引用本文： 何明欣, 张华, 周向东, 尤列·皮尔曼, 维克多·科罗索夫, 李琪. 白细胞介素-1受体相关激酶通过TLR-4/MyD88信号通路调控内毒素诱导的气道黏液高分泌. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(1): 50-54. doi: 10.7507/1671-6205.202002114 复制
正常生理状态下，呼吸道上皮表面覆盖着一层分泌黏液，成分有蛋白、水、电解质等，其中具有最重要生理学意义的成分是黏蛋白（mucin，MUC）。正常生理量的黏液数量较少，维持着正常黏液的粘弹性和黏液纤毛清除功能。而在诸多气道慢性炎症性疾病下，黏液过度分泌不仅加重气道阻塞，影响气体交换，同时也延缓气道内病原体的清除[1]。黏蛋白5 AC（mucin 5 AC，MUC5AC）主要由支气管上皮的杯状细胞合成与分泌，在慢性气道炎症性疾病中，大量化生的杯状细胞分泌过多的MUC5AC是导致气道黏液栓形成的重要因素[1-3]。细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）存在于革兰阴性杆菌的胞壁中，多由细菌裂解后释放，可通过气道上皮的Toll样受体（Toll-like receptor，TLR)-4相关信号通路引起气道炎症反应及气道黏液高分泌[4-6]。白细胞介素-1受体相关激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK）是一类细胞内激酶，在炎症反应的调节中发挥着重要作用[7]。研究表明，IRAK在TLR及白细胞介素（interleukin，IL）-1介导的信号通路中发挥着必不可少的调节作用[8]。作为TLR/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）信号通路重要的调控因子[9]，IRAK是否参与介导气道黏液高分泌仍不甚清楚。本研究拟探讨IRAK在LPS诱导的气道黏液高分泌中的作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
永生化正常人气道上皮细胞株BEAS-2B（美国ATCC公司）。
1.1.2 主要试剂
胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）高糖细胞培养液（美国GIBCO公司）；LPS（Invitrogen）、脂质体转染试剂Lipofectamine®RNAi MAX Transfection Reagent（Invitrogen）均购自美国Life Technologies公司；总RNA抽提试剂Trizol（美国Thermo Scientific公司）；逆转录（reverse transcription，RT）试剂盒PrimeScript RT reagent Kit、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒Tarkra PrimeSTARTM DNA Polymerase酶（大连宝生物公司）；人MUC5AC RT-PCR引物及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物（上海生工生物工程技术服务有限公司合成包装）。人TLR-4特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、人IRAK特异性siRNA及对照siRNA（美国Life Technologies公司）；IRAK激酶抑制剂CAS509093-47-4（德国Merck Millipore公司）；小鼠抗人MUC5AC单克隆抗体、兔抗人IRAK多克隆抗体、兔抗人IRAK磷酸化（T209）多克隆抗体、兔抗人核因子（nuclear factor，NF）-κB多克隆抗体（美国Abcam公司）；小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）抗体、兔抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体及实验中使用的二抗，包括辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗小鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、HRP-羊抗兔IgG（均购于北京中杉金桥）；细胞膜/胞浆蛋白提取试剂盒、细胞核蛋白提取试剂盒（购于上海生工生物工程技术服务有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
在无菌一次性塑料培养瓶中培养BEAS-2B细胞，放置于37 ℃、5% CO2培养中，细胞生长汇合至70%～80%时常规传代。传至8～12代时按5×106个/孔接种于6孔板上，继续培养贴壁，并使用无血清DMEM高糖培养液（每孔3 mL）继续培养8 h后分组。
1.2.2 细胞分组
A组：阴性对照组，使用无血清DMEM高糖培养液培养；B组：LPS组，3 mL无血清DMEM高糖培养液中加入总浓度为1 μg/mL LPS刺激12 h后，换用无血清DMEM高糖培养液继续培养；C1组：TLR-4特异性siRNA+LPS组，BEAS-2B细胞转染TLR-4特异性siRNA，给予总浓度为1 μg/mL LPS刺激12 h后，换用无血清DMEM高糖培养液继续培养；C2组：TLR-4对照siRNA+LPS组，BEAS-2B细胞转染TLR-4对照siRNA，余同C1；D组：IRAK激酶抑制剂+LPS组，BEAS-2B细胞使用600 nmol/L的CAS509093-47-4预处理20 min后，给予总浓度为1 μg/mL LPS刺激12 h，换用无血清DMEM高糖培养液继续培养；E1组：IRAK特异性siRNA+LPS组，BEAS-2B细胞转染IRAK特异性siRNA，给予总浓度为1 μg/mL LPS刺激12 h后，换用无血清DMEM高糖培养液继续培养；E2组：IRAK对照siRNA+LPS组，BEAS-2B细胞转染IRAK对照siRNA，余同E1。每组6个复孔，重复3次试验。
1.2.3 细胞转染
轻柔吸出6孔板中的培养液，用无双抗无血清的DMEM高糖培养液轻轻洗涤3次，吸弃后加入2 mL无双抗无血清的DMEM高糖培养液。按Invitrogen公司Lipofectamine®RNAi MAX Transfection Reagent说明书，配置A液：240 μL DMEM高糖培养液，10 μL Lipofectamine 2000；B液：240 μL RPMI1640培养液，10 μL目的siRNA质粒或对照siRNA质粒。将A、B液混合室温静置20 min后加入6孔板，每孔加混合液500 μL。轻轻摇动6孔板后于37 ℃，5%的CO2下孵育4 h。用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）轻柔洗涤2次后加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液3 mL培养过夜。
1.2.4 MUC5AC mRNA转录水平检测
采用半定量RT-PCR。应用Trizol法提取细胞内总RNA，紫外分光光度仪测得OD260/OD280为1.90，浓度为1.73 μg/μL。按Takara PrimeScript RT reagent Kit试剂盒说明书将总mRNA逆转录成cDNA。再参照Tarkra PrimeSTARTM DNA Polymerase说明进行PCR。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。MUC5AC上游引物为5’-TCAACGGAGACTBCGAGTACAC-3’，下游引物为5’-TCTTGATGGCCTTGGAGCA-3’，扩增片段长度为220 bp。内参GAPDH上游引物为5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，下游引物为5’-GTCCTGGGATGGAAATTGTGA-3’，扩增片段长度为660 bp。反应条件：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s（PCR内参体系延伸时间为40 s），30个循环后72 ℃最后延伸10 min。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，用Bio-Rad凝胶图像分析系统对扩增条带进行灰度扫描和分析，并以与GAPDH条带的比值作为MUC5AC mRNA的相对含量。
1.2.5 TLR-4、IRAK、NF-κB p65蛋白水平及IRAK磷酸化水平检测
采用蛋白印迹法（Western blot）。将各组培养细胞弃上清，用预冷PBS洗涤3次后，按细胞膜/胞浆蛋白提取试剂盒、细胞核蛋白提取试剂盒说明书分别提取膜浆蛋白及核蛋白。双金鸡纳酸测定法标化各组蛋白浓度。总蛋白提取物经十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳、切胶、转膜后，使用含5%牛血清白蛋白的含吐温20的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液封闭l h，分别与一抗（1∶1000兔抗人IRAK多克隆抗体，1∶300兔抗人IRAK磷酸化多克隆抗体，1∶2000兔抗人NF-κB多克隆抗体），二抗（1∶3000）孵育，用化学发光法进行分析。胞浆蛋白中的NF-κB p65以β-actin为内参，胞核蛋白中的NF-κB p65以PCNA为内参，取相对灰度值作为NF-κB p65的相对含量。
1.2.6 细胞上清液内分泌蛋白MUC5AC水平检测
采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。取各组细胞培养上清液50 μL，于40 ℃包被96孔酶标反应板，干燥后使用PBS清洗酶标板3次，2%小牛血清室温封闭1 h；再次PBS清洗3次，按1∶100加入小鼠抗人MUC5AC单克隆抗体孵育1 h后使用PBS洗板3次，加入辣根过氧化物酶溶液显色，终止反应后在波长450 nm处测各孔吸光度值（A），与标准品比较而得到MUC5AC的相对值计算浓度。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件。所有数据采用均数±标准差（
±s）表示，多组间差异显著性分析采用多组间单因素方差分析，差异有统计学意义再行两组间SNK-q检验，两组间单因素分析采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 特异性siRNA转染效果
经Western blot鉴定，采用TLR-4特异性siRNA转染、IRAK特异性siRNA转染，在BEAS-2B细胞株中分别达到下调TLR-4（93.7±6.2）%，下调IRAK（94.2±5.1）%的表达水平（图1）。
图1
特异性siRNA转染BEAS-2B细胞株对TLR-4（a）和IRAK（b）表达的影响
特异性siRNA转染后BEAS-2B细胞株中TLR-4和IRAK表达水平均明显下调。B：LPS组；C2：TLR-4对照siRNA+LPS组；C1：TLR-4特异性siRNA+LPS组；E2：IRAK对照siRNA+LPS组；E1：IRAK特异性siRNA+LPS组。
2.2 IRAK蛋白磷酸化水平的鉴定
Western blot结果显示，经LPS刺激后可显著提高BEAS-2B细胞内IRAK蛋白的磷酸化水平（P<0.05），而通过转染TLR-4特异性siRNA的细胞对LPS刺激不敏感，其IRAK蛋白磷酸化水平显著低于野生型BEAS-2B细胞（P<0.05）（图2）。
图2
特异性siRNA转染对IRAK磷酸化水平的影响
特异性siRNA转染BEAS-2B细胞株的IRAK磷酸化表达水平明显低于野生型BEAS-2B细胞。A：阴性对照组；B：LPS组；C1：TLR-4特异性siRNA+LPS组；C2：TLR-4对照siRNA+LPS组。
2.3 Western blot 法鉴定NF-κB p65核转位情况
Western blot结果显示，阴性对照组NF-κB p65蛋白绝大部分位于胞浆中，经LPS刺激后，NF-κB p65核内部分增多（P<0.05）；而TLR-4特异性siRNA转染或IRAK特异性siRNA转染的细胞，经LPS刺激后，NF-κB p65的转位入核的部分显著少于野生型BEAS-2B细胞（P<0.05）；使用IRAK激酶抑制剂预处理，也能得到类似的效果（图3）。
图3
Western blot法鉴定NF-κB p65核转位情况
a. 胞膜及胞浆蛋白提取物；b. 胞核蛋白提取物。LPS刺激后BEAS-2B细胞株的NF-κB p65核内部分增多，特异性siRNA转染和IRAK激酶抑制剂预处理均可显著减少NF-κB p65转位入核。A：阴性对照组；B：LPS组；C1：TLR-4特异性siRNA+LPS组；C2：TLR-4对照siRNA+LPS组；E1：IRAK特异性siRNA+LPS组；C2：IRAK对照siRNA+LPS组；D：IRAK激酶抑制剂+LPS组。
2.4 IRAK在LPS诱导的MUC5AC合成增加中的作用
经LPS刺激后，野生型BEAS-2B细胞株MUC5AC mRNA转录水平显著高于阴性对照组（0.82±0.09比0.22±0.03，P<0.05）；而TLR-4特异性siRNA转染组（0.36±0.05）、IRAK特异性siRNA转染组（0.48±0.05）、IRAK激酶抑制剂预处理组（0.57±0.07）MUC5AC mRNA转录水平均显著低于LPS刺激的野生型BEAS-2B细胞组（均P<0.05）。经ELISA鉴定分析，经LPS刺激后野生型BEAS-2B细胞株MUC5AC蛋白分泌量［（0.76±0.09）μg/L］显著高于阴性对照组［（0.19±0.02）μg/L］，TLR-4特异性siRNA转染组［（0.33±0.04）μg/L］、IRAK特异性siRNA转染组［（0.42±0.05）μg/L］、IRAK激酶抑制剂预处理组［（0.51±0.06）μg/L］MUC5AC分泌量均显著低于LPS刺激的野生型BEAS-2B细胞组（均P<0.05）。结果见表1。
表1
MUC5AC转录与分泌水平的鉴定（
）
3 讨论
TLR-4是革兰阴性细菌细胞壁成分LPS主要识别受体。脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）与LPS相互结合，形成LPS-LBP复合物，此复合物与可溶性CD14相结合共同构成复合物后锚定于由TLR-4和MyD88构成的受体复合物，从而激活TLR-4激发下游胞内的信号通路[10]。IRAK是近年来研究较多的胞内激酶，在肿瘤与炎症反应中都发挥了重要的作用[8]。研究发现IRAK在白细胞介素-1受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）及TLR介导的信号通路中发挥重要的调节作用。TLR和IL-1R家族成员均为跨膜蛋白，其胞内段都含有共同大约200个氨基酸组成的保守的TLR/IL-1R同源结构域。在TLR/IL-1R介导的NF-κB激活中，IRAK起着不可或缺的激酶作用[11]。当TLR/IL-1R与配体结合后作为最主要的衔接蛋白，MyD88迅速被募集到受体上，同时与IRAK相互作用形成受体复合物。通过一系列的相互作用，IRAK实现磷酸化激活，从MyD88及受体复合物上释放，这个过程在信号级联反应中发挥重要作用。而脱离后激活的IRAK可进一步通过与肿瘤坏死因子受体相关因子6的结合与相互作用，最终激活NF-κB及丝裂原活化蛋白激酶家族，产生促炎症因子、趋化因子释放等其他终端效应[12]。
本研究通过siRNA干扰技术，实现了在人气道上皮细胞株中下调TLR-4的表达，证实了TLR-4在LPS诱导MUC5AC高分泌中的作用，与以往研究结果相一致[4]。同时本研究结果表明，LPS刺激可显著提高IRAK磷酸化水平，但不提高细胞内IRAK蛋白总量，表明了IRAK磷酸化调控可能参与了LPS诱导MUC5AC高分泌的信号通路。进一步我们通过构建IRAK特异性siRNA，转染BEAS-2B细胞株并进行研究发现，下调IRAK水平或使用IRAK激酶抑制剂CAS509093-47-4预处理，可部分抑制LPS刺激所诱导的NF-κB p65核转位。同时，我们也相应发现IRAK缺陷细胞株对于LPS刺激诱导所产生的MUC5AC转录与蛋白分泌水平，均低于野生型BEAS-2B细胞株。使用IRAK激酶抑制剂预处理，也能得到类似的结果。
本研究证实了IRAK作为TLR-4通路中的重要调控因子，在基于TLR的炎症反应中的重要作用，揭示了IRAK作为TLR受体依赖信号通路上游的重要调控蛋白，在LPS诱导的气道重要黏蛋白MUC5AC高分泌中的重要作用。在气道炎症反应及黏液高分泌方面，基于IRAK调控蛋白的理论研究，也可为临床治疗提供新的靶向思路。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
正常生理状态下，呼吸道上皮表面覆盖着一层分泌黏液，成分有蛋白、水、电解质等，其中具有最重要生理学意义的成分是黏蛋白（mucin，MUC）。正常生理量的黏液数量较少，维持着正常黏液的粘弹性和黏液纤毛清除功能。而在诸多气道慢性炎症性疾病下，黏液过度分泌不仅加重气道阻塞，影响气体交换，同时也延缓气道内病原体的清除[1]。黏蛋白5 AC（mucin 5 AC，MUC5AC）主要由支气管上皮的杯状细胞合成与分泌，在慢性气道炎症性疾病中，大量化生的杯状细胞分泌过多的MUC5AC是导致气道黏液栓形成的重要因素[1-3]。细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）存在于革兰阴性杆菌的胞壁中，多由细菌裂解后释放，可通过气道上皮的Toll样受体（Toll-like receptor，TLR)-4相关信号通路引起气道炎症反应及气道黏液高分泌[4-6]。白细胞介素-1受体相关激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK）是一类细胞内激酶，在炎症反应的调节中发挥着重要作用[7]。研究表明，IRAK在TLR及白细胞介素（interleukin，IL）-1介导的信号通路中发挥着必不可少的调节作用[8]。作为TLR/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）信号通路重要的调控因子[9]，IRAK是否参与介导气道黏液高分泌仍不甚清楚。本研究拟探讨IRAK在LPS诱导的气道黏液高分泌中的作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
永生化正常人气道上皮细胞株BEAS-2B（美国ATCC公司）。
1.1.2 主要试剂
胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）高糖细胞培养液（美国GIBCO公司）；LPS（Invitrogen）、脂质体转染试剂Lipofectamine®RNAi MAX Transfection Reagent（Invitrogen）均购自美国Life Technologies公司；总RNA抽提试剂Trizol（美国Thermo Scientific公司）；逆转录（reverse transcription，RT）试剂盒PrimeScript RT reagent Kit、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒Tarkra PrimeSTARTM DNA Polymerase酶（大连宝生物公司）；人MUC5AC RT-PCR引物及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物（上海生工生物工程技术服务有限公司合成包装）。人TLR-4特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、人IRAK特异性siRNA及对照siRNA（美国Life Technologies公司）；IRAK激酶抑制剂CAS509093-47-4（德国Merck Millipore公司）；小鼠抗人MUC5AC单克隆抗体、兔抗人IRAK多克隆抗体、兔抗人IRAK磷酸化（T209）多克隆抗体、兔抗人核因子（nuclear factor，NF）-κB多克隆抗体（美国Abcam公司）；小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）抗体、兔抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体及实验中使用的二抗，包括辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗小鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、HRP-羊抗兔IgG（均购于北京中杉金桥）；细胞膜/胞浆蛋白提取试剂盒、细胞核蛋白提取试剂盒（购于上海生工生物工程技术服务有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
在无菌一次性塑料培养瓶中培养BEAS-2B细胞，放置于37 ℃、5% CO2培养中，细胞生长汇合至70%～80%时常规传代。传至8～12代时按5×106个/孔接种于6孔板上，继续培养贴壁，并使用无血清DMEM高糖培养液（每孔3 mL）继续培养8 h后分组。
1.2.2 细胞分组
A组：阴性对照组，使用无血清DMEM高糖培养液培养；B组：LPS组，3 mL无血清DMEM高糖培养液中加入总浓度为1 μg/mL LPS刺激12 h后，换用无血清DMEM高糖培养液继续培养；C1组：TLR-4特异性siRNA+LPS组，BEAS-2B细胞转染TLR-4特异性siRNA，给予总浓度为1 μg/mL LPS刺激12 h后，换用无血清DMEM高糖培养液继续培养；C2组：TLR-4对照siRNA+LPS组，BEAS-2B细胞转染TLR-4对照siRNA，余同C1；D组：IRAK激酶抑制剂+LPS组，BEAS-2B细胞使用600 nmol/L的CAS509093-47-4预处理20 min后，给予总浓度为1 μg/mL LPS刺激12 h，换用无血清DMEM高糖培养液继续培养；E1组：IRAK特异性siRNA+LPS组，BEAS-2B细胞转染IRAK特异性siRNA，给予总浓度为1 μg/mL LPS刺激12 h后，换用无血清DMEM高糖培养液继续培养；E2组：IRAK对照siRNA+LPS组，BEAS-2B细胞转染IRAK对照siRNA，余同E1。每组6个复孔，重复3次试验。
1.2.3 细胞转染
轻柔吸出6孔板中的培养液，用无双抗无血清的DMEM高糖培养液轻轻洗涤3次，吸弃后加入2 mL无双抗无血清的DMEM高糖培养液。按Invitrogen公司Lipofectamine®RNAi MAX Transfection Reagent说明书，配置A液：240 μL DMEM高糖培养液，10 μL Lipofectamine 2000；B液：240 μL RPMI1640培养液，10 μL目的siRNA质粒或对照siRNA质粒。将A、B液混合室温静置20 min后加入6孔板，每孔加混合液500 μL。轻轻摇动6孔板后于37 ℃，5%的CO2下孵育4 h。用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）轻柔洗涤2次后加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液3 mL培养过夜。
1.2.4 MUC5AC mRNA转录水平检测
采用半定量RT-PCR。应用Trizol法提取细胞内总RNA，紫外分光光度仪测得OD260/OD280为1.90，浓度为1.73 μg/μL。按Takara PrimeScript RT reagent Kit试剂盒说明书将总mRNA逆转录成cDNA。再参照Tarkra PrimeSTARTM DNA Polymerase说明进行PCR。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。MUC5AC上游引物为5’-TCAACGGAGACTBCGAGTACAC-3’，下游引物为5’-TCTTGATGGCCTTGGAGCA-3’，扩增片段长度为220 bp。内参GAPDH上游引物为5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，下游引物为5’-GTCCTGGGATGGAAATTGTGA-3’，扩增片段长度为660 bp。反应条件：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s（PCR内参体系延伸时间为40 s），30个循环后72 ℃最后延伸10 min。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，用Bio-Rad凝胶图像分析系统对扩增条带进行灰度扫描和分析，并以与GAPDH条带的比值作为MUC5AC mRNA的相对含量。
1.2.5 TLR-4、IRAK、NF-κB p65蛋白水平及IRAK磷酸化水平检测
采用蛋白印迹法（Western blot）。将各组培养细胞弃上清，用预冷PBS洗涤3次后，按细胞膜/胞浆蛋白提取试剂盒、细胞核蛋白提取试剂盒说明书分别提取膜浆蛋白及核蛋白。双金鸡纳酸测定法标化各组蛋白浓度。总蛋白提取物经十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳、切胶、转膜后，使用含5%牛血清白蛋白的含吐温20的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液封闭l h，分别与一抗（1∶1000兔抗人IRAK多克隆抗体，1∶300兔抗人IRAK磷酸化多克隆抗体，1∶2000兔抗人NF-κB多克隆抗体），二抗（1∶3000）孵育，用化学发光法进行分析。胞浆蛋白中的NF-κB p65以β-actin为内参，胞核蛋白中的NF-κB p65以PCNA为内参，取相对灰度值作为NF-κB p65的相对含量。
1.2.6 细胞上清液内分泌蛋白MUC5AC水平检测
采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。取各组细胞培养上清液50 μL，于40 ℃包被96孔酶标反应板，干燥后使用PBS清洗酶标板3次，2%小牛血清室温封闭1 h；再次PBS清洗3次，按1∶100加入小鼠抗人MUC5AC单克隆抗体孵育1 h后使用PBS洗板3次，加入辣根过氧化物酶溶液显色，终止反应后在波长450 nm处测各孔吸光度值（A），与标准品比较而得到MUC5AC的相对值计算浓度。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件。所有数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间差异显著性分析采用多组间单因素方差分析，差异有统计学意义再行两组间SNK-q检验，两组间单因素分析采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 特异性siRNA转染效果
经Western blot鉴定，采用TLR-4特异性siRNA转染、IRAK特异性siRNA转染，在BEAS-2B细胞株中分别达到下调TLR-4（93.7±6.2）%，下调IRAK（94.2±5.1）%的表达水平（图1）。
图1
特异性siRNA转染BEAS-2B细胞株对TLR-4（a）和IRAK（b）表达的影响
特异性siRNA转染后BEAS-2B细胞株中TLR-4和IRAK表达水平均明显下调。B：LPS组；C2：TLR-4对照siRNA+LPS组；C1：TLR-4特异性siRNA+LPS组；E2：IRAK对照siRNA+LPS组；E1：IRAK特异性siRNA+LPS组。
2.2 IRAK蛋白磷酸化水平的鉴定
Western blot结果显示，经LPS刺激后可显著提高BEAS-2B细胞内IRAK蛋白的磷酸化水平（P<0.05），而通过转染TLR-4特异性siRNA的细胞对LPS刺激不敏感，其IRAK蛋白磷酸化水平显著低于野生型BEAS-2B细胞（P<0.05）（图2）。
图2
特异性siRNA转染对IRAK磷酸化水平的影响
特异性siRNA转染BEAS-2B细胞株的IRAK磷酸化表达水平明显低于野生型BEAS-2B细胞。A：阴性对照组；B：LPS组；C1：TLR-4特异性siRNA+LPS组；C2：TLR-4对照siRNA+LPS组。
2.3 Western blot 法鉴定NF-κB p65核转位情况
Western blot结果显示，阴性对照组NF-κB p65蛋白绝大部分位于胞浆中，经LPS刺激后，NF-κB p65核内部分增多（P<0.05）；而TLR-4特异性siRNA转染或IRAK特异性siRNA转染的细胞，经LPS刺激后，NF-κB p65的转位入核的部分显著少于野生型BEAS-2B细胞（P<0.05）；使用IRAK激酶抑制剂预处理，也能得到类似的效果（图3）。
图3
Western blot法鉴定NF-κB p65核转位情况
a. 胞膜及胞浆蛋白提取物；b. 胞核蛋白提取物。LPS刺激后BEAS-2B细胞株的NF-κB p65核内部分增多，特异性siRNA转染和IRAK激酶抑制剂预处理均可显著减少NF-κB p65转位入核。A：阴性对照组；B：LPS组；C1：TLR-4特异性siRNA+LPS组；C2：TLR-4对照siRNA+LPS组；E1：IRAK特异性siRNA+LPS组；C2：IRAK对照siRNA+LPS组；D：IRAK激酶抑制剂+LPS组。
2.4 IRAK在LPS诱导的MUC5AC合成增加中的作用
经LPS刺激后，野生型BEAS-2B细胞株MUC5AC mRNA转录水平显著高于阴性对照组（0.82±0.09比0.22±0.03，P<0.05）；而TLR-4特异性siRNA转染组（0.36±0.05）、IRAK特异性siRNA转染组（0.48±0.05）、IRAK激酶抑制剂预处理组（0.57±0.07）MUC5AC mRNA转录水平均显著低于LPS刺激的野生型BEAS-2B细胞组（均P<0.05）。经ELISA鉴定分析，经LPS刺激后野生型BEAS-2B细胞株MUC5AC蛋白分泌量［（0.76±0.09）μg/L］显著高于阴性对照组［（0.19±0.02）μg/L］，TLR-4特异性siRNA转染组［（0.33±0.04）μg/L］、IRAK特异性siRNA转染组［（0.42±0.05）μg/L］、IRAK激酶抑制剂预处理组［（0.51±0.06）μg/L］MUC5AC分泌量均显著低于LPS刺激的野生型BEAS-2B细胞组（均P<0.05）。结果见表1。
表1
MUC5AC转录与分泌水平的鉴定（）
3 讨论
TLR-4是革兰阴性细菌细胞壁成分LPS主要识别受体。脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）与LPS相互结合，形成LPS-LBP复合物，此复合物与可溶性CD14相结合共同构成复合物后锚定于由TLR-4和MyD88构成的受体复合物，从而激活TLR-4激发下游胞内的信号通路[10]。IRAK是近年来研究较多的胞内激酶，在肿瘤与炎症反应中都发挥了重要的作用[8]。研究发现IRAK在白细胞介素-1受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）及TLR介导的信号通路中发挥重要的调节作用。TLR和IL-1R家族成员均为跨膜蛋白，其胞内段都含有共同大约200个氨基酸组成的保守的TLR/IL-1R同源结构域。在TLR/IL-1R介导的NF-κB激活中，IRAK起着不可或缺的激酶作用[11]。当TLR/IL-1R与配体结合后作为最主要的衔接蛋白，MyD88迅速被募集到受体上，同时与IRAK相互作用形成受体复合物。通过一系列的相互作用，IRAK实现磷酸化激活，从MyD88及受体复合物上释放，这个过程在信号级联反应中发挥重要作用。而脱离后激活的IRAK可进一步通过与肿瘤坏死因子受体相关因子6的结合与相互作用，最终激活NF-κB及丝裂原活化蛋白激酶家族，产生促炎症因子、趋化因子释放等其他终端效应[12]。
本研究通过siRNA干扰技术，实现了在人气道上皮细胞株中下调TLR-4的表达，证实了TLR-4在LPS诱导MUC5AC高分泌中的作用，与以往研究结果相一致[4]。同时本研究结果表明，LPS刺激可显著提高IRAK磷酸化水平，但不提高细胞内IRAK蛋白总量，表明了IRAK磷酸化调控可能参与了LPS诱导MUC5AC高分泌的信号通路。进一步我们通过构建IRAK特异性siRNA，转染BEAS-2B细胞株并进行研究发现，下调IRAK水平或使用IRAK激酶抑制剂CAS509093-47-4预处理，可部分抑制LPS刺激所诱导的NF-κB p65核转位。同时，我们也相应发现IRAK缺陷细胞株对于LPS刺激诱导所产生的MUC5AC转录与蛋白分泌水平，均低于野生型BEAS-2B细胞株。使用IRAK激酶抑制剂预处理，也能得到类似的结果。
本研究证实了IRAK作为TLR-4通路中的重要调控因子，在基于TLR的炎症反应中的重要作用，揭示了IRAK作为TLR受体依赖信号通路上游的重要调控蛋白，在LPS诱导的气道重要黏蛋白MUC5AC高分泌中的重要作用。在气道炎症反应及黏液高分泌方面，基于IRAK调控蛋白的理论研究，也可为临床治疗提供新的靶向思路。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
