引用本文： 王云, 袁乐永, 王梅芳, 孟忠吉, 段敬柱, 杜士明, 唐以军. IRGM 基因多态性与尘肺易感性研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2020, 19(4): 366-370. doi: 10.7507/1671-6205.201907029 复制
尘肺是在生产过程中由于长时间吸入工作环境中的粉尘颗粒而引起的一种危害严重的职业病，表现为肺间质中成纤维细胞大量增殖以及细胞外基质胶原蛋白成分异常聚集[1-2]。免疫相关鸟苷三磷酸酶 M（immunity related GTPase M，IRGM）基因通过诱导细胞自噬调节机体免疫功能，可作为触发器启动连锁免疫反应，进而吞噬、消化外来有害物质，在细胞自噬性程序性死亡过程中起重要作用[3]。IRGM 基因多态性可能会影响自噬相关蛋白的表达，从而影响细胞自噬的反应性，而自噬和肺部纤维化的发生发展过程有密切关系。目前国内外对 IRGM 基因多态性位点与结核病、克罗恩病关系均有相关的研究，但关于 IRGM 基因多态性是否与尘肺有关尚未见报道。因此，探索自噬相关基因 IRGM 基因多态性是否与尘肺发病过程有关将有助于阐明尘肺的发病机制，为尘肺的防治提供新的策略。
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究对象分别来自 2016 年 6 月到 2018 年 12 月在湖北医药学院附属太和医院、十堰市职业病防治院就诊的鄂西北地区金矿、铁矿、煤矿的接尘工人，均为无血缘关系的汉族人。本次研究符合道德伦理并经湖北医药学院附属太和医院伦理委员会同意，全部研究对象签订知情同意书。病例组：根据我国最新尘肺病诊断标准（GBZ70-2015），确诊的尘肺患者作为病例组，一共有 248 例；对照组：以同性别、同民族、同一矿区、开始接尘时间和累积接尘工龄相近经证实未患尘肺的接尘工人为对照组，共 275 例。
1.2 方法
1.2.1 一般情况调查
采用自行设计的尘肺调查表对病例组和对照组进行调查，收集调查对象的基本资料，包括个人一般情况、疾病史、职业暴露史、吸烟史，以及尘肺患病情况等。按照世界卫生组织标准，连续或累积吸烟 6 个月或以上者为吸烟。
1.2.2 单核苷酸多态性位点的选择
利用 Haploview（version 4.0）软件，根据标签单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的挑选标准，采用 Tagger 软件选择 MAF≥0.05 的 SNP 位点；从 NCBI 及 HapMap 数据库中查找中国人群 IRGM 启动子区 SNP 及相关信息，并利用 Genetool 工具在 IRGM 基因上定位，筛选出中国人群 IRGM 启动子区 SNP。
1.2.3 基因型检测
采集静脉血 2 mL，采用 DNA 提取试剂盒提取 DNA，采用 TAKARA 公司 PrimeSTAR Max DNA Polymerase 试剂盒对提取的 DNA 进行 PCR 扩增，对所有 PCR 产物纯化并进行 Sanger 测序对所有 PCR 产物进行纯化并测序，测序引物为 PCR 扩增上游引物，测序结果与 GeneBank 进行比对。
1.3 统计学方法
用 Excel 建立数据库，采用 SPSS 18.0 统计软件。连续变量的比较用 t 检验，分类变量用 χ2 检验。对照组基因型用 χ2 拟合优度检验判断其是否符合 Hardy-Weinberg 平衡。不同基因型在两组人群及各亚组中的比较用 χ 2 检验。应用 SNPstats 软件分析单个 SNP 和尘肺的相关性，应用在线软件 SHEsis 进行各个位点的连锁不平衡分析和单体型分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病例组和对照组一般情况
病例组和对照组之间年龄、性别、工龄及吸烟史分布均衡，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表 1。
表1
研究对象的一般情况
2.2 Hardy-Weinberg 平衡检验
应用 Hardy-Weinberg 遗传平衡吻合度检验方法，分析对照组人群 IRGM 基因型遗传平衡情况，结果表明各位点的对照组数据差异无统计学意义（均 P>0.05），说明此次研究所选的样本具有较好的人群代表性。结果见表 2。
表2
IRGM 三个多态位点 Hardy-Weinberg 平衡检验结果
2.3 病例组与对照组 IRGM 基因型及等位基因分布情况
IRGM 基因 rs4958842、rs4958843、rs4958846 三个位点的测序图谱见图 1。表 3 展示了 IRGM 各位点基因型的分布情况。其中，rs4958842 位点的 AA、AG、GG 三种基因型和等位基因在病例组和对照组中的分布差异均无统计学意义（P>0.05）；rs4958843 位点的 CC、CT、TT 三种基因型和等位基因在病例组和对照组中的分布差异也无统计学意义（P>0.05）；rs4958846 位点的 TT、TC、CC 三种基因型和等位基因在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义（P<0.001），病例组中 TT 基因型的频率为 76.6%，显著高于对照组的 41.7%，而 TC、CC 基因型在对照组的频率分别为 41.8%、17.5%，显著高于病例组的 17.7%、5.6%。rs4958846 位点等位基因 T 和 C 在病例组的分布频率分别为 85.5%、14.5%，在对照组的分布频率为 61.6%、38.4%，差异有统计学意义（表 4）。
图1
各位点不同基因型测序图
表3
尘肺组与对照组 IRGM 各位点基因型分布比较
表4
尘肺组与对照组 IRGM 各位点等位基因分布比较
2.4 连锁不平衡和单体型分析
利用在线软件 SHEsis 分析基因之间的连锁不平衡 D'值和 r2 值，分析结果表明，IRGM 的三个基因位点 rs4958842、rs4958843、rs4958846 两两之间均存在连锁不平衡（D'>0.7，r2>0.3），说明三个位点遗传有关联性。结果见表 5。
表5
IRGM 基因位点之间连锁不平衡的 D'和 r2 值
采用软件 SHEsis 进一步分析单体型，IRGM 基因位点构建 4 个单体型，各个单体型在病例组和对照组的分布情况见表 6。结果显示 4 种单体型中，ACT 单体型在病例组频率分布明显高于对照组，而 ACC 单体型在病例组的频率分布明显低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），所构建的其他单体型在病例组和对照组中的分布差异无统计学意义（P>0.05）。
表6
IRGM 的 4 种单体型在病例组和对照组的分布频率
3 讨论
尘肺的发生是环境因素与个体因素综合作用的结果，因此即使在相同的暴露情况下，不同个体的反应也会有很大不同，有些人发病，有些人不发病。即使同为尘肺患者也会存在严重程度的差异，除了年龄、性别、营养状况、生化代谢差异以及是否患有结核和其他呼吸道疾病等因素对粉尘易感性存在影响外，遗传因素特别是基因的变异可能是造成个体对粉尘易感性差异的重要因素之一[4-5]。因此探讨尘肺的易感基因，筛选易感的高危人群，对尘肺的防治具有重要意义。
自噬在清除外来物质、自身细胞碎片、细胞器方面有重要作用[6]。有研究表明，尘粒沉积可引起巨噬细胞的自噬功能增强[7]。自噬对沉积物的清除功能渐渐受到关注，研究发现不同期别煤工尘肺患者的自噬活动强弱不同[8-9]，提示在游离 SiO2 粉尘刺激下，细胞除了经典的细胞凋亡反应之外，自噬和肺部纤维化的发生发展过程有密切联系。IRGM 基因通过调节自噬来清除胞内病原体，从而在自身免疫反应中起重要作用[10-11]。IRGM 基因多态性可能会影响自噬相关蛋白的表达，从而影响细胞自噬的反应性。伊朗学者发现 IRGM 启动子区–1161T/C 与–947T/C 位点与结核病易感性有关[12]；还有学者发现 IRGM 基因的 rs13361189、rs4958847 位点与欧美白种人的克罗恩病易感性有显著相关[13-14]。目前关于 IRGM 基因多态性是否与尘肺发生有关尚未见报道。此次研究我们选择 IRGM 基因的 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位点，分别研究三个位点与尘肺易感性的关系，对三个位点进行连锁不平衡分析并构建单体型，探讨所构单体型与尘肺易感性的关系。
本研究入选了 248 例尘肺患者为病例组，未患尘肺的 275 例接尘工人为对照组。两组在年龄、性别、吸烟情况、累计接尘工龄的差异均没有统计学意义，说明入组样本均衡可比。并且 IRGM 基因的 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位点在对照组的基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律，进一步说明所选样本具有较好的群体代表性。目前在中国人群中对 IRGM 基因多态性的探索只有来自中国北京学者的研究，他们发现 IRGM 的 rs4958842 位点与结核病易感性有关[15]。本次研究发现 IRGM 的 rs4958846 位点与尘肺的易感性相关，而 rs4958842、rs4958843 位点与尘肺的易感性没有关联。我们推测可能是由于 rs4958846 位点的突变，导致 IRGM 蛋白水平的降低，影响了 IRGM 对细胞自噬的调节，使机体对沉积物的清除能力减弱，所以此种人群更容易发生尘肺。rs4958846 基因位点 TT 基因型在尘肺组的频率高于对照组，而 TC 和 CC 基因型在对照组中的频率高于病例组，等位基因 T 和 C 在病例组和对照组的频率分布也有差异。以上结果说明 T 等位基因可能是尘肺的危险因素，而 C 等位基因可能是尘肺的保护因素。
我们分析了 IRGM 三个位点的连锁不平衡状态，结果显示 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位点两两之间均存在连锁不平衡，提示三个位点遗传有关联性，因此进一步构建单体型进行分析，发现 ACT 和 ACC 单体型在尘肺组和对照组的差异有统计学意义，提示 ACT 单体型可能与尘肺的发病风险增高有关，而 ACC 单体型则可能与尘肺的发病风险降低有关。这与中国北京学者 Che 等[15]的研究结果一致，他们发现 IRGM ACC 单体型与结核病的发病风险降低相关。
综上所述，本研究提示 IRGM 基因 rs4958846 位点 T 等位基因和 ACT 单体型可能与尘肺的易感性相关。但 IRGM 基因与尘肺之间的相关性探讨还需要对不同民族、种族、地区的人群进行分析，建立不同地区多态基因谱，扩大样本量进行验证，同时多态位点的更多生物学功能还可以在蛋白水平上进行深层探究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
尘肺是在生产过程中由于长时间吸入工作环境中的粉尘颗粒而引起的一种危害严重的职业病，表现为肺间质中成纤维细胞大量增殖以及细胞外基质胶原蛋白成分异常聚集[1-2]。免疫相关鸟苷三磷酸酶 M（immunity related GTPase M，IRGM）基因通过诱导细胞自噬调节机体免疫功能，可作为触发器启动连锁免疫反应，进而吞噬、消化外来有害物质，在细胞自噬性程序性死亡过程中起重要作用[3]。IRGM 基因多态性可能会影响自噬相关蛋白的表达，从而影响细胞自噬的反应性，而自噬和肺部纤维化的发生发展过程有密切关系。目前国内外对 IRGM 基因多态性位点与结核病、克罗恩病关系均有相关的研究，但关于 IRGM 基因多态性是否与尘肺有关尚未见报道。因此，探索自噬相关基因 IRGM 基因多态性是否与尘肺发病过程有关将有助于阐明尘肺的发病机制，为尘肺的防治提供新的策略。
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究对象分别来自 2016 年 6 月到 2018 年 12 月在湖北医药学院附属太和医院、十堰市职业病防治院就诊的鄂西北地区金矿、铁矿、煤矿的接尘工人，均为无血缘关系的汉族人。本次研究符合道德伦理并经湖北医药学院附属太和医院伦理委员会同意，全部研究对象签订知情同意书。病例组：根据我国最新尘肺病诊断标准（GBZ70-2015），确诊的尘肺患者作为病例组，一共有 248 例；对照组：以同性别、同民族、同一矿区、开始接尘时间和累积接尘工龄相近经证实未患尘肺的接尘工人为对照组，共 275 例。
1.2 方法
1.2.1 一般情况调查
采用自行设计的尘肺调查表对病例组和对照组进行调查，收集调查对象的基本资料，包括个人一般情况、疾病史、职业暴露史、吸烟史，以及尘肺患病情况等。按照世界卫生组织标准，连续或累积吸烟 6 个月或以上者为吸烟。
1.2.2 单核苷酸多态性位点的选择
利用 Haploview（version 4.0）软件，根据标签单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的挑选标准，采用 Tagger 软件选择 MAF≥0.05 的 SNP 位点；从 NCBI 及 HapMap 数据库中查找中国人群 IRGM 启动子区 SNP 及相关信息，并利用 Genetool 工具在 IRGM 基因上定位，筛选出中国人群 IRGM 启动子区 SNP。
1.2.3 基因型检测
采集静脉血 2 mL，采用 DNA 提取试剂盒提取 DNA，采用 TAKARA 公司 PrimeSTAR Max DNA Polymerase 试剂盒对提取的 DNA 进行 PCR 扩增，对所有 PCR 产物纯化并进行 Sanger 测序对所有 PCR 产物进行纯化并测序，测序引物为 PCR 扩增上游引物，测序结果与 GeneBank 进行比对。
1.3 统计学方法
用 Excel 建立数据库，采用 SPSS 18.0 统计软件。连续变量的比较用 t 检验，分类变量用 χ2 检验。对照组基因型用 χ2 拟合优度检验判断其是否符合 Hardy-Weinberg 平衡。不同基因型在两组人群及各亚组中的比较用 χ 2 检验。应用 SNPstats 软件分析单个 SNP 和尘肺的相关性，应用在线软件 SHEsis 进行各个位点的连锁不平衡分析和单体型分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病例组和对照组一般情况
病例组和对照组之间年龄、性别、工龄及吸烟史分布均衡，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表 1。
表1
研究对象的一般情况
2.2 Hardy-Weinberg 平衡检验
应用 Hardy-Weinberg 遗传平衡吻合度检验方法，分析对照组人群 IRGM 基因型遗传平衡情况，结果表明各位点的对照组数据差异无统计学意义（均 P>0.05），说明此次研究所选的样本具有较好的人群代表性。结果见表 2。
表2
IRGM 三个多态位点 Hardy-Weinberg 平衡检验结果
2.3 病例组与对照组 IRGM 基因型及等位基因分布情况
IRGM 基因 rs4958842、rs4958843、rs4958846 三个位点的测序图谱见图 1。表 3 展示了 IRGM 各位点基因型的分布情况。其中，rs4958842 位点的 AA、AG、GG 三种基因型和等位基因在病例组和对照组中的分布差异均无统计学意义（P>0.05）；rs4958843 位点的 CC、CT、TT 三种基因型和等位基因在病例组和对照组中的分布差异也无统计学意义（P>0.05）；rs4958846 位点的 TT、TC、CC 三种基因型和等位基因在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义（P<0.001），病例组中 TT 基因型的频率为 76.6%，显著高于对照组的 41.7%，而 TC、CC 基因型在对照组的频率分别为 41.8%、17.5%，显著高于病例组的 17.7%、5.6%。rs4958846 位点等位基因 T 和 C 在病例组的分布频率分别为 85.5%、14.5%，在对照组的分布频率为 61.6%、38.4%，差异有统计学意义（表 4）。
图1
各位点不同基因型测序图
表3
尘肺组与对照组 IRGM 各位点基因型分布比较
表4
尘肺组与对照组 IRGM 各位点等位基因分布比较
2.4 连锁不平衡和单体型分析
利用在线软件 SHEsis 分析基因之间的连锁不平衡 D'值和 r2 值，分析结果表明，IRGM 的三个基因位点 rs4958842、rs4958843、rs4958846 两两之间均存在连锁不平衡（D'>0.7，r2>0.3），说明三个位点遗传有关联性。结果见表 5。
表5
IRGM 基因位点之间连锁不平衡的 D'和 r2 值
采用软件 SHEsis 进一步分析单体型，IRGM 基因位点构建 4 个单体型，各个单体型在病例组和对照组的分布情况见表 6。结果显示 4 种单体型中，ACT 单体型在病例组频率分布明显高于对照组，而 ACC 单体型在病例组的频率分布明显低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），所构建的其他单体型在病例组和对照组中的分布差异无统计学意义（P>0.05）。
表6
IRGM 的 4 种单体型在病例组和对照组的分布频率
3 讨论
尘肺的发生是环境因素与个体因素综合作用的结果，因此即使在相同的暴露情况下，不同个体的反应也会有很大不同，有些人发病，有些人不发病。即使同为尘肺患者也会存在严重程度的差异，除了年龄、性别、营养状况、生化代谢差异以及是否患有结核和其他呼吸道疾病等因素对粉尘易感性存在影响外，遗传因素特别是基因的变异可能是造成个体对粉尘易感性差异的重要因素之一[4-5]。因此探讨尘肺的易感基因，筛选易感的高危人群，对尘肺的防治具有重要意义。
自噬在清除外来物质、自身细胞碎片、细胞器方面有重要作用[6]。有研究表明，尘粒沉积可引起巨噬细胞的自噬功能增强[7]。自噬对沉积物的清除功能渐渐受到关注，研究发现不同期别煤工尘肺患者的自噬活动强弱不同[8-9]，提示在游离 SiO2 粉尘刺激下，细胞除了经典的细胞凋亡反应之外，自噬和肺部纤维化的发生发展过程有密切联系。IRGM 基因通过调节自噬来清除胞内病原体，从而在自身免疫反应中起重要作用[10-11]。IRGM 基因多态性可能会影响自噬相关蛋白的表达，从而影响细胞自噬的反应性。伊朗学者发现 IRGM 启动子区–1161T/C 与–947T/C 位点与结核病易感性有关[12]；还有学者发现 IRGM 基因的 rs13361189、rs4958847 位点与欧美白种人的克罗恩病易感性有显著相关[13-14]。目前关于 IRGM 基因多态性是否与尘肺发生有关尚未见报道。此次研究我们选择 IRGM 基因的 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位点，分别研究三个位点与尘肺易感性的关系，对三个位点进行连锁不平衡分析并构建单体型，探讨所构单体型与尘肺易感性的关系。
本研究入选了 248 例尘肺患者为病例组，未患尘肺的 275 例接尘工人为对照组。两组在年龄、性别、吸烟情况、累计接尘工龄的差异均没有统计学意义，说明入组样本均衡可比。并且 IRGM 基因的 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位点在对照组的基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律，进一步说明所选样本具有较好的群体代表性。目前在中国人群中对 IRGM 基因多态性的探索只有来自中国北京学者的研究，他们发现 IRGM 的 rs4958842 位点与结核病易感性有关[15]。本次研究发现 IRGM 的 rs4958846 位点与尘肺的易感性相关，而 rs4958842、rs4958843 位点与尘肺的易感性没有关联。我们推测可能是由于 rs4958846 位点的突变，导致 IRGM 蛋白水平的降低，影响了 IRGM 对细胞自噬的调节，使机体对沉积物的清除能力减弱，所以此种人群更容易发生尘肺。rs4958846 基因位点 TT 基因型在尘肺组的频率高于对照组，而 TC 和 CC 基因型在对照组中的频率高于病例组，等位基因 T 和 C 在病例组和对照组的频率分布也有差异。以上结果说明 T 等位基因可能是尘肺的危险因素，而 C 等位基因可能是尘肺的保护因素。
我们分析了 IRGM 三个位点的连锁不平衡状态，结果显示 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位点两两之间均存在连锁不平衡，提示三个位点遗传有关联性，因此进一步构建单体型进行分析，发现 ACT 和 ACC 单体型在尘肺组和对照组的差异有统计学意义，提示 ACT 单体型可能与尘肺的发病风险增高有关，而 ACC 单体型则可能与尘肺的发病风险降低有关。这与中国北京学者 Che 等[15]的研究结果一致，他们发现 IRGM ACC 单体型与结核病的发病风险降低相关。
综上所述，本研究提示 IRGM 基因 rs4958846 位点 T 等位基因和 ACT 单体型可能与尘肺的易感性相关。但 IRGM 基因与尘肺之间的相关性探讨还需要对不同民族、种族、地区的人群进行分析，建立不同地区多态基因谱，扩大样本量进行验证，同时多态位点的更多生物学功能还可以在蛋白水平上进行深层探究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
