引用本文： 曾曼, 李琪, 周向东, 维克多·科罗索夫, 尤立·皮尔曼, 安德列·斯帕科. 冷刺激对细颗粒物致气道上皮炎症反应的增敏效应及冷诱导 RNA 结合蛋白的转录后调控机制. 中国呼吸与危重监护杂志, 2021, 20(3): 195-202. doi: 10.7507/1671-6205.202001023 复制
大量的流行病学研究证实，冷空气、大气污染物细颗粒物（PM2.5）与呼吸道炎症的发生、发展有着密切相关性[1-2]。在寒冷的北方地区，人体呼吸道对于 PM2.5 等不良刺激的侵袭均呈现易激惹状态，在短时间内常出现痰液大量分泌、气道炎症反应加重等病理生理改变[3]，从而导致呼吸道炎症急性发作的发病率均高于温暖地区，但其确切机制尚不明确。冷诱导 RNA 结合蛋白（CIRP）是一种冷应激反应蛋白，当机体受到冷空气、氧化应激及细菌病毒感染等各种环境刺激时，可通过一系列转录后调控机制调节机体的病理生理应激功能[4-6]。因此，我们推测 CIRP 是介导低温环境下 PM2.5 致气道炎性介质大规模释放的核心调节因素。本研究拟通过构建冷刺激及 PM2.5 染毒动物及细胞模型，探索 CIRP 参与的调控机制，以期为寒冷地区防治 PM2.5 污染导致的呼吸道炎症提供可能的干预靶点。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
大容量大气总颗粒物采样器（TH-150C 型，Andersen 公司，美国）；石英纤维滤膜（Whatman 公司，美国）；Wistar 大鼠，SPF 级，雌雄不限，4～6 周龄，体重（200±20）g［重庆医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（渝）2017-0002］；人支气管上皮细胞 16HBE（重庆医科大学基础医学研究所提供）；青–链霉素 100X、胎牛血清、RPMI1640 培养液（Hyclone，美国）；柠檬酸抗原修复液、DAB 显色液、二甲苯（赛维尔生物有限公司，武汉）；兔抗鼠 CIRP 单克隆抗体（Abcam，英国），兔抗鼠 β 肌球蛋白（β-actin）单克隆抗体（碧云天，上海），全蛋白提取试剂盒（索莱宝，北京），RNA 提取试剂盒（百泰克，北京），按 MMLV 第一链 cDNA 合成试剂盒（Thermo，美国），实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）试剂盒（TaKaRa，日本），山羊血清封闭液（蒙博，重庆），羊抗兔 FITC 标记的荧光素 IgG（兴悠，上海），酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（R&D Systems，美国）。所有引物均由上海生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 细胞的培养与实验分组
人支气管上皮细胞株 16HBE 用含 1% 青–链霉素 100X 和 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养液常规培养，置于含有 5% CO2 和 37 ℃ 培养箱内培养 48 h 后换液，待细胞融合至 70%～80% 时进行实验处理。把细胞培养瓶分别放置不同温度梯度的孵箱中（37 ℃、30 ℃、24 ℃、18 ℃、12 ℃）培养 24 h，根据 CIRP 蛋白表达量确定最适刺激温度（18 ℃）。设置不同的 PM2.5 终浓度梯度（对照组、0.1 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，PM2.5 颗粒的采集与悬浊液的制备方法参考文献[7]），分别给予不同终浓度的 PM2.5 悬浊液刺激 30 min 后放置培养箱孵育 24 h。根据 CIRP 蛋白表达量确定最适刺激浓度（5 mg/L）。再把细胞分成 4 组：空白对照组（无胎牛血清无双抗的培养液，37 ℃ 孵育 24 h），18 ℃ 组（无胎牛血清无双抗的培养液，18 ℃ 孵育 24 h），PM2.5 组（无胎牛血清无双抗的培养液，先滴加终浓度为 5 mg/L 的 PM2.5 悬浊液刺激细胞 30 min，37 ℃ 孵育 24 h），18 ℃+PM2.5 组（无胎牛血清无双抗的培养液，先滴加终浓度为 5 mg/L 的 PM2.5 悬浊液刺激 30 min，18 ℃ 孵育 24 h）。冷刺激后放入 37 ℃ 孵箱中复温 2 h，提取 16HBE 细胞培养上清液、总蛋白及总 RNA 继续后续实验。
1.2.2 动物实验的分组与染毒
鉴于冷空气从鼻孔吸入到终末细支气管其温度系呈梯度上升的，并非是统一的固定温度[8-10]，我们用纤维支气管镜将微型温度感受器放置于动物（犬）主支气管末端，并调整环境温度，发现即使是环境温度在 5 ℃ 时，大气道末端通常仍不低于 18 ℃，而细胞实验也证实 18 ℃ 系体外上皮细胞培养正常存活的必要温度，因此我们将动物模型的刺激温度定为 5 ℃，以保证大支气管末端温度达 18 ℃ 左右。PM2.5 悬浊液刺激浓度参考文献[7]设定为 40 mg/L）。实验随机分为 4 组（n=8），即空白对照组（37 ℃ 培养箱雾化吸入 6 mL 生理盐水），冷刺激组（5 ℃ 培养箱雾化吸入 6 mL 生理盐水），PM2.5 组（37 ℃ 培养箱超声雾化吸入 6 mL 终浓度为 40 mg/L 的 PM2.5 悬浊液，约 30 min/次，1 次/d，染毒时间持续 4 周），冷刺激+PM2.5 组（5 ℃ 培养箱超声雾化吸入 6 mL 终浓度为 40 mg/L 的 PM2.5 悬浊液，约 30 min/次，1 次/d，染毒时间持续 4 周）。第 28 天处死大鼠，剪开颈部皮肤，暴露气管，收集支气管肺泡灌洗液（BALF），剥离收集气管和肺脏，于–80 ℃ 冻存备用。
1.2.3 ELISA 检测大鼠 BALF 及细胞上清液白细胞介素-6 和肿瘤坏死因子-α 的含量
等量稀释标准蛋白样品后，在 96 孔板每孔加各组待测样品 100 μL，每个样品孔设 1 个空白对照组（只加 100 μL PBS 缓冲液）和 3 个复孔，分别吸取 BALF 上清液 0.1 mL 包被酶标板 4 ℃ 孵育 10～12 h，含吐温-20 的磷酸盐缓冲液（PBST）清洗，加入 2% 牛血清蛋白（BSA），37 ℃ 室温封闭 1 h，而后在 37 ℃ 中孵育白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）一抗 2 h，PBST 清洗后继续室温孵生物素–过氧化物酶（HRP）标记的二抗 1 h，洗板，加 TMB 避光显色 5～10 min 后加入 2 mol/L 硫酸溶液终止反应，在波长 450 nm 处测吸光度值，并与标准品比较计算目的蛋白的相对含量。
1.2.4 qPCR 法检测大鼠支气管/肺组织及细胞的 IL-6、TNF-α mRNA 的表达水平
相关引物见表 1。用 TRIzol 分别提取组织及 16HBE 细胞总 RNA，按 MMLV 第一链 cDNA 合成试剂盒和 qPCR 试剂盒说明书进行逆转录扩增，在 CFX96 Real-Time PCR Detection System 上进行 PCR 定量。参数设置：预变 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s（循环40 次），95 ℃ 10 s，熔解曲线 65 ℃→95 ℃，每 5 s 升温 0.5 ℃。采用 2–ΔΔCt方法分析目的基因 mRNA 相对表达量。Ct 是荧光达到荧光阈值的循环数，ΔΔCt=实验组（Ct目的基因–CtGAPDH）–对照组（Ct目的基因–CtGAPDH）。
表1
qPCR 的基因引物序列
1.2.5 蛋白印迹法检测大鼠肺/支气管组织及细胞各组 CIRP 蛋白表达水平
提取组织蛋白，将肺组织剪碎，加入 1 mL RIPA 裂解液（含 PMSF 和磷酸酶抑制剂），放于涡旋器振荡混匀，放置于冰上 10 min，4 ℃ 下 13000 r/min 离心 15 min。取含上清液转移至冷的新 EP 管，蛋白定量检测，加入标准上样缓冲液稀释至相同浓度，煮沸 10 min，–20 ℃ 保存备用。提取细胞蛋白，在细胞中加入冷裂解液（1 mL 裂解液配有 PMSF、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂各 10 μL），刮匙刮离细胞裂解液移入 EP 管，冰上裂解 30 min。4 ℃ 12000 g 离心 30 min，取上清液，BCA 法测定蛋白浓度。100 ℃ 煮沸 10 min 备用。于恒压 80 V 进行蛋白分离电泳，继而切胶，在电压 160 V，250 mA 恒流进行转膜 1 h。用 5% 脱脂奶粉封闭液摇床上封闭目的蛋白 2 h，然后与兔抗鼠 CIRP 单克隆抗体（1∶1000）以及兔抗鼠 β-actin 单克隆抗体（1∶1000）4 ℃ 孵育过夜，接着与相应二抗（1∶5000）室温孵育 6 min，漂洗后用 ECL 显色液进行显色，采集图像，用 Image lab 5.2.1 进行条带灰度值分析，并与内参 β-actin 条带的比值作为相对含量。
1.2.6 细胞免疫荧光法观察胞内 CIRP 分布的时相动力学规律
利用培养气道上皮细胞制爬片（具体操作方法参考文献[11]），实验分组同步骤 1.2.1，PBS 清洗，4% 多聚甲醛固定液固定 15 min，清洗，0.1% Triton-X100 室温破膜 30 min，清洗，山羊血清封闭液封闭 1 h，清洗，湿敷 CIRP 一抗（1∶1 000）过夜，清洗，在摇床上避光孵育羊抗兔 FITC（1∶100）标记的荧光素 IgG 1 h，清洗，甘油封片，荧光显微镜观察。
1.2.7 正常大鼠、冷刺激状态及 PM2.5 染毒大鼠支气管/肺组织的 CIRP 定位和表达情况
将四组石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ 15 min，二甲苯Ⅱ 15 min，二甲苯Ⅲ 15 min，无水乙醇Ⅰ 5 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，85% 酒精 5 min，75% 酒精 5 min，脱蜡至水。然后将组织切片置于柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）中于微波炉内进行抗原修复，而后把切片放入 3% 双氧水溶液，室温避光孵育 25 min，在组化标本内滴加 3% BSA 均匀覆盖组织，室温封闭 30 min，4 °C 湿孵一抗过夜，接着室温孵育 HRP 标记二抗，滴加 DAB 显色液，脱水封片，最后显微镜镜检，采集图像。
1.2.8 人体支气管/肺组织 CIRP 定位和表达情况
为检验 CIRP 在人体肺是否相应存在并发挥可能的作用，我们也观察了人体支气管/肺组织 CIRP 的定位和表达情况。24 例标本来自 2018 年 1 月至 2018 年 3 月在广州中山肿瘤医院因早期肺癌行切除术的患者，选取癌旁组织（距癌灶>5 cm），慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）为 14 例，对照组（非慢阻肺组）10 例。本研究所用组织标本已由责任医师取得患方同意并签署处理组织标本知情同意书。免疫组织化学实验同步骤 1.2.7，阴性对照组为非免疫源性兔 IgG 代替一抗。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 24.0 统计软件，服从正态分布的计量资料数据以均数±标准差（
±s）表示，行单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同温度梯度及不同 PM2.5 浓度梯度下 CIRP 蛋白在 16HBE 细胞中的表达水平及其最适条件
CIRP 的表达量在 30 ℃/0.1 mg/L PM2.5 刺激下相较于对照组有增多趋势，在 24 ℃/1 mg/L PM2.5 刺激下相较于对照组明显增多，在 18 ℃/5 mg/L PM2.5 刺激下相较于对照组 CIRP 表达量增多最为显著，而 12 ℃/10 mg/L PM2.5 刺激下 CIRP 表达量呈下降趋势，故 18 ℃/5 mg/L PM2.5 分别为最适刺激温度和浓度。结果见图 1。
图1
不同温度及浓度刺激下 16HBE 细胞内 CIRP 蛋白的表达量
CIRP（温度）：1. 对照组；2. 30 ℃ 组；3. 24 ℃ 组；4. 18 ℃ 组；5. 12 ℃ 组；CIRP（浓度）：1. 对照组；2. 0.1 mg/L 组；3. 1 mg/L 组；4. 5 mg/L 组；5. 10 mg/L 组。
2.2 各组大鼠支气管/肺组织、细胞的细胞炎症因子分泌水平以及 CIRP mRNA 和蛋白表达水平
相较于对照组，5 ℃/18 ℃ 组和 PM2.5 组的 CIRP、IL-6、TNF-α mRNA 及蛋白表达量均有增加，而 5 ℃/18 ℃+PM2.5 组 CIRP、IL-6、TNF-α mRNA 及蛋白表达量更为显著。结果见表 2 和图 2。
表2
在体和离体实验各组炎性因子与 CIRP mRNA 及相关蛋白的表达水平（n=8，
）
图2
蛋白印迹法检测在体和离体实验各组 CIRP 蛋白的表达量
1. 对照组；2. 5 ℃/18 ℃ 组；3. PM2.5 组；4. 5 ℃/18 ℃+ PM2.5 组
2.3 细胞免疫荧光技术观察不同条件下 CIRP 胞内分布的时相动力学规律
在对照组中，CIRP 的主要大量表达于胞核内（图 3a），在实验组中给予 24 h 18 ℃ 冷空气刺激时，胞核内的 CIRP 荧光强度变亮，胞浆中的 CIRP 表达量有增多趋势（图 3b）。单独给予 PM2.5 刺激时，胞核内的 CIRP 荧光强度相较于对照组也明显增强，胞浆中的 CIRP 蛋白表达量有增多趋势（图 3c）。而后给予 24 h 18 ℃+PM2.5 刺激细胞时，胞核中的 CIRP 蛋白表达量明显增多，胞浆中的 CIRP 表达量也明显增多，胞核位移现象更为显著（图 3d）。
图3
不同条件下 CIRP 分布的时相动力学规律（FITC 荧光染色×400）
a. 对照组；b. 18 ℃ 组；c. PM2.5 组；d. 18 ℃+ PM2.5 组。在对照组中，CIRP 的主要大量表达于胞核内，在实验组中给予 24 h 18 ℃ 冷空气刺激时，胞核内的 CIRP 荧光强度变亮，胞浆中的 CIRP 表达量有增多趋势。单独给予 PM2.5 刺激时，胞核内的 CIRP 荧光强度相较于对照组也明显增强，胞浆中的 CIRP 蛋白表达量有增多趋势。而后给予 24 h 18 ℃+PM2.5 刺激细胞时，胞核中的 CIRP 蛋白表达量明显增多，胞浆中的 CIRP 表达量也明显增多，胞核位移现象更为显著。
2.4 各组大鼠支气管/肺组织中 CIRP 定位及蛋白表达情况
CIRP 在大鼠支气管/肺组织上皮黏膜中均有表达，且主要位于气道黏膜上皮细胞胞核内，冷刺激后，CIRP 蛋白的表达水平（图 4b）显著高于对照组（图 4a），在 PM2.5 的单独刺激下，CIRP 表达（图 4c）相较于对照组也明显增加，而在冷刺激的基础上给予 PM2.5 染毒使得 CIRP 的表达量（图 4d）变化最为显著。阴性对照组为非免疫源性兔 IgG 代替 CIRP 一抗，可见无明显棕黄色颗粒沉积（图 4e）。
图4
各组大鼠支气管/肺组织 CIRP 的定位及表达情况（免疫组织化学×400）
a. 对照组；b. 5 ℃ 组；c. PM2.5 组；d. 5 ℃+ PM2.5 组；e. 阴性对照组。各组大鼠支气管/肺组织上皮黏膜中均有表达，且主要位于气道黏膜上皮细胞胞核内，冷刺激后，CIRP 蛋白的表达水平显著高于对照组，在冷刺激的基础上给予 PM2.5 染毒使得 CIRP 的表达量变化最为显著。阴性对照组无明显棕黄色颗粒沉积。
2.5 CIRP 在正常人群及慢阻肺患者气道黏膜上皮中的定位及蛋白表达情况
CIRP 在正常人群和慢阻肺患者支气管上皮黏膜中均有表达（图 5a、b），有棕黄色颗粒染色的细胞为 CIRP 阳性表达，其主要位于气道黏膜上皮细胞胞核内。慢阻肺组（图 5b）中的气道上皮细胞的 CIRP 的表达量较正常对照组（图 5a）明显增加。阴性对照组为非免疫源性兔 IgG 代替 CIRP 一抗，可见无棕黄色颗粒沉积（图 5c）。
图5
在正常人群及慢阻肺患者中比较 CIRP 在气道黏膜上皮的定位及表达情况（免疫组织化学×400）
a. 对照组；b. 慢阻肺组；c. 阴性对照组。慢阻肺组的气道上皮细胞的 CIRP 的表达量较正常对照组明显增加，阴性对照组无棕黄色颗粒沉积。
3 讨论
持续性的冷空气刺激能引起气道巨噬细胞活化、中性粒细胞募集、炎性因子增多等一系列病理生理改变[12-13]。而与此同时大气中不同粒径大小的颗粒物也可以对机体健康产生影响，尤其 PM2.5，其比表面积大易于富集空气中的有毒物质，并随呼吸进入细支气管和肺泡，对气道上皮产生有害影响[14-15]。CIRP 是一种冷诱导 RNA 结合蛋白[16]，当机体受缺氧、冷刺激、有毒物质、紫外线照射等损害时 CIRP 可参与发生多种生理病理反应[4，17-19]。CIRP 常伴随冷应激过程大量表达，并通过剪切 mRNA、终止翻译、出核、胞内位移和调节稳定性等转录后调控机制影响细胞生理应激功能[5，20-21]。已有较多学者致力于 CIRP 介导的冷应激研究，但是在低温环境背景下，机体为何呈现易激惹状态，对于外界污染物 PM2.5 的再次侵袭会即刻出现泄洪式的炎性反应？冷空气和大气细颗粒物两因素在时空分布上的重叠是如何使人类呼吸道呈高度敏感状态？对这些问题目前并无确切的解释。
本实验通过构建寒冷刺激和 PM2.5 染毒动物及细胞模型，以冷诱导蛋白 CIRP 以及相关炎症因子 IL-6、TNF-α 为靶向目标进行研究。首先，本研究通过设计不同的温度梯度以及不同的 PM2.5 悬浊液浓度梯度的实验，明确了细胞模型的最适刺激温度为 18 ℃，其最适 PM2.5 悬浊液刺激浓度为 5 mg/L。此外，由于我们曾用纤维支气管镜将微型温度感受仪放置于动物（犬）的主支气管末端，并尝试调整环境温度，发现即使是环境温度在 5 ℃ 时，大气道末端通常仍不低于 18 ℃。而且已有研究证实气道具有加温加湿的作用，从鼻孔中吸入冷空气到终末细支气管其空气温度系呈梯度上升的，并非是统一的固定温度[8-10]。而我们的细胞实验证实 18 ℃ 系体外上皮细胞培养正常存活的必要温度，因此我们将动物实验的刺激温度定为 5 ℃，以保证大支气管末端温度达 18 ℃ 左右。以冷刺激和 PM2.5 为诱导因素，本实验采用蛋白印迹法明确了动物及细胞实验中两组诱导因素的叠加作用使得 CIRP 的表达量相较于对照组、冷刺激组、PM2.5 组均有显著升高，再次提示 CIRP 参与了冷刺激对 PM2.5 所致气道上皮炎症反应有增敏效应的调控。接着，以 IL-6、TNF-α 作为炎症反应强度的观察的指标，以 qPCR、ELISA 检测动物及细胞炎症因子转录水平及相关蛋白表达量，结果显示暴露于冷刺激以及 PM2.5 污染环境均会导致机体炎症因子表达增多，而机体在冷空气的刺激后再次受到空气污染物 PM2.5 的侵袭时炎性因子的转录水平以及翻译效率大大提升。由此提示在冷空气下，CIRP 可对 IL-6、TNF-α 等炎性因子以及自身的 mRNA 进行剪切，暂时终止翻译，并通过多种信号蛋白的帮助运输到胞浆中储存；当机体再次受到空气污染物 PM2.5 的侵袭时，存储于胞浆中的炎性因子 mRNA 可直接转录或翻译，从而使机体出现泄洪式炎症反应，进一步提高了其应激反应的效率。
其次，本实验以细胞免疫荧光法观察各组细胞胞内 CIRP 分布的时相动力学规律，发现 CIRP 主要定位于胞核内，18 ℃ 组和 PM2.5 组单独受刺激后细胞 CIRP 蛋白有出核至胞浆的趋势，而 18 ℃+PM2.5 组 CIRP 蛋白移位现象更为显著。这提示真核细胞受到冷空气刺激，部分 CIRP 从胞核转移至胞浆，并介导相关炎症因子以 mRNA 的形式储存于胞浆中；当机体再次受到大气污染物 PM2.5 的侵袭时，位于胞浆中的 CIRP 能诱导炎性因子 mRNA 迅速进入翻译状态，从而在短时间内出现痰液大量分泌和炎性介质大量浸润，引起气道上皮的炎性损伤，进一步扩大不良刺激及致病因素致呼吸道损害的效应。
最后，本研究利用免疫组织化学方法检测了各组大鼠支气管/肺组织中 CIRP 的定位以及表达水平，结果显示 CIRP 在大鼠支气管/肺组织上皮黏膜中均有表达，且主要位于气道黏膜上皮细胞胞核内；5 ℃ 组以及 PM2.5 染毒组的单独刺激均使得 CIRP 的表达水平有增高趋势；而在持续地冷刺激后再给予大鼠 PM2.5 侵袭时，支气管/肺组织内 CIRP 的表达量大幅度增加，这提示了冷空气持续地刺激下 CIRP 表达量增多，维持机体呼吸道的敏感状态，使其能够对 PM2.5 等突袭而来的伤害性刺激作出快速应答反应，从而起到储备性自主防御的作用。此外，为了验证 CIRP 在人体肺组织也相应存在并发挥可能的作用，我们还对正常人群以及慢阻肺患者进行标本采集，观察了人体支气管/肺组织 CIRP 的定位和表达情况。当然，由于人体研究的伦理要求，无法做到细胞和动物实验相应的分组和干预条件，只是就简单区分的目标人群进行了观察。研究证实了 CIRP 蛋白在人支气管气道上皮有所表达，主要富集于支气管管腔；同时发现相较于正常人群，罹患慢性呼吸道炎症的患者其 CIRP 的表达量明显增多，提示 CIRP 与组织感染、黏液分泌等一系列炎性反应症状的进展和预后有密切关系。
综上，本研究证实了在低温环境下 CIRP 的时相变化是真核生物应对严峻环境胁迫时自主呈现的一种重要的转录后细胞保护机制，明确 CIRP 参与了冷刺激对 PM2.5 致气道上皮炎症反应的增敏效应。这不仅对阐明机体的转录后调控机制具有重要研究意义及临床价值，亦有助于进一步诠释大气污染对气道的健康效应，且能为寒冷地区空气污染导致呼吸道炎症的防控提供理论依据。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
大量的流行病学研究证实，冷空气、大气污染物细颗粒物（PM2.5）与呼吸道炎症的发生、发展有着密切相关性[1-2]。在寒冷的北方地区，人体呼吸道对于 PM2.5 等不良刺激的侵袭均呈现易激惹状态，在短时间内常出现痰液大量分泌、气道炎症反应加重等病理生理改变[3]，从而导致呼吸道炎症急性发作的发病率均高于温暖地区，但其确切机制尚不明确。冷诱导 RNA 结合蛋白（CIRP）是一种冷应激反应蛋白，当机体受到冷空气、氧化应激及细菌病毒感染等各种环境刺激时，可通过一系列转录后调控机制调节机体的病理生理应激功能[4-6]。因此，我们推测 CIRP 是介导低温环境下 PM2.5 致气道炎性介质大规模释放的核心调节因素。本研究拟通过构建冷刺激及 PM2.5 染毒动物及细胞模型，探索 CIRP 参与的调控机制，以期为寒冷地区防治 PM2.5 污染导致的呼吸道炎症提供可能的干预靶点。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
大容量大气总颗粒物采样器（TH-150C 型，Andersen 公司，美国）；石英纤维滤膜（Whatman 公司，美国）；Wistar 大鼠，SPF 级，雌雄不限，4～6 周龄，体重（200±20）g［重庆医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（渝）2017-0002］；人支气管上皮细胞 16HBE（重庆医科大学基础医学研究所提供）；青–链霉素 100X、胎牛血清、RPMI1640 培养液（Hyclone，美国）；柠檬酸抗原修复液、DAB 显色液、二甲苯（赛维尔生物有限公司，武汉）；兔抗鼠 CIRP 单克隆抗体（Abcam，英国），兔抗鼠 β 肌球蛋白（β-actin）单克隆抗体（碧云天，上海），全蛋白提取试剂盒（索莱宝，北京），RNA 提取试剂盒（百泰克，北京），按 MMLV 第一链 cDNA 合成试剂盒（Thermo，美国），实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）试剂盒（TaKaRa，日本），山羊血清封闭液（蒙博，重庆），羊抗兔 FITC 标记的荧光素 IgG（兴悠，上海），酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（R&D Systems，美国）。所有引物均由上海生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 细胞的培养与实验分组
人支气管上皮细胞株 16HBE 用含 1% 青–链霉素 100X 和 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养液常规培养，置于含有 5% CO2 和 37 ℃ 培养箱内培养 48 h 后换液，待细胞融合至 70%～80% 时进行实验处理。把细胞培养瓶分别放置不同温度梯度的孵箱中（37 ℃、30 ℃、24 ℃、18 ℃、12 ℃）培养 24 h，根据 CIRP 蛋白表达量确定最适刺激温度（18 ℃）。设置不同的 PM2.5 终浓度梯度（对照组、0.1 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，PM2.5 颗粒的采集与悬浊液的制备方法参考文献[7]），分别给予不同终浓度的 PM2.5 悬浊液刺激 30 min 后放置培养箱孵育 24 h。根据 CIRP 蛋白表达量确定最适刺激浓度（5 mg/L）。再把细胞分成 4 组：空白对照组（无胎牛血清无双抗的培养液，37 ℃ 孵育 24 h），18 ℃ 组（无胎牛血清无双抗的培养液，18 ℃ 孵育 24 h），PM2.5 组（无胎牛血清无双抗的培养液，先滴加终浓度为 5 mg/L 的 PM2.5 悬浊液刺激细胞 30 min，37 ℃ 孵育 24 h），18 ℃+PM2.5 组（无胎牛血清无双抗的培养液，先滴加终浓度为 5 mg/L 的 PM2.5 悬浊液刺激 30 min，18 ℃ 孵育 24 h）。冷刺激后放入 37 ℃ 孵箱中复温 2 h，提取 16HBE 细胞培养上清液、总蛋白及总 RNA 继续后续实验。
1.2.2 动物实验的分组与染毒
鉴于冷空气从鼻孔吸入到终末细支气管其温度系呈梯度上升的，并非是统一的固定温度[8-10]，我们用纤维支气管镜将微型温度感受器放置于动物（犬）主支气管末端，并调整环境温度，发现即使是环境温度在 5 ℃ 时，大气道末端通常仍不低于 18 ℃，而细胞实验也证实 18 ℃ 系体外上皮细胞培养正常存活的必要温度，因此我们将动物模型的刺激温度定为 5 ℃，以保证大支气管末端温度达 18 ℃ 左右。PM2.5 悬浊液刺激浓度参考文献[7]设定为 40 mg/L）。实验随机分为 4 组（n=8），即空白对照组（37 ℃ 培养箱雾化吸入 6 mL 生理盐水），冷刺激组（5 ℃ 培养箱雾化吸入 6 mL 生理盐水），PM2.5 组（37 ℃ 培养箱超声雾化吸入 6 mL 终浓度为 40 mg/L 的 PM2.5 悬浊液，约 30 min/次，1 次/d，染毒时间持续 4 周），冷刺激+PM2.5 组（5 ℃ 培养箱超声雾化吸入 6 mL 终浓度为 40 mg/L 的 PM2.5 悬浊液，约 30 min/次，1 次/d，染毒时间持续 4 周）。第 28 天处死大鼠，剪开颈部皮肤，暴露气管，收集支气管肺泡灌洗液（BALF），剥离收集气管和肺脏，于–80 ℃ 冻存备用。
1.2.3 ELISA 检测大鼠 BALF 及细胞上清液白细胞介素-6 和肿瘤坏死因子-α 的含量
等量稀释标准蛋白样品后，在 96 孔板每孔加各组待测样品 100 μL，每个样品孔设 1 个空白对照组（只加 100 μL PBS 缓冲液）和 3 个复孔，分别吸取 BALF 上清液 0.1 mL 包被酶标板 4 ℃ 孵育 10～12 h，含吐温-20 的磷酸盐缓冲液（PBST）清洗，加入 2% 牛血清蛋白（BSA），37 ℃ 室温封闭 1 h，而后在 37 ℃ 中孵育白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）一抗 2 h，PBST 清洗后继续室温孵生物素–过氧化物酶（HRP）标记的二抗 1 h，洗板，加 TMB 避光显色 5～10 min 后加入 2 mol/L 硫酸溶液终止反应，在波长 450 nm 处测吸光度值，并与标准品比较计算目的蛋白的相对含量。
1.2.4 qPCR 法检测大鼠支气管/肺组织及细胞的 IL-6、TNF-α mRNA 的表达水平
相关引物见表 1。用 TRIzol 分别提取组织及 16HBE 细胞总 RNA，按 MMLV 第一链 cDNA 合成试剂盒和 qPCR 试剂盒说明书进行逆转录扩增，在 CFX96 Real-Time PCR Detection System 上进行 PCR 定量。参数设置：预变 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s（循环40 次），95 ℃ 10 s，熔解曲线 65 ℃→95 ℃，每 5 s 升温 0.5 ℃。采用 2–ΔΔCt方法分析目的基因 mRNA 相对表达量。Ct 是荧光达到荧光阈值的循环数，ΔΔCt=实验组（Ct目的基因–CtGAPDH）–对照组（Ct目的基因–CtGAPDH）。
表1
qPCR 的基因引物序列
1.2.5 蛋白印迹法检测大鼠肺/支气管组织及细胞各组 CIRP 蛋白表达水平
提取组织蛋白，将肺组织剪碎，加入 1 mL RIPA 裂解液（含 PMSF 和磷酸酶抑制剂），放于涡旋器振荡混匀，放置于冰上 10 min，4 ℃ 下 13000 r/min 离心 15 min。取含上清液转移至冷的新 EP 管，蛋白定量检测，加入标准上样缓冲液稀释至相同浓度，煮沸 10 min，–20 ℃ 保存备用。提取细胞蛋白，在细胞中加入冷裂解液（1 mL 裂解液配有 PMSF、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂各 10 μL），刮匙刮离细胞裂解液移入 EP 管，冰上裂解 30 min。4 ℃ 12000 g 离心 30 min，取上清液，BCA 法测定蛋白浓度。100 ℃ 煮沸 10 min 备用。于恒压 80 V 进行蛋白分离电泳，继而切胶，在电压 160 V，250 mA 恒流进行转膜 1 h。用 5% 脱脂奶粉封闭液摇床上封闭目的蛋白 2 h，然后与兔抗鼠 CIRP 单克隆抗体（1∶1000）以及兔抗鼠 β-actin 单克隆抗体（1∶1000）4 ℃ 孵育过夜，接着与相应二抗（1∶5000）室温孵育 6 min，漂洗后用 ECL 显色液进行显色，采集图像，用 Image lab 5.2.1 进行条带灰度值分析，并与内参 β-actin 条带的比值作为相对含量。
1.2.6 细胞免疫荧光法观察胞内 CIRP 分布的时相动力学规律
利用培养气道上皮细胞制爬片（具体操作方法参考文献[11]），实验分组同步骤 1.2.1，PBS 清洗，4% 多聚甲醛固定液固定 15 min，清洗，0.1% Triton-X100 室温破膜 30 min，清洗，山羊血清封闭液封闭 1 h，清洗，湿敷 CIRP 一抗（1∶1 000）过夜，清洗，在摇床上避光孵育羊抗兔 FITC（1∶100）标记的荧光素 IgG 1 h，清洗，甘油封片，荧光显微镜观察。
1.2.7 正常大鼠、冷刺激状态及 PM2.5 染毒大鼠支气管/肺组织的 CIRP 定位和表达情况
将四组石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ 15 min，二甲苯Ⅱ 15 min，二甲苯Ⅲ 15 min，无水乙醇Ⅰ 5 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，85% 酒精 5 min，75% 酒精 5 min，脱蜡至水。然后将组织切片置于柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）中于微波炉内进行抗原修复，而后把切片放入 3% 双氧水溶液，室温避光孵育 25 min，在组化标本内滴加 3% BSA 均匀覆盖组织，室温封闭 30 min，4 °C 湿孵一抗过夜，接着室温孵育 HRP 标记二抗，滴加 DAB 显色液，脱水封片，最后显微镜镜检，采集图像。
1.2.8 人体支气管/肺组织 CIRP 定位和表达情况
为检验 CIRP 在人体肺是否相应存在并发挥可能的作用，我们也观察了人体支气管/肺组织 CIRP 的定位和表达情况。24 例标本来自 2018 年 1 月至 2018 年 3 月在广州中山肿瘤医院因早期肺癌行切除术的患者，选取癌旁组织（距癌灶>5 cm），慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）为 14 例，对照组（非慢阻肺组）10 例。本研究所用组织标本已由责任医师取得患方同意并签署处理组织标本知情同意书。免疫组织化学实验同步骤 1.2.7，阴性对照组为非免疫源性兔 IgG 代替一抗。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 24.0 统计软件，服从正态分布的计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，行单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同温度梯度及不同 PM2.5 浓度梯度下 CIRP 蛋白在 16HBE 细胞中的表达水平及其最适条件
CIRP 的表达量在 30 ℃/0.1 mg/L PM2.5 刺激下相较于对照组有增多趋势，在 24 ℃/1 mg/L PM2.5 刺激下相较于对照组明显增多，在 18 ℃/5 mg/L PM2.5 刺激下相较于对照组 CIRP 表达量增多最为显著，而 12 ℃/10 mg/L PM2.5 刺激下 CIRP 表达量呈下降趋势，故 18 ℃/5 mg/L PM2.5 分别为最适刺激温度和浓度。结果见图 1。
图1
不同温度及浓度刺激下 16HBE 细胞内 CIRP 蛋白的表达量
CIRP（温度）：1. 对照组；2. 30 ℃ 组；3. 24 ℃ 组；4. 18 ℃ 组；5. 12 ℃ 组；CIRP（浓度）：1. 对照组；2. 0.1 mg/L 组；3. 1 mg/L 组；4. 5 mg/L 组；5. 10 mg/L 组。
2.2 各组大鼠支气管/肺组织、细胞的细胞炎症因子分泌水平以及 CIRP mRNA 和蛋白表达水平
相较于对照组，5 ℃/18 ℃ 组和 PM2.5 组的 CIRP、IL-6、TNF-α mRNA 及蛋白表达量均有增加，而 5 ℃/18 ℃+PM2.5 组 CIRP、IL-6、TNF-α mRNA 及蛋白表达量更为显著。结果见表 2 和图 2。
表2
在体和离体实验各组炎性因子与 CIRP mRNA 及相关蛋白的表达水平（n=8，）
图2
蛋白印迹法检测在体和离体实验各组 CIRP 蛋白的表达量
1. 对照组；2. 5 ℃/18 ℃ 组；3. PM2.5 组；4. 5 ℃/18 ℃+ PM2.5 组
2.3 细胞免疫荧光技术观察不同条件下 CIRP 胞内分布的时相动力学规律
在对照组中，CIRP 的主要大量表达于胞核内（图 3a），在实验组中给予 24 h 18 ℃ 冷空气刺激时，胞核内的 CIRP 荧光强度变亮，胞浆中的 CIRP 表达量有增多趋势（图 3b）。单独给予 PM2.5 刺激时，胞核内的 CIRP 荧光强度相较于对照组也明显增强，胞浆中的 CIRP 蛋白表达量有增多趋势（图 3c）。而后给予 24 h 18 ℃+PM2.5 刺激细胞时，胞核中的 CIRP 蛋白表达量明显增多，胞浆中的 CIRP 表达量也明显增多，胞核位移现象更为显著（图 3d）。
图3
不同条件下 CIRP 分布的时相动力学规律（FITC 荧光染色×400）
a. 对照组；b. 18 ℃ 组；c. PM2.5 组；d. 18 ℃+ PM2.5 组。在对照组中，CIRP 的主要大量表达于胞核内，在实验组中给予 24 h 18 ℃ 冷空气刺激时，胞核内的 CIRP 荧光强度变亮，胞浆中的 CIRP 表达量有增多趋势。单独给予 PM2.5 刺激时，胞核内的 CIRP 荧光强度相较于对照组也明显增强，胞浆中的 CIRP 蛋白表达量有增多趋势。而后给予 24 h 18 ℃+PM2.5 刺激细胞时，胞核中的 CIRP 蛋白表达量明显增多，胞浆中的 CIRP 表达量也明显增多，胞核位移现象更为显著。
2.4 各组大鼠支气管/肺组织中 CIRP 定位及蛋白表达情况
CIRP 在大鼠支气管/肺组织上皮黏膜中均有表达，且主要位于气道黏膜上皮细胞胞核内，冷刺激后，CIRP 蛋白的表达水平（图 4b）显著高于对照组（图 4a），在 PM2.5 的单独刺激下，CIRP 表达（图 4c）相较于对照组也明显增加，而在冷刺激的基础上给予 PM2.5 染毒使得 CIRP 的表达量（图 4d）变化最为显著。阴性对照组为非免疫源性兔 IgG 代替 CIRP 一抗，可见无明显棕黄色颗粒沉积（图 4e）。
图4
各组大鼠支气管/肺组织 CIRP 的定位及表达情况（免疫组织化学×400）
a. 对照组；b. 5 ℃ 组；c. PM2.5 组；d. 5 ℃+ PM2.5 组；e. 阴性对照组。各组大鼠支气管/肺组织上皮黏膜中均有表达，且主要位于气道黏膜上皮细胞胞核内，冷刺激后，CIRP 蛋白的表达水平显著高于对照组，在冷刺激的基础上给予 PM2.5 染毒使得 CIRP 的表达量变化最为显著。阴性对照组无明显棕黄色颗粒沉积。
2.5 CIRP 在正常人群及慢阻肺患者气道黏膜上皮中的定位及蛋白表达情况
CIRP 在正常人群和慢阻肺患者支气管上皮黏膜中均有表达（图 5a、b），有棕黄色颗粒染色的细胞为 CIRP 阳性表达，其主要位于气道黏膜上皮细胞胞核内。慢阻肺组（图 5b）中的气道上皮细胞的 CIRP 的表达量较正常对照组（图 5a）明显增加。阴性对照组为非免疫源性兔 IgG 代替 CIRP 一抗，可见无棕黄色颗粒沉积（图 5c）。
图5
在正常人群及慢阻肺患者中比较 CIRP 在气道黏膜上皮的定位及表达情况（免疫组织化学×400）
a. 对照组；b. 慢阻肺组；c. 阴性对照组。慢阻肺组的气道上皮细胞的 CIRP 的表达量较正常对照组明显增加，阴性对照组无棕黄色颗粒沉积。
3 讨论
持续性的冷空气刺激能引起气道巨噬细胞活化、中性粒细胞募集、炎性因子增多等一系列病理生理改变[12-13]。而与此同时大气中不同粒径大小的颗粒物也可以对机体健康产生影响，尤其 PM2.5，其比表面积大易于富集空气中的有毒物质，并随呼吸进入细支气管和肺泡，对气道上皮产生有害影响[14-15]。CIRP 是一种冷诱导 RNA 结合蛋白[16]，当机体受缺氧、冷刺激、有毒物质、紫外线照射等损害时 CIRP 可参与发生多种生理病理反应[4，17-19]。CIRP 常伴随冷应激过程大量表达，并通过剪切 mRNA、终止翻译、出核、胞内位移和调节稳定性等转录后调控机制影响细胞生理应激功能[5，20-21]。已有较多学者致力于 CIRP 介导的冷应激研究，但是在低温环境背景下，机体为何呈现易激惹状态，对于外界污染物 PM2.5 的再次侵袭会即刻出现泄洪式的炎性反应？冷空气和大气细颗粒物两因素在时空分布上的重叠是如何使人类呼吸道呈高度敏感状态？对这些问题目前并无确切的解释。
本实验通过构建寒冷刺激和 PM2.5 染毒动物及细胞模型，以冷诱导蛋白 CIRP 以及相关炎症因子 IL-6、TNF-α 为靶向目标进行研究。首先，本研究通过设计不同的温度梯度以及不同的 PM2.5 悬浊液浓度梯度的实验，明确了细胞模型的最适刺激温度为 18 ℃，其最适 PM2.5 悬浊液刺激浓度为 5 mg/L。此外，由于我们曾用纤维支气管镜将微型温度感受仪放置于动物（犬）的主支气管末端，并尝试调整环境温度，发现即使是环境温度在 5 ℃ 时，大气道末端通常仍不低于 18 ℃。而且已有研究证实气道具有加温加湿的作用，从鼻孔中吸入冷空气到终末细支气管其空气温度系呈梯度上升的，并非是统一的固定温度[8-10]。而我们的细胞实验证实 18 ℃ 系体外上皮细胞培养正常存活的必要温度，因此我们将动物实验的刺激温度定为 5 ℃，以保证大支气管末端温度达 18 ℃ 左右。以冷刺激和 PM2.5 为诱导因素，本实验采用蛋白印迹法明确了动物及细胞实验中两组诱导因素的叠加作用使得 CIRP 的表达量相较于对照组、冷刺激组、PM2.5 组均有显著升高，再次提示 CIRP 参与了冷刺激对 PM2.5 所致气道上皮炎症反应有增敏效应的调控。接着，以 IL-6、TNF-α 作为炎症反应强度的观察的指标，以 qPCR、ELISA 检测动物及细胞炎症因子转录水平及相关蛋白表达量，结果显示暴露于冷刺激以及 PM2.5 污染环境均会导致机体炎症因子表达增多，而机体在冷空气的刺激后再次受到空气污染物 PM2.5 的侵袭时炎性因子的转录水平以及翻译效率大大提升。由此提示在冷空气下，CIRP 可对 IL-6、TNF-α 等炎性因子以及自身的 mRNA 进行剪切，暂时终止翻译，并通过多种信号蛋白的帮助运输到胞浆中储存；当机体再次受到空气污染物 PM2.5 的侵袭时，存储于胞浆中的炎性因子 mRNA 可直接转录或翻译，从而使机体出现泄洪式炎症反应，进一步提高了其应激反应的效率。
其次，本实验以细胞免疫荧光法观察各组细胞胞内 CIRP 分布的时相动力学规律，发现 CIRP 主要定位于胞核内，18 ℃ 组和 PM2.5 组单独受刺激后细胞 CIRP 蛋白有出核至胞浆的趋势，而 18 ℃+PM2.5 组 CIRP 蛋白移位现象更为显著。这提示真核细胞受到冷空气刺激，部分 CIRP 从胞核转移至胞浆，并介导相关炎症因子以 mRNA 的形式储存于胞浆中；当机体再次受到大气污染物 PM2.5 的侵袭时，位于胞浆中的 CIRP 能诱导炎性因子 mRNA 迅速进入翻译状态，从而在短时间内出现痰液大量分泌和炎性介质大量浸润，引起气道上皮的炎性损伤，进一步扩大不良刺激及致病因素致呼吸道损害的效应。
最后，本研究利用免疫组织化学方法检测了各组大鼠支气管/肺组织中 CIRP 的定位以及表达水平，结果显示 CIRP 在大鼠支气管/肺组织上皮黏膜中均有表达，且主要位于气道黏膜上皮细胞胞核内；5 ℃ 组以及 PM2.5 染毒组的单独刺激均使得 CIRP 的表达水平有增高趋势；而在持续地冷刺激后再给予大鼠 PM2.5 侵袭时，支气管/肺组织内 CIRP 的表达量大幅度增加，这提示了冷空气持续地刺激下 CIRP 表达量增多，维持机体呼吸道的敏感状态，使其能够对 PM2.5 等突袭而来的伤害性刺激作出快速应答反应，从而起到储备性自主防御的作用。此外，为了验证 CIRP 在人体肺组织也相应存在并发挥可能的作用，我们还对正常人群以及慢阻肺患者进行标本采集，观察了人体支气管/肺组织 CIRP 的定位和表达情况。当然，由于人体研究的伦理要求，无法做到细胞和动物实验相应的分组和干预条件，只是就简单区分的目标人群进行了观察。研究证实了 CIRP 蛋白在人支气管气道上皮有所表达，主要富集于支气管管腔；同时发现相较于正常人群，罹患慢性呼吸道炎症的患者其 CIRP 的表达量明显增多，提示 CIRP 与组织感染、黏液分泌等一系列炎性反应症状的进展和预后有密切关系。
综上，本研究证实了在低温环境下 CIRP 的时相变化是真核生物应对严峻环境胁迫时自主呈现的一种重要的转录后细胞保护机制，明确 CIRP 参与了冷刺激对 PM2.5 致气道上皮炎症反应的增敏效应。这不仅对阐明机体的转录后调控机制具有重要研究意义及临床价值，亦有助于进一步诠释大气污染对气道的健康效应，且能为寒冷地区空气污染导致呼吸道炎症的防控提供理论依据。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
