引用本文： 陈沛锐, 吕静, 曾春芳, 何小艳, 刁明强. 敲低雌激素受体 α 基因抑制 A549 细胞的增殖、迁移及裸鼠移植瘤的形成. 中国呼吸与危重监护杂志, 2021, 20(9): 649-655. doi: 10.7507/1671-6205.202006060 复制
非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌的 80%，包括腺癌、鳞癌、低分化癌和大细胞肺癌，是全球癌症死亡的主要原因之一[1]。在过去的 20 年里，女性 NSCLC 的发病率明显上升，这可能与女性吸烟率增加有关[2]。但是，大约 20% 的女性肺癌患者从未吸烟，这表明性别依赖性因素可能参与 NSCLC 的发生和发展[3-4]，因而引发国内外学者对雌激素是否与肺癌的生物学特性及发病机制相关的研究。雌激素主要通过雌激素受体（ER）发挥作用。雌激素受体包括雌激素受体 α（ERα）和雌激素受体 β（ERβ），二者同属于甾体激素核受体家族，存在于细胞核和胞浆中。ERα 是第一个被发现和克隆的 ER[5]，编码 ERα 的基因 ESR1 位于6号染色体上[6]。近年研究发现，除了乳腺癌、子宫内膜癌等经典激素依赖性肿瘤外[7-8]，ER 也广泛存在于肺肿瘤及正常肺组织中[9]。颜浩等[10]通过临床样本分析研究表明正常肺组织和肺良性肿瘤组织中无 ERα 和 ERβ 表达，NSCLC 中 ERα、ERβ 阳性表达率分别为 20.4%（11/54）、45.1%（26/54），表明 ER 在 NSCLC 的发生过程中起作用。研究已表明 ERβ 失活或下调可能具有治疗肺癌的潜在作用[11]，但 ERα 对肺癌的相关研究尚未报道过。研究表明 ERα 在肺腺癌中高表达[12]，因此本研究以 A549 肺腺癌细胞系为研究对象，探究敲低 ERα 的表达对 NSCLC 细胞生存、转移及裸鼠肿瘤生长的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
RPMI1640 和胎牛血清（FBS）购自美国 Gibco；转染试剂、TRIzol 试剂、反转录试剂盒购自美国 Thermo Fisher 公司；RIPA 裂解缓冲液、BCA 定量试剂盒购自上海碧云天公司；基质胶购自美国 BD Biosciences 公司；Ki-67、ERα、上皮型钙黏蛋白（E-cad）和神经型钙黏蛋白（N-cad）一抗购自美国 Cell Signaling Technology 公司；辣根过氧化物酶偶联的二抗购自美国 Santa Cruz Biotechnology；4% 多聚甲醛、结晶紫购自美国 Sigma 公司。紫外分光光度计（美国 Thermo Fisher 公司），倒置显微镜（日本 Olympus 公司），FACScan 流式细胞仪（美国 Beckman coulter 公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
A549 细胞系购自美国典型培养物保藏中心（美国 ATCC），将细胞在含有 10% FBS、100 U/mL青霉素和 100 g/mL 链霉素的 RPMI1640 中于 37 °C、含 5% CO2 湿润条件下培养。
1.2.2 细胞转染
ERα-shRNA 及阴性对照序列由上海英骏生物技术有限公司设计合成，将 A549 细胞传代培养于 6 孔板中，培养 24 h 后根据转染试剂盒说明书用 Lipofectamine3000分别转染阴性对照 shRNA-NC 和干扰序列 ERα-shRNA1 和 ERα-shRNA2，用新鲜培养基替换培养 48 h，然后按照指示处理细胞。干扰序列 ERα-shRNA1、ERα-shRNA2 及阴性对照序列 shRNA-NC 如下：ER-shRNA1：CACCGGGAAGTATGGCTATGGAATCTTCAAGAGAGATTCCATAGCCATACTTCCCTTTTTTG；ER-shRNA2：CACCGGATTTGACCCTCCATGATCATTCAAGAGATGATCATGGAGGGTCAAATCCTTTTTTG；shRNA-NC：CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG。
1.2.3 逆转录–聚合酶链反应（RT-PCR）检测基因 mRNA 表达
用 Trizol 试剂从各组转染细胞提取总 RNA，用紫外分光光度计测定 RNA 的纯度和浓度。根据反转录试剂盒说明书操作，取等质量的总 RNA 作为模板反转录成 cDNA。以 cDNA 为模板，PCR 循环为：预变性 95 ℃ 3 min；变性 95 ℃ 15 s，退火 60 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，35 个循环；终延伸 72 ℃ 5 min。
1.2.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达
用 RIPA 裂解缓冲液提取各组转染 A549 细胞总蛋白。BCA 测定蛋白浓度并调平，取 20 µg 蛋白在 8% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，并将其转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在含 5% 脱脂牛奶的 TBST 中封闭 2 h 后，用一抗 4 ℃ 孵育过夜，TBST 洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃ 孵育 1 h；洗膜后 ECL 曝光成像并用 quantity one 软件分析蛋白条带的灰度值。
1.2.5 克隆形成实验检测细胞增殖
shRNA-NC 和 ERα-shRNA1 分别转染 A549 细胞，以 1000 个/孔的细胞数在 6 孔板中培养 2 周。用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 min，用 1% 结晶紫染色 5 min。可见克隆用倒置显微镜成像和手工计数，最后计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%[13]。
1.2.6 流式细胞检测细胞凋亡
将 1.2.5 转染各组 A549 细胞培养 48 h 后用胰蛋白酶消化，并用冷 PBS 洗涤 2 次。将细胞以 3000 r/min 的速度离心 5 min，然后弃去上清液，并将沉淀以 1.0×106 个/mL 的细胞密度重悬于 1×binding buffer 中。各取 100 µL 的样品溶液与 5 µL FITC 偶联的膜联蛋白（annexin）V（Pharmingen）和 5 µL 碘化丙啶（PI。Pharmingen）在室温下于黑暗中孵育15 min，向每个样品管中加入400 µL 1× binding buffer，使用 FACScan 流式细胞仪进行流式分析，annexin V（+）/PI（+/–）细胞占总细胞比率为细胞凋亡率。
1.2.7 Transwell 侵袭实验
将 Transwell 小室（孔径为 8 μm，#3422，美国康宁公司）涂上 20 μg 基质胶，取对数生长期的对照组、shRNA-NC 组、ERα-shRNA1 组细胞，以 4.0×104 细胞数播种于上室，放入培养箱。上室采用无血清培养基，下室加入含 10% FBS 的培养基。培养 24 h 后，将膜的下侧固定并用 0.1% 结晶紫染色，棉签擦去上层未迁移的细胞。在显微镜下随机选择 3 个区域对入侵的细胞进行计数，每个侵袭测定重复至少 6 次[14-15]。
1.2.8 建立裸鼠皮下移植瘤实验
16 只无特定病原体动物级 BALB/c 小鼠，5～6 周龄，体重 18～22 g，由成都中医药大学提供［SCXK（川）2019-11］，饲养于成都中医药大学（临床医学院）实验动物中心［SYXK（川）2017-179］，动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。将小鼠饲养于无菌环境中，房间温度控制在 23～25 ℃，湿度维持在 50%～60%，光照时间 12 h，自由进食高压灭菌水和无菌饲料，适应性喂养 7 d 后进行实验。将小鼠随机分为两组（n=8），将转染 ERα-shRNA1 序列的 A549 细胞以 2×106 细胞数皮下注射到裸鼠的侧面皮下，记为 ERα-shRNA1 组；对照组皮下注射等细胞数不做转染处理的 A549 细胞。饲养 30 d，从第 6 d 开始每 3 d 监测 1 次肿瘤体积（V），V=0.5×长度×宽度2[16]。30 d 后，通过颈脱位法处死小鼠，并通过手术切除肿瘤，拍照、称重并进行石蜡包埋切片，留待后续实验。
1.2.9 免疫组织化学实验
将步骤 1.2.8 保存的肿瘤组织石蜡切片脱蜡，柠檬酸钠缓冲液修复，滴加一抗至切片 4 ℃ 孵育过夜，二抗 37 ℃ 1 h，滴加辣根过氧化物酶标记的链酶蛋白亲和素，37 ℃ 作用 40 min，洗涤后避光显色并用苏木素复染细胞核。封片后使用光学显微镜观察 Ki-67 和 N-cad 阳性细胞。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 19.0 统计软件。呈正态分布的计量数据用均数±标准差（
±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），Student t 检验用于评估两组之间的差异。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 利用 shRNA 成功干扰 A549 细胞 ERα 的表达
如图 1所示，与对照组相比，shRNA NC 组中 ERα 表达量没有显著变化；ERα-shRNA1 组和 ERα-shRNA2 组中 ERα 的 mRNA 表达水平分别为 0.11±0.06 和 0.72±0.08，蛋白表达水平分别为 0.02±0.01 和 0.13±0.05，表明 ERα 的表达显著下调（P <0.05），且转染 ERα-shRNA1 的干扰效率比 ERα-shRNA2 更高，采用 ERα-shRNA1 进行后续实验。
图1
RT-PCR 和 Western blot 验证 shRNA 的敲低效率（n=6，
）
a．RT-PCR 检测 ERα 的 mRNA 转录水平；b．Western blot 检测 ERα 的蛋白表达：shRNA 干扰效率越高，ERα 的蛋白相对表达量越低。与对照组比较，*
2.2 敲低 ERα 抑制 A549 细胞的生长
如图 2a所示，与对照组相比，ERα-shRNA1 组 A549 细胞克隆形成率明显降低（P<0.05），且 A549 细胞中 Ki-67 和 PCNA 的表达量显著下调（P<0.05，图 2c），表明敲低 ERα 抑制了 A549 细胞的增殖；如图 2b所示，与对照组相比，ERα-shRNA1 组细胞凋亡比率显著增加（P<0.05），提示敲低 ERα 促进细胞凋亡。
图2
敲低 ERα 对 A549 细胞生长的影响（n=6，
）
a．克隆形成实验检测细胞增殖，shRNA-NC 组与对照组比较，差异无统计学意义，ERα-shRNA1 组克隆形成率显著低于对照组；b．流式细胞检测细胞凋亡，与对照组相比，ERα-shRNA1 组细胞凋亡比率显著增加；c．RT-PCR 检测 Ki-67 和 PCNA 的表达量，与对照组相比，ERα-shRNA1 组 A549 细胞中 Ki-67 和 PCNA 的表达量显著下调。与对照组比较，*
2.3 敲低 ERα 抑制 A549 细胞的运动能力
与对照组相比，敲低 ERα 可以显著降低 A549 细胞的体外侵袭（31±11 比 82±14，P<0.05，图 3a），并显著上调上皮细胞标志物 E-cad 的表达（P<0.05），下调间充质标志物 N-cad 的表达（P<0.05，图 3b），提示敲低 ERα 抑制了 A549 细胞的侵袭能力。
图3
敲低 ERα 对 A549 细胞运动能力的影响（n=6，
）
a． Transwell 实验检测 A549 细胞侵袭能力：shRNA-NC 组与对照组无显著性差异，ERα-shRNA1 组侵袭细胞数目显著少于对照组；b． Western blot 检测侵袭相关蛋白 E-cad 和 N-cad 蛋白表达。与对照组比较，*
2.4 敲低 ERα 能够抑制体内移植瘤的生长
如图 4所示，在 30 d 时，对照组肿瘤重量为（0.41±0.08）g，ERα-shRNA1 组肿瘤重量为（0.14±0.06）g，相比之下 ERα-shRNA1 组肿瘤重量显著降低（P<0.05）；ERα-shRNA1 组肿瘤体积（约 800 mm3）与对照组（约 1800 mm3）相比显著减小（P <0.05），因此敲低 ERα 阻止了移植瘤的发展进程。
图4
裸鼠成瘤实验（n=6，
）
a．对照组和转染 ERα-shRNA1 的 A549 细胞皮下注射裸鼠后形成的肿瘤团块；b．肿瘤重量统计图：ERα-shRNA1 组肿瘤重量显著低于对照组；c．30 d 内每隔 3 d 测量的肿瘤体积曲线图：ERα-shRNA1 组肿瘤体积显著小于对照组。与对照组比较，*
2.5 敲低 ERα 抑制移植瘤组织中 Ki-67 和 N-cad 的表达
如图 5所示，与对照组相比，ERα-shRNA1 组 Ki-67 阳性细胞与 N-cad 阳性细胞数目均显著减少（P<0.05）。
图5
免疫组织化学检测 Ki-67 和 N-cad 阳性细胞（×400，n=6，
）
a．Ki-67 阳性细胞呈棕色；b．N-cad 阳性细胞呈棕色。与对照组相比较，*
3 讨论
ERα 在细胞中广泛表达，在激素依赖性和非激素依赖性癌症中都起着关键作用。在激素相关的癌症（例如乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌）中，ERα 表达主要通过调节 PI3K/AKT 信号通路来促进疾病进展[17-18]。最近研究表明雌激素与 NSCLC 细胞系 H23 共同培养，癌细胞的增殖明显受到促进，使用抗雌激素药物后，癌细胞的增殖明显受到阻碍[19]。本研究结果表明敲低 ERα 后，细胞克隆形成率明显降低，凋亡比率显著增加，并且细胞增殖相关蛋白 Ki-67、PCNA 的表达量显著下调。PNCA 是一种促进 DNA 延伸的核蛋白，Ki-67 是一种增殖细胞核抗原，其表达与细胞分裂有密切关系，因此 Ki-67 是细胞增殖的理想标志物[20]。因此，敲低 ERα 可抑制 A549 细胞的增殖，促进凋亡，从而发挥抑癌作用。
研究表明 ERα 在肿瘤细胞的转移及侵袭过程中发挥着重要作用。Zhang 等[21]研究发现降低乳腺癌细胞中 ER-α36 的表达可抑制细胞的增殖、转移及侵袭能力。Zhang 等[22]应用免疫组织化学检测发现，ERα 的表达水平与肺腺癌的淋巴结转移呈正相关性。上皮–间质转化（EMT）是促进肿瘤侵袭，转移的主要机制之一，当上皮细胞标志物 E-cad 的表达下降，间充质标志物 N-cad 表达升高时，肿瘤细胞骨架系统排列发生变化细胞生物学性状改变，粘附功能下降易于脱离原发灶，向周围组织侵袭或转移[23]。本研究结果表明敲低 ERα 后，侵袭细胞数明显减少，E-cad 表达显著上调，N-cad 表达明显下调，表明 A549 细胞体外侵袭能力显著降低，因此敲低 ERα 可通过抑制 A549 细胞的侵袭阻止肿瘤恶性发展。
研究表明 ERα 可能以 E2 依赖的方式促进子宫内膜癌的发生、发展[24]。本研究将对照和转染 ERα-shRNA1 的 A549 细胞分别注射到裸鼠皮下，结果发现 ERα-shRNA1 组肿瘤重量和体积明显低于对照组。本研究进一步从组织学层面探讨 ERα 与 A549 细胞增殖与迁移的关系，结果表明敲低 ERα 显著下调 Ki-67 和 N-cad 阳性细胞比率，敲低 ERα 能够显著抑制移植瘤的生长，因此敲低 ERα 可有效阻止 A549 细胞的恶性生物学行为。
综上所述，本研究表明敲低 ERα 的表达能够抑制 A549 细胞的生长、侵袭及转移，减缓体内 A549 细胞移植瘤的生长。目前 ERα 拮抗剂（如 TAM）已广泛应用于临床，通过与雌激素受体的作用来抑制肿瘤的进展和转移[25-26]。因此，失活或敲低 ERα 的表达有望成为治疗 NSCLC 的新方法，不仅能减少肿瘤患者在手术治疗和放化疗过程中的痛苦，而且能尽量延长患者的生存期。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌的 80%，包括腺癌、鳞癌、低分化癌和大细胞肺癌，是全球癌症死亡的主要原因之一[1]。在过去的 20 年里，女性 NSCLC 的发病率明显上升，这可能与女性吸烟率增加有关[2]。但是，大约 20% 的女性肺癌患者从未吸烟，这表明性别依赖性因素可能参与 NSCLC 的发生和发展[3-4]，因而引发国内外学者对雌激素是否与肺癌的生物学特性及发病机制相关的研究。雌激素主要通过雌激素受体（ER）发挥作用。雌激素受体包括雌激素受体 α（ERα）和雌激素受体 β（ERβ），二者同属于甾体激素核受体家族，存在于细胞核和胞浆中。ERα 是第一个被发现和克隆的 ER[5]，编码 ERα 的基因 ESR1 位于6号染色体上[6]。近年研究发现，除了乳腺癌、子宫内膜癌等经典激素依赖性肿瘤外[7-8]，ER 也广泛存在于肺肿瘤及正常肺组织中[9]。颜浩等[10]通过临床样本分析研究表明正常肺组织和肺良性肿瘤组织中无 ERα 和 ERβ 表达，NSCLC 中 ERα、ERβ 阳性表达率分别为 20.4%（11/54）、45.1%（26/54），表明 ER 在 NSCLC 的发生过程中起作用。研究已表明 ERβ 失活或下调可能具有治疗肺癌的潜在作用[11]，但 ERα 对肺癌的相关研究尚未报道过。研究表明 ERα 在肺腺癌中高表达[12]，因此本研究以 A549 肺腺癌细胞系为研究对象，探究敲低 ERα 的表达对 NSCLC 细胞生存、转移及裸鼠肿瘤生长的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
RPMI1640 和胎牛血清（FBS）购自美国 Gibco；转染试剂、TRIzol 试剂、反转录试剂盒购自美国 Thermo Fisher 公司；RIPA 裂解缓冲液、BCA 定量试剂盒购自上海碧云天公司；基质胶购自美国 BD Biosciences 公司；Ki-67、ERα、上皮型钙黏蛋白（E-cad）和神经型钙黏蛋白（N-cad）一抗购自美国 Cell Signaling Technology 公司；辣根过氧化物酶偶联的二抗购自美国 Santa Cruz Biotechnology；4% 多聚甲醛、结晶紫购自美国 Sigma 公司。紫外分光光度计（美国 Thermo Fisher 公司），倒置显微镜（日本 Olympus 公司），FACScan 流式细胞仪（美国 Beckman coulter 公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
A549 细胞系购自美国典型培养物保藏中心（美国 ATCC），将细胞在含有 10% FBS、100 U/mL青霉素和 100 g/mL 链霉素的 RPMI1640 中于 37 °C、含 5% CO2 湿润条件下培养。
1.2.2 细胞转染
ERα-shRNA 及阴性对照序列由上海英骏生物技术有限公司设计合成，将 A549 细胞传代培养于 6 孔板中，培养 24 h 后根据转染试剂盒说明书用 Lipofectamine3000分别转染阴性对照 shRNA-NC 和干扰序列 ERα-shRNA1 和 ERα-shRNA2，用新鲜培养基替换培养 48 h，然后按照指示处理细胞。干扰序列 ERα-shRNA1、ERα-shRNA2 及阴性对照序列 shRNA-NC 如下：ER-shRNA1：CACCGGGAAGTATGGCTATGGAATCTTCAAGAGAGATTCCATAGCCATACTTCCCTTTTTTG；ER-shRNA2：CACCGGATTTGACCCTCCATGATCATTCAAGAGATGATCATGGAGGGTCAAATCCTTTTTTG；shRNA-NC：CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG。
1.2.3 逆转录–聚合酶链反应（RT-PCR）检测基因 mRNA 表达
用 Trizol 试剂从各组转染细胞提取总 RNA，用紫外分光光度计测定 RNA 的纯度和浓度。根据反转录试剂盒说明书操作，取等质量的总 RNA 作为模板反转录成 cDNA。以 cDNA 为模板，PCR 循环为：预变性 95 ℃ 3 min；变性 95 ℃ 15 s，退火 60 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，35 个循环；终延伸 72 ℃ 5 min。
1.2.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达
用 RIPA 裂解缓冲液提取各组转染 A549 细胞总蛋白。BCA 测定蛋白浓度并调平，取 20 µg 蛋白在 8% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，并将其转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在含 5% 脱脂牛奶的 TBST 中封闭 2 h 后，用一抗 4 ℃ 孵育过夜，TBST 洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃ 孵育 1 h；洗膜后 ECL 曝光成像并用 quantity one 软件分析蛋白条带的灰度值。
1.2.5 克隆形成实验检测细胞增殖
shRNA-NC 和 ERα-shRNA1 分别转染 A549 细胞，以 1000 个/孔的细胞数在 6 孔板中培养 2 周。用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 min，用 1% 结晶紫染色 5 min。可见克隆用倒置显微镜成像和手工计数，最后计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%[13]。
1.2.6 流式细胞检测细胞凋亡
将 1.2.5 转染各组 A549 细胞培养 48 h 后用胰蛋白酶消化，并用冷 PBS 洗涤 2 次。将细胞以 3000 r/min 的速度离心 5 min，然后弃去上清液，并将沉淀以 1.0×106 个/mL 的细胞密度重悬于 1×binding buffer 中。各取 100 µL 的样品溶液与 5 µL FITC 偶联的膜联蛋白（annexin）V（Pharmingen）和 5 µL 碘化丙啶（PI。Pharmingen）在室温下于黑暗中孵育15 min，向每个样品管中加入400 µL 1× binding buffer，使用 FACScan 流式细胞仪进行流式分析，annexin V（+）/PI（+/–）细胞占总细胞比率为细胞凋亡率。
1.2.7 Transwell 侵袭实验
将 Transwell 小室（孔径为 8 μm，#3422，美国康宁公司）涂上 20 μg 基质胶，取对数生长期的对照组、shRNA-NC 组、ERα-shRNA1 组细胞，以 4.0×104 细胞数播种于上室，放入培养箱。上室采用无血清培养基，下室加入含 10% FBS 的培养基。培养 24 h 后，将膜的下侧固定并用 0.1% 结晶紫染色，棉签擦去上层未迁移的细胞。在显微镜下随机选择 3 个区域对入侵的细胞进行计数，每个侵袭测定重复至少 6 次[14-15]。
1.2.8 建立裸鼠皮下移植瘤实验
16 只无特定病原体动物级 BALB/c 小鼠，5～6 周龄，体重 18～22 g，由成都中医药大学提供［SCXK（川）2019-11］，饲养于成都中医药大学（临床医学院）实验动物中心［SYXK（川）2017-179］，动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。将小鼠饲养于无菌环境中，房间温度控制在 23～25 ℃，湿度维持在 50%～60%，光照时间 12 h，自由进食高压灭菌水和无菌饲料，适应性喂养 7 d 后进行实验。将小鼠随机分为两组（n=8），将转染 ERα-shRNA1 序列的 A549 细胞以 2×106 细胞数皮下注射到裸鼠的侧面皮下，记为 ERα-shRNA1 组；对照组皮下注射等细胞数不做转染处理的 A549 细胞。饲养 30 d，从第 6 d 开始每 3 d 监测 1 次肿瘤体积（V），V=0.5×长度×宽度2[16]。30 d 后，通过颈脱位法处死小鼠，并通过手术切除肿瘤，拍照、称重并进行石蜡包埋切片，留待后续实验。
1.2.9 免疫组织化学实验
将步骤 1.2.8 保存的肿瘤组织石蜡切片脱蜡，柠檬酸钠缓冲液修复，滴加一抗至切片 4 ℃ 孵育过夜，二抗 37 ℃ 1 h，滴加辣根过氧化物酶标记的链酶蛋白亲和素，37 ℃ 作用 40 min，洗涤后避光显色并用苏木素复染细胞核。封片后使用光学显微镜观察 Ki-67 和 N-cad 阳性细胞。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 19.0 统计软件。呈正态分布的计量数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），Student t 检验用于评估两组之间的差异。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 利用 shRNA 成功干扰 A549 细胞 ERα 的表达
如图 1所示，与对照组相比，shRNA NC 组中 ERα 表达量没有显著变化；ERα-shRNA1 组和 ERα-shRNA2 组中 ERα 的 mRNA 表达水平分别为 0.11±0.06 和 0.72±0.08，蛋白表达水平分别为 0.02±0.01 和 0.13±0.05，表明 ERα 的表达显著下调（P <0.05），且转染 ERα-shRNA1 的干扰效率比 ERα-shRNA2 更高，采用 ERα-shRNA1 进行后续实验。
图1
RT-PCR 和 Western blot 验证 shRNA 的敲低效率（n=6，）
a．RT-PCR 检测 ERα 的 mRNA 转录水平；b．Western blot 检测 ERα 的蛋白表达：shRNA 干扰效率越高，ERα 的蛋白相对表达量越低。与对照组比较，*
2.2 敲低 ERα 抑制 A549 细胞的生长
如图 2a所示，与对照组相比，ERα-shRNA1 组 A549 细胞克隆形成率明显降低（P<0.05），且 A549 细胞中 Ki-67 和 PCNA 的表达量显著下调（P<0.05，图 2c），表明敲低 ERα 抑制了 A549 细胞的增殖；如图 2b所示，与对照组相比，ERα-shRNA1 组细胞凋亡比率显著增加（P<0.05），提示敲低 ERα 促进细胞凋亡。
图2
敲低 ERα 对 A549 细胞生长的影响（n=6，）
a．克隆形成实验检测细胞增殖，shRNA-NC 组与对照组比较，差异无统计学意义，ERα-shRNA1 组克隆形成率显著低于对照组；b．流式细胞检测细胞凋亡，与对照组相比，ERα-shRNA1 组细胞凋亡比率显著增加；c．RT-PCR 检测 Ki-67 和 PCNA 的表达量，与对照组相比，ERα-shRNA1 组 A549 细胞中 Ki-67 和 PCNA 的表达量显著下调。与对照组比较，*
2.3 敲低 ERα 抑制 A549 细胞的运动能力
与对照组相比，敲低 ERα 可以显著降低 A549 细胞的体外侵袭（31±11 比 82±14，P<0.05，图 3a），并显著上调上皮细胞标志物 E-cad 的表达（P<0.05），下调间充质标志物 N-cad 的表达（P<0.05，图 3b），提示敲低 ERα 抑制了 A549 细胞的侵袭能力。
图3
敲低 ERα 对 A549 细胞运动能力的影响（n=6，）
a． Transwell 实验检测 A549 细胞侵袭能力：shRNA-NC 组与对照组无显著性差异，ERα-shRNA1 组侵袭细胞数目显著少于对照组；b． Western blot 检测侵袭相关蛋白 E-cad 和 N-cad 蛋白表达。与对照组比较，*
2.4 敲低 ERα 能够抑制体内移植瘤的生长
如图 4所示，在 30 d 时，对照组肿瘤重量为（0.41±0.08）g，ERα-shRNA1 组肿瘤重量为（0.14±0.06）g，相比之下 ERα-shRNA1 组肿瘤重量显著降低（P<0.05）；ERα-shRNA1 组肿瘤体积（约 800 mm3）与对照组（约 1800 mm3）相比显著减小（P <0.05），因此敲低 ERα 阻止了移植瘤的发展进程。
图4
裸鼠成瘤实验（n=6，）
a．对照组和转染 ERα-shRNA1 的 A549 细胞皮下注射裸鼠后形成的肿瘤团块；b．肿瘤重量统计图：ERα-shRNA1 组肿瘤重量显著低于对照组；c．30 d 内每隔 3 d 测量的肿瘤体积曲线图：ERα-shRNA1 组肿瘤体积显著小于对照组。与对照组比较，*
2.5 敲低 ERα 抑制移植瘤组织中 Ki-67 和 N-cad 的表达
如图 5所示，与对照组相比，ERα-shRNA1 组 Ki-67 阳性细胞与 N-cad 阳性细胞数目均显著减少（P<0.05）。
图5
免疫组织化学检测 Ki-67 和 N-cad 阳性细胞（×400，n=6，）
a．Ki-67 阳性细胞呈棕色；b．N-cad 阳性细胞呈棕色。与对照组相比较，*
3 讨论
ERα 在细胞中广泛表达，在激素依赖性和非激素依赖性癌症中都起着关键作用。在激素相关的癌症（例如乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌）中，ERα 表达主要通过调节 PI3K/AKT 信号通路来促进疾病进展[17-18]。最近研究表明雌激素与 NSCLC 细胞系 H23 共同培养，癌细胞的增殖明显受到促进，使用抗雌激素药物后，癌细胞的增殖明显受到阻碍[19]。本研究结果表明敲低 ERα 后，细胞克隆形成率明显降低，凋亡比率显著增加，并且细胞增殖相关蛋白 Ki-67、PCNA 的表达量显著下调。PNCA 是一种促进 DNA 延伸的核蛋白，Ki-67 是一种增殖细胞核抗原，其表达与细胞分裂有密切关系，因此 Ki-67 是细胞增殖的理想标志物[20]。因此，敲低 ERα 可抑制 A549 细胞的增殖，促进凋亡，从而发挥抑癌作用。
研究表明 ERα 在肿瘤细胞的转移及侵袭过程中发挥着重要作用。Zhang 等[21]研究发现降低乳腺癌细胞中 ER-α36 的表达可抑制细胞的增殖、转移及侵袭能力。Zhang 等[22]应用免疫组织化学检测发现，ERα 的表达水平与肺腺癌的淋巴结转移呈正相关性。上皮–间质转化（EMT）是促进肿瘤侵袭，转移的主要机制之一，当上皮细胞标志物 E-cad 的表达下降，间充质标志物 N-cad 表达升高时，肿瘤细胞骨架系统排列发生变化细胞生物学性状改变，粘附功能下降易于脱离原发灶，向周围组织侵袭或转移[23]。本研究结果表明敲低 ERα 后，侵袭细胞数明显减少，E-cad 表达显著上调，N-cad 表达明显下调，表明 A549 细胞体外侵袭能力显著降低，因此敲低 ERα 可通过抑制 A549 细胞的侵袭阻止肿瘤恶性发展。
研究表明 ERα 可能以 E2 依赖的方式促进子宫内膜癌的发生、发展[24]。本研究将对照和转染 ERα-shRNA1 的 A549 细胞分别注射到裸鼠皮下，结果发现 ERα-shRNA1 组肿瘤重量和体积明显低于对照组。本研究进一步从组织学层面探讨 ERα 与 A549 细胞增殖与迁移的关系，结果表明敲低 ERα 显著下调 Ki-67 和 N-cad 阳性细胞比率，敲低 ERα 能够显著抑制移植瘤的生长，因此敲低 ERα 可有效阻止 A549 细胞的恶性生物学行为。
综上所述，本研究表明敲低 ERα 的表达能够抑制 A549 细胞的生长、侵袭及转移，减缓体内 A549 细胞移植瘤的生长。目前 ERα 拮抗剂（如 TAM）已广泛应用于临床，通过与雌激素受体的作用来抑制肿瘤的进展和转移[25-26]。因此，失活或敲低 ERα 的表达有望成为治疗 NSCLC 的新方法，不仅能减少肿瘤患者在手术治疗和放化疗过程中的痛苦，而且能尽量延长患者的生存期。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
