下检查未见异常；④ 肺功能检查正常。排除标准：① 近期出现肺部感染；② 不能耐受支气管镜检查。
1.2 方法
1.2.1 主要仪器
肺功能仪（Master Screen Diffusion，德国）；WS-H200 型自动超声波人体秤（上海，中国）；电子天平-FA 1104（上海，中国）；–80 ℃ 冰箱（Sanyo，日本）；CytomicsFC500 流式细胞仪（Beckman coulter，美国）；漩涡混匀器（IKA，德国）；流式分析试管（BD，美国）；双人单面净化工作台-SW-CJ-2FD 型（苏州，中国）；血气分析仪（GEM premier 3000；Instrumentation Laboratory，Bedford，IL，美国）。
1.2.2 主要试剂
（1）异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记鼠抗人 CD45（BD，美国）；（2）藻红蛋白（phycoerhthrin，PE）标记鼠抗人 CD14（BD，美国）；（3）藻红蛋白-Cy5 结合物（phycoerhthrin-Cy5 conjugate，PE/Cy5）标记鼠抗人 CD16（BD，美国）；（4）红细胞裂解（BD，美国）；（5）PE/Cy7 标记鼠抗人 CD41（BD，美国）；（6）Flow-CountTM 荧光微球（Beckman coulter，美国）；（7）磷酸盐缓冲液（BD，美国）；（8）FITC 标记鼠抗人 CD11b（BD，美国）；（9）PE 标记鼠抗人 CD169（BD，美国）；（10）PE/Cy5 标记大鼠抗小鼠 mIgG1（BD，美国）；（11）PE/Cy5 标记鼠抗人 CD206（BD，美国）；（12）7-氨基放线菌素 D（7-amino-actinomycin D，7-AAD；BD，美国）。
1.2.3 肺功能检测
（1）准确测量身高和体重；（2）检查前询问受试者病史，嘱在检查过程中保持坐位并尽量避免运动；（3）肺弥散功能检查前先准确测定受试者的肺活量或用力肺活量；（4）向受试者介绍检查动作，指导受试者依次练习呼气—深吸气—屏气—呼气等动作。（5）给患者夹上鼻夹；（6）将咬嘴含口上，平静呼吸 4～5 个循环，待潮气末基线平稳后，让患者呼气至残气量位；（7）令受试者在 2 s 内均匀吸气至肺总量位；（8）接着屏气 10 s，最后在 2～4 s 内均匀持续中速呼气完全至残气量位。
1.2.4 动脉氧分压的检测
清晨留取动脉血，轻轻混匀，应用 GEM premier 3000 血气自动分析仪行血气检测。
1.2.5 流式细胞术检测外周血单核细胞亚群
1.2.5.1 血液标本制备
（1）研究对象入院后抽取空腹外周静脉血 5 mL 至抗凝管中，送至实验室，准备制备血液标本上机检测；（2）取 600 μL EP 管，标记并编号；（3）检测管加 2 μL CD45-FITC、3 μL CD14-PE、2 μLCD16-PE-Cy5 单克隆抗体，对照管加 2 μL CD45-FITC、3 μL CD14-PE、2 μL mIgG1 PE-Cy5 单克隆抗体，各管再加 30 μL 静脉全血，混匀（漩涡），室温、避光，孵育 15 min；（4）溶解红细胞，向流式试管中加 600 μL 红细胞裂解液，漩涡混匀，室温避光反应 10 min；（5）取出 Flow-CountTM 荧光微球，漩涡混匀 10 s，反向加样法在各标本管中加入 30 μL 荧光微球，漩涡混匀。
1.2.5.2 上机检测步骤
（1）用荧光微球（Flow-CountTM）校正机器；（2）侧向角散射光（side scatter，SSC）和前向角散射光（forward scatter，FSC）双参数点图检测外周血单核细胞亚群；（3）根据 SSC 为纵坐标，CD86-FITC 为横坐标，建立 SSC-CD86-FITC 散点图，反向设门法圈出单核细胞亚群；（4）利用 CD16 抗体对照抗体 mIgG1-PE-Cy5 界定阴性细胞；（5）抗 CD86-FITC、CD14-PE、CD16-PE-Cy5 单阳细胞调节补偿；（6）利用单核细胞 CD14 和 CD16 表达水平将单核细胞分为 3 个亚群，分别为 CD14++CD16– 亚群（Mon1），CD14++CD16+亚群（Mon2）及 CD14+CD16++亚群（Mon3）；（7）利用 Flowjo 6.2 软件获取并分析数据；（8）分析流程图见图 1。
图1
外周血单核细胞分析流程图
1.2.6 流式细胞术检测肺泡灌洗液巨噬细胞亚群
1.2.6.1 肺泡灌洗液的获取及制备
（1）向患者及家属说明支气管镜检查的目的及意义，取得患者配合后行支气管镜检查，生理盐水灌洗病变肺，回收肺泡灌洗液；（2）将回收肺泡灌洗液立即用双层无菌纱布过滤除去黏液，记录总量；（3）将肺泡灌洗液装入硅塑瓶灭菌玻璃容器中，置于含有冰块的保温瓶中，立即送往实验室；（4）取肺泡灌洗液 10 mL，经 300 目金属网过滤去掉杂质和痰液，300 g、5 min 离心后弃上清；（5）用含有 0.5% 胎牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液洗 2 次；（6）取肺泡灌洗液 100 μL 加入 20 μL 荧光抗体，室温避光孵育 20 min，300 g、5 min 离心后弃上清；（7）加 1∶9 配制的溶血素 2 mL，避光 10 min，200 g、5 min 离心后弃上清；（8）加入磷酸盐缓冲液 300 g、5 min 离心后弃上清，加 0.5 mL 磷酸盐缓冲液重悬细胞上机待测。
1.2.6.2 上机检测
（1）Flow-CountTM 荧光微球校正仪器使其达到最佳工作状态；（2）经 7-AAD 染色，区分死亡和成活细胞；（3）三色荧光/侧向散射光设门（CD11b/SSC-Gating），设置巨噬细胞门并分析巨噬细胞免疫表型；（4）建立 CD11b /SSC 荧光点图，用 CD11b+细胞群圈门以排除其他成分的干扰，调节 FSC、SSC 电压，FSC 阈值，FL1-FL2% 、FL2-FL1% 荧光补偿，建立 CD206++/CD169+散点图，根据同型对照设门分析巨噬细胞（CD163+/CD163++）的表达情况，同时计算出 M1/M2 比值；（5）利用 Flowjo 6.2 软件获取并分析数据；（6）分选流程图见图 2。
图2
肺泡灌洗液巨噬细胞亚型流式细胞术分选流程图
1.2.7 酶联免疫吸附试验法检测血清 KLF4 的表达
根据试剂盒说明，在 15 min 内以 450 nm 波长依序测量各样本的吸光度值；得出并描绘标准物的浓度与吸光度值，计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的吸光度值代入方程，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，得出样品的实际浓度。
1.3 统计学方法
不符合正态分布的数据以中位数表示，组间中位数的比较采用 Mann–Whitney U 检验。符合正态分布者的数据，以均数±标准差（±s）表示，采用成组 t 检验，否则进行秩和检验。检验水准为双侧 P<0.05。KLF4 与肺功能（弥散功能）、单核细胞亚群以及肺泡巨噬细胞亚群之间的关系采用相关分析法进行分析。
2 结果
2.1 外周血单核细胞检测结果
2.1.1 一般情况
肺纤维化组共搜集 36 例，男 12 例，女 24 例，平均年龄（64.3±9.8）岁；进一步亚组分析，发现其中特发性间质性肺炎组患者 18 例（IPF 患者 6 例，NSIP 患者 12 例），简称 IPF/NSIP 亚组；继发性间质性肺炎组患者 18 例，均继发于结缔组织病（干燥综合征 10 例，继发于类风湿性关节炎 6 例，继发于多发性肌炎/皮肌炎 2 例），简称 CTD-ILD 亚组；对照 A 组 30 例，男 25 例，女 5 例，平均年龄（35.6±11.5）岁。
2.1.2 肺纤维化组及对照 A 组单核细胞亚群比例结果
肺纤维化组 Mon1 为（79.21±11.51）%，对照 A 组为（84.32±4.67）%，差异有统计学意义（P<0.05）；肺纤维化组 Mon2 为（6.42±4.04）%，对照 A 组为（3.95±0.94）%，差异有统计学意义（P<0.05）；肺纤维化组 Mon3 为（10.12±8.37）%，对照 A 组为（7.41±3.50）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.1.3 IPF/NSIP 亚组与对照 A 组单核细胞亚群比例结果
亚组分析发现，IPF/NSIP 亚组 Mon1 为（80.73±10.47）%，对照 A 组为（84.32±4.67）%，差异无统计学意义（P>0.05）；IPF/NSIP 亚组 Mon2 为（5.80±3.25）%，对照 A 组为（3.95±0.94）%，差异有统计学意义（P<0.05）；IPF/NSIP 亚组 Mon3 为（10.54±7.60）%，对照 A 组为（7.41±3.50）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.1.4 CTD-ILD 亚组与对照 A 组单核细胞亚群比例结果
亚组分析发现，CTD-ILD 亚组 Mon1 为（77.68±12.90）%，对照 A 组为（84.32±4.67）%，差异有统计学意义（P<0.05）；CTD-ILD 亚组 Mon2 为（7.03±4.83）%，对照 A 组为（3.95±0.94）%，差异无统计学意义（P>0.05）；CTD-ILD 亚组 Mon3 为（9.70±9.52）%，对照 A 组为（7.41±3.50）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.1.5 CTD-ILD 亚组与 IPF/NSIP 亚组单核细胞亚群比例结果
亚组分析发现，CTD-ILD 亚组 Mon1 为（77.68±12.90）%，IPF/NSIP 亚组为（80.73±10.47）%，差异无统计学意义（P>0.05）；CTD-ILD 亚组 Mon2 为（7.03±4.83）%，IPF/NSIP 亚组为（5.80±3.25）%，差异无统计学意义（P>0.05）；CTD-ILD 亚组 Mon3 为（9.70±9.52）%，IPF/NSIP 亚组为（10.54±7.60）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.1.6 肺纤维化组外周血单核细胞亚群与 DLCO 及 PaO2 的相关关系
相关分析发现单核细胞三个亚型分化比例与患者 DLCO 及 PaO2 之间无相关性。结果见表 1。
表1
肺纤维化组外周血单核细胞亚群与 DLCO 及 PaO2 的相关关系
2.2 肺泡灌洗液巨噬细胞细胞检测结果
2.2.1 一般情况
肺纤维化组共搜集 23 例支气管肺泡灌洗液，男 10 例，女 13 例，平均年龄（63.6±7.5）岁；进一步亚组分析发现，其中特发性间质性肺炎 14 例（IPF 4 例，NSIP 10 例），简称 IPF/NSIP 亚组；继发性间质性肺炎患者 9 例，均继发于结缔组织病（继发于干燥综合征 4 例，继发于类风湿性关节炎 3 例，继发于多发性肌炎/皮肌炎 2 例），简称 CTD-ILD 亚组；对照 B 组 10 例，男 5 例，女 5 例，平均年龄（41.4±10.7）岁。
2.2.2 肺纤维化组及对照 B 组巨噬细胞亚群比例结果
肺纤维化组 M1 为（24.42±13.95）%，对照 B 组为（47.02±21.67）%，差异有统计学意义（P<0.05）；肺纤维化组 M2 为（75.30±13.76）%，对照 B 组为（52.54±21.12）%，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2.3 IPF/NSIP 亚组与对照 B 组巨噬细胞亚群比例结果
亚组分析发现，IPF/NSIP 亚组 M1 为（27.46±11.47）%，对照 B 组为（47.02±21.67）%，差异有统计学意义（P<0.05）；IPF/NSIP 亚组 M2 为（72.24±11.22）%，对照 B 组为（52.54±21.12）%，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2.4 CTD-ILD 亚组与对照 B 组巨噬细胞亚群比例结果
亚组分析发现，继发性间质性肺炎组 M1 为（19.68±16.73）%，对照 B 组为（47.02±21.67）%，差异有统计学意义（P<0.05）；继发性间质性肺炎组 M2 为（80.07±16.55）%，对照 B 组为（52.54±21.12）%，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2.5 CTD-ILD 亚组与 IPF/NSIP 亚组巨噬细胞亚群比例结果
亚组分析发现，CTD-ILD 亚组 M1 为（19.68±16.73）%，IPF/NSIP 亚组为（27.46±11.47）%，差异无统计学意义（P>0.05）；CTD-ILD 亚组 M2 为（80.07±16.55）%，IPF/NSIP 亚组为（72.24±11.22）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2.6 肺纤维化组肺泡灌洗液巨噬细胞亚群与 DLCO 及 PaO2的相关关系
pearson 相关分析发现肺纤维化组 M2 亚型分化比例与患者 DLCO 及 PaO2 之间呈负相关（P<0.05）。结果见表 2。
表2
肺纤维化组肺泡灌洗液巨噬细胞亚群与 DLCO 及 PaO2 的相关关系
2.3 外周血 KLF4 蛋白检测结果
2.3.1 一般情况
肺纤维化组收集到 23 份外周血标本，用于检测 KLF4 蛋白表达量，其中有效数据 18 份，男 10 例，女 8 例，平均年龄（63.4±9.1）岁，特发性间质性肺炎 9 例（其中 IPF 2 例，NSIP 7 例），继发性间质性肺炎 9 例（继发于干燥综合征 4 例，继发于类风湿性关节炎 3 例，继发于多发性肌炎/皮肌炎 2 例）；对照 A 组30 例，男 25 例，女 5 例，平均年龄（35.6±11.5）岁。
2.3.2 肺纤维化组与对照 A 组外周血 KLF4 检测结果
肺纤维化组为 18 例，对照 A 组为 30 例，肺纤维化组 KLF4 为（17.13±6.47）ng/mL，对照 A 组为（13.95±0.85）ng/mL，两者相比差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3.3 肺纤维化组外周血 KLF4 的表达与巨噬细胞亚群分化的相关关系
pearson 相关分析发现 KLF4 的表达与 M2 型巨噬细胞的数量呈正相关（ρ=0.378，P=0.122），与 M1 型巨噬细胞的数量呈负相关（ρ=–0.380，P=0.119）。
3 讨论
本研究选取确诊的肺纤维化患者 36 例作为研究对象，患者中包括特发性间质性肺炎和继发性间质性肺炎患者；同时，还选取 10 例需行支气管镜检查的无肺纤维化患者以及 30 例正常人群作为对照。通过分析肺纤维化组肺泡巨噬细胞亚群及外周血单核细胞亚群与相应对照组肺泡巨噬细胞亚群及外周血单核细胞亚群的关系，以及肺纤维化组外周血 KLF4 的表达量及其与巨噬细胞亚群分化的关系，进一步观察肺纤维化组单核细胞亚群及巨噬细胞亚群分化与肺功能的关系。
根据目前常用的分类原则，利用单核细胞 CD14 和 CD16 表达水平将人体中的单核细胞分为 3 个亚群，分别为 CD14++CD16–亚群（Mon1），CD14++CD16+亚群（Mon2）及 CD14+CD16++亚群（Mon3）[3]。三群单核细胞分别代表单核细胞不同的分化阶段，Mon1 亚群和 Mon3 亚群是单核细胞分化发育的两极，即相对低分化和高分化阶段，而 Mon2 是过渡亚型。在健康人群中，Mon1 约占外周血单核细胞总数的 80%～90%，而 Mon2、Mon3 亚型均占外周血单核细胞总数的 5%～10%[4]。我们测定的对照 A 组外周血 Mon1 亚型占比为（84.32±4.67）%，Mon2、Mon3 亚型占比分别是（3.95±0.94）%、（7.41±3.50）%，与文献报道基本一致。
研究发现 CD16+单核细胞呈炎症表型，能够分泌 TGF-α 等促炎因子[4]，在机体出现炎症时，外周血中 CD16+单核细胞显著增高[5]，可能参与纤维化早起的炎症反应。我们课题组的动物实验也证明，博来霉素诱导的肺损伤小鼠，Ly6Chi主要是在炎症早期升高，而在纤维化进展期 Ly6Chi单核细胞比例较早期呈下降趋势[6]。但人单核细胞哪个亚群与肺纤维化关系密切，并在肺纤维化的进展中起主要作用，目前临床研究较少。我们发现，肺纤维化组患者 Mon1 亚型为（79.21±11.51）%，较对照 A 组下降，而 Mon2 及 Mon3 亚型较对照 A 组升高。这可能说明，在肺纤维化进程中，随着炎症反应的加重，单核细胞由 CD16– 亚型向更为成熟的 CD16+、CD16++亚型发展，CD16+单核细胞确实参与了肺组织由炎症向纤维化方向的发展。
但应该指出，虽然肺纤维化组 Mon2、Mon3 亚型较对照 A 组升高，但差异无统计学意义。而且通过相关性分析发现，三个亚型的单核细胞与肺间质纤维化程度均没有相关关系，我们主要考虑本次所纳入的患者虽然肺间质纤维化程度不同，但均已发展至纤维化期，这与早期的炎症反应存在差异，或许在间质性肺炎早期，Mon2、Mon3 亚型升高更为明显，其次，本次纳入的样本数量较少，可能对结果产生一定影响，下一步需要大样本的临床数据证实。
在炎症、损伤、修复过程中，不同亚型的单核细胞在组织局部浸润过程中亦分化为不同亚型及功能的巨噬细胞[7-8]。M1 型巨噬细胞由典型单核细胞（CD14++CD16– 或 CD11b+CD115+Ly6Chigh）分化产生；M2 型巨噬细胞由非典型单核细胞（CD14+CD16++或 CD11b+CD115+Ly6Clow）分化而来，不同的巨噬细胞亚型对组织损伤、修复所起的作用不同。目前认为 M1 型巨噬细胞在炎症早期具有抗菌、抗炎作用，炎症后期巨细胞通过多种途径，逐渐分化为 M2 型巨噬细胞，而 M2 型巨噬细胞则以旁分泌的形式引起成纤维细胞的过度增殖、细胞外基质沉积，逐渐发展为不可逆的肺间质纤维化，但关于肺纤维化患者肺泡灌洗液中巨噬细胞的分布及其可能的调控因素，目前尚少见研究报道。我们的结果显示，在肺纤维化组肺泡巨噬细胞以 M2 亚型为主，该结果提示在间质性肺疾病发展至肺纤维化阶段，巨噬细胞存在向 M2 亚型分化的倾向。
虽然没有直接的研究表明，肺间质纤维化患者肺组织 M2 型巨噬细胞明显增高，但有研究发现，在 IPF 患者及继发于系统性硬化症的间质性肺炎患者中，M2 型巨噬细胞表明标志物 CCL-18 明显增高，同时与肺纤维化程度呈正相关[9-10]。根据相关分析，我们的研究同样发现，M2 型巨噬细胞所占比例与 PaO2 呈明显的负相关，这说明，巨噬细胞向 M2 型分化与肺纤维化的进程呈正相关，这与既往研究相符。因此可以认为，在间质性肺疾病发展至肺纤维化阶段的过程中，M2 型巨噬细胞在其中起到重要作用。
但必须指出，有研究发现人类肺组织巨噬细胞与小鼠发展和分化基本相同[11]，而我们课题组的前期结果显示，博来霉素诱导的肺损伤小鼠从炎症期到损伤修复期，肺泡灌洗液 M1 巨噬细胞逐渐减少，M2 型巨噬细胞逐渐增多，但 M2 型巨噬细胞比例均未超过 70%[12]。
而本次我们检测肺泡灌洗液中的巨噬细胞，M2 亚型占（75.30±13.76）%，而 M1 亚型占（24.42±13.95）%。这可能与本研究对象为患者，且其肺纤维化程度较高，与药物所致肺损伤存在差异。且肺泡灌洗液中巨噬细胞并不能完全反映肺组织的巨噬细胞分布有关[13]。而对纤维化程度不同的结节病、外源性过敏性肺泡炎、NSIP 及 IPF 患者支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞亚型分析发现[14]，在以炎症反应为主的结节病中 CD40 表型的巨噬细胞（M1 巨噬细胞表型标志物）明显增高，而在纤维化程度较重的过敏性肺泡炎、NSIP、IPF 中以 CD163 表型的巨噬细胞（M2 巨噬细胞表型标志物）明显增高，虽然 CD163 表型的巨噬细胞低于本研究，但都表明 M2 型巨噬细胞比例与肺纤维化存在相关性。综上，间质性肺疾病患者的 M2 型巨噬细胞明显增高，并与肺纤维化程度呈正相关，这些研究结果均表明，M2 型巨噬细胞在肺间质纤维化的发生、发展中起重要作用。
研究表明，KLF4 是调控肺纤维化的重要调控因子，可通过调控成纤维细胞细胞分化[15]，调节平滑肌细胞分化及调控 alpha-SMA 的表达影响肺纤维化的进程[16]。新近研究显示，KLF4 也是调节单核巨噬细胞亚群偏移的关键因子，其上调可促使单核细胞向非典型方向分化，并使巨噬细胞向 M2 型偏移，其下调则抑制单核细胞向非典型方向分化，并可使巨噬细胞向 M1 偏移[17]。我们的前期研究发现，小鼠肺组织中 KLF4 mRNA 和蛋白的表达水平在博来霉素致肺纤维化过程中呈现明显的动态变化，第 1 d 开始升高，而后降低，第 3 d 达最低后逐渐升高直至第 28 d[1]。因此认为，KLF4 对巨噬细胞的这种双向调控作用，可能在肺纤维化的发生、发展中其中重要作用，而其影响肺纤维化进程的机制之一可能是通过调控单核巨噬细胞亚型的分化。
本组观察中，我们应用酶联免疫吸附试验法检测了间质性肺疾病患者外周血 KLF4 的表达量，试图寻找 KLF4 的表达与单核巨噬细胞分化的关系。但遗憾的是，虽然间质性肺疾病组 KLF4 蛋白较对照 A 组明显增高，KLF4 的表达与 M2 型巨噬细胞的数量呈正相关关系（ρ=0.378），但这种相关性未达到统计学意义。分析原因，我们认为可能与以下因素有关：第一，KLF4 的表达可能在组织或细胞中表达量较高，其分泌入血的量较少；第二，我们的检测方法粗糙，可能应用 PCR 技术，得到的结果更为可靠；第三，纳入患者的肺纤维化发展的阶段不一，影响了 KLF4 与单核巨噬细胞的相关性分析。或许动态观察 KLF4 的表达与肺间质纤维化发生、发展的关系更为可靠。因此我们推测 KLF4 参与的单核巨噬细胞亚群调控可能参与了肺纤维化发生、发展，关于其具体机制，以及在何种程度上影响纤维化的进程仍需要进一步研究。
另外，由于本组观察是临床研究，在支气管镜检查过程中，操作者不同，所得到的支气管肺泡灌洗液质量不同，可能对结果造成一定的影响。此外本研究样本量较少，且肺纤维化类型不同，也对结果造成一定影响，关于 KLF4 参与的单核/巨噬细胞亚群调控在间质性肺疾病中的变化及可能的作用仍需大样本的临床研究进一步观察。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
