引用本文： 黄艳生, 文文, 赖国祥, 潘建光, 苏时祯. 白藜芦醇对海水淹溺性肺损伤大鼠的保护作用研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2021, 20(8): 570-576. doi: 10.7507/1671-6205.202012019 复制
海水淹溺不仅是航海事故、海上生产作业、旅游的死亡原因之一，而且是军队海上训练、作战、抢滩登陆战斗和非战斗减员的重要原因[1]。2016 年，世界卫生组织（WHO）对来自 85 个国家的死亡数据进行统计，结果显示在符合数据标准的 48 个国家中，溺水是 1～14 岁儿童死亡的五大原因之一[2]。不同于淡水淹溺，海水化学成分复杂，加之其本身高渗透压的特性使海水吸入较淡水吸入导致的肺损伤更为严重。尽管淹溺致死率高，但是海水淹溺性肺损伤的相关研究并不多。在药物治疗方面，近年来动物研究证实氯沙坦[3]、4 邻羟基苯乙酸[4]、促红细胞生成素[5]均对大鼠海水淹溺性肺损伤具有一定的保护作用。白藜芦醇为中药虎杖甙成分中的一种化合物[6]。白藜芦醇苷在植物中分布广，含量高，可从天然植物提取，提取工序简单，容易获得[7]。目前已知白藜芦醇具有抗炎、心血管保护、抗休克等疗效[7-11]。本研究拟通过检测对比海水淹溺、白藜芦醇预处理后海水淹溺不同时间点的大鼠血气分析中动脉血氧分压（PaO2）、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）水平的变化，肺组织中超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的含量及活性，了解白藜芦醇是否能从抑制细胞凋亡、抗氧化这两条途径，改善海水淹溺导致肺损伤大鼠的预后，减轻海水淹溺导致的急性肺损伤。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂和仪器
白藜芦醇（北京索莱宝科技有限公司）；SOD、MDA、MPO、抗 Caspase-3 抗体检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；配方海水：严格根据中国国家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我国东南沿海海水主要成分及比例配制（NaCl 26.518 g/L，MgCl2 2.447 g/L，MgSO4 3.305 g/L，CaCl2 1.141 g/L，KCl 0.725 g/L，NaHCO3 0.202 g/L，NaBr 0.083 g/L）。配置好后置于 4℃ 冰箱保存备用，淹溺前配方海水复温至常温（20～25℃）。雅培便携式血气分析仪 i-stat300、雅培 EG7+血液测试片匣（美国雅培 i-STAT 公司）。
1.1.2 实验动物
健康雄性 SD 大鼠 112 只，体重 280～350 g，日龄 58～68 d，批号 SCXK（沪）2018-0006，购于上海斯莱克实验动物有限公司，由联勤保障部队第 900 医院比较医学科提供。实验通过联勤保障部队第 900 医院动物伦理委员会许可（许可证编号 2019-035）。动物外观健康、反应良好。实验动物饲养于联勤保障部队第 900 医院实验动物中心实验室，普通级，室温 20～25℃，层流房间通风良好，全营养饲料购于上海斯莱克实验动物有限公司。适应环境 1 周后按随机数字表法分组并用苦味酸标记。
1.2 方法
1.2.1 模型制备及实验分组
将健康的 SD 大鼠用配好的 2% 戊巴比妥钠 1.5 mL/kg（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰卧，四肢及头部松紧适度地固定于手术板。抬高鼠台头部与桌面呈 45°，直视下经口气管插管（置入深度距上齿 5～6 cm），小棉签间断清理声门上分泌物。用 1.0 mL 注射器连接气管插管、匀速向大鼠气管内灌入海水 2 mL/kg，1 min 内灌完，复制海水淹溺性急性肺损伤动物模型。若大鼠造模后死亡，应记录死亡数量，计算死亡率（死亡率=死亡数/海水淹溺总数，海水淹溺总数=S、S+R 组大鼠数+死亡大鼠数）。递补大鼠编号不变。
将 112 只大鼠随机分成 5 组，空白对照组（C 组）8 只，海水淹溺组（S 组）32 只，白黎芦醇+海水淹溺组（S+R 组）32 只，白黎芦醇组（R 组）8 只，气管插管组（E 组）32 只。S 组、S+R 组、E 组再按照取材时间分为 0.5、1、2、4 h 四个亚组，即 S0.5、S1、S2、S4、（S+R）0.5、（S+R）1、（S+R）2、（S+R）4、E0.5、E1、E2、E4 组，每个亚组 8 只。C 组仅 2% 戊巴比妥钠 1.5 mL/kg（30 mg/kg）腹腔注射麻醉。S 组造模后按不同时间点取动脉血、肺组织标本；S+R 组白藜芦醇 50 mg/kg 预处理（灌胃）3 d，每天 1 次，最后一次灌胃后 24 h 造模，造模后按不同亚组时间取动脉血、肺组织标本；R 组白藜芦醇 50 mg/kg 灌胃 3 d，最后一次灌胃后 24 h 取动脉血、肺组织标本；E 组气管插管 1 min 后拔除，按不同取材时间收集标本、处死。
1.2.2 检测指标
各组收集动脉血行血气分析检测。大鼠处死后，取肺后分离左全肺，称湿重，用吸水纸清除表面血迹和水分，放置于电子天平称量湿重并记录，后置于 110 ℃ 恒温烤箱烘烤 36 h（预实验已知，此时肺组织称重已恒定）后称干重，计算肺组织湿/干重比（W/D）；右肺中、下叶制备 10% 肺组织匀浆后用 ELISA 法检测肺组织中 SOD、MPO 活性及 MDA 含量、Caspase-3 蛋白表达；右肺上叶于 10% 甲醛浸泡 24 h 后行常规包埋蜡块，切片，苏木素–伊红（HE）染色，100 倍光镜下观察肺病理变化并摄片。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 22.0 统计软件。呈正态分布的计量资料以均数±标准差（
±s）表示，使用独立样本 t 检验或者单因素方差分析（One-way ANOVA）。非正态分布的计量资料采用中位数（四分位数）［M（Q）］表示。不服从正态分布或方差不齐采用两独立样本 Wilcoxon 符号秩和检验，多个独立样本比较的 Kruskal-Wallis H 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
本实验总共 120 只大鼠（入组 112 只，死亡 8 只），其中 S 组、S+R 组大鼠共 72 只（造模成功 64 只，死亡 8 只），海水淹溺后，大鼠均出现一过性呼吸暂停（2～5 s），之后恢复呼吸，呼吸频率慢（50～70 次/min）、呼吸费力，平均 5 min 后转为浅快呼吸（110～130 次/min）。平均 40 min 后神志恢复清醒，精神萎靡，反应迟钝，呼吸浅快。所有海水淹溺大鼠胸部外观均未见明显异常。本实验中有 8 只大鼠死亡，死亡率 11.1%（8/72）。本实验采用经口气管插管灌注海水代替传统的颈前气管切开，置管后灌注海水（图 1）。大鼠海水淹溺后局部损伤轻，对颈部血管、神经、甲状腺无任何损伤。麻醉药物代谢后神志恢复清醒，避免颈前切开导致大鼠伤口疼痛。
图1
各种海水淹溺造模方式
a. 传统造模方式采用颈前分离后切开气管，置入导管，注入海水；b. 本研究中造模方式采用经口气管插管，接 1 mL 注射器后注入海水；c. 海水淹溺后死亡大鼠，口鼻腔见白色透明泡沫溢出。
2.2 血气分析
海水淹溺后 0.5 h，腹主动脉血气分析提示大鼠存在Ⅱ型呼吸衰竭、呼吸性酸中毒，随时间进展，缺氧情况渐好转，PaCO2 稍有下降。S+R 组大鼠海水淹溺后 PaO2 下降情况较 S 组明显减轻（各时间点对比，0.5 h、1 h、2 h 组差异均有统计学意义），呼吸性酸中毒明显改善（各时间点对比，0.5 h、1 h 组差异均有统计学意义），恢复时间较 S 组短。C 组、R 组、E 组三组 PaO2、PaCO2 比较差异均无统计学意义。结果见表 1。
表1
各组不同时间 PaO2、PaCO2、MDA、MPO、SOD、Caspase-3、W/D 比值的变化［n=8，M（Q）］
2.3 肺组织 MDA、MPO、SOD 含量
海水淹溺后大鼠出现 MDA 含量明显升高，MPO、SOD 活性明显下降；1 h 之后，MDA 含量渐下降，MPO、SOD 活性渐回升；4 h 时 S 组与 C 组差异无统计学意义。而 S+R 组海水淹溺后也出现 MDA 含量升高，MPO、SOD 活性下降，但是程度较 S 组轻（各时间点对比，0.5 h、1 h、2 h 组差异均有统计学意义），恢复较 S 组快。C 组、R 组、E 组三组 MDA 含量、MPO、SOD 活性比较差异均无统计学意义。结果见表 1。
2.4 肺组织 Caspase-3 含量
海水淹溺后 0.5 h，S 组、S+R 组大鼠肺组织检测 Caspase-3 表达明显高于 C 组，各个时间点 S 组 Caspase-3 较 S+R 组表达水平升高明显（各时间点对比，0.5 h、1 h、2 h、4 h 组差异均有统计学意义）。1 h 之后，S 组、S+R 组 Caspase-3 不同程度下降，S 组下降速度比 S+R 组慢。C 组、R 组、E 组三组 Caspase-3 含量比较差异均无统计学意义。结果见表 1。
2.5 肺组织 W/D 比值
大鼠海水淹溺后，肺组织明显肿胀、充血，S 组较 S+R 组更为严重，S+R 组肺组织 W/D 比值低于同时间段 S 组（各时间点对比，0.5 h、1 h、2 h 组差异均有统计学意义）。1 h 之后，S 组、S+R 组 W/D 比值缓慢下降，造模 4 h 后，S 组、S+R 组 W/D 比值仍高于空白组，差异有统计学意义。C 组、R 组、E 组三组 W/D 比值比较差异均无统计学意义。结果见表 1。
2.6 海水淹溺后肺组织病理变化
2.6.1 大体观
海水淹溺后，所有大鼠胸部外观均未见明显异常。解剖大鼠，胸腔未见积液，夹闭气管后取出整个肺组织，肺部充血、水肿，大鼠肺表面可见大小不等点状、片状出血灶，部分融合，严重者成肝样变，低垂部位明显。分离各叶肺组织，见气管、支气管口白色泡沫溢出。以淹溺后 0.5、1 h 最为明显，至淹溺后 4 h 双肺肿胀减轻，偶有散在出血点，未见明显出血灶。切面可见暗红色斑片灶及大量粉红色泡沫样液体渗出。死亡大鼠解剖胸腔未见积液，双肺对称、均匀地弥漫性肿胀，占满整个胸腔。双肺体积增大、肿胀更加明显。双肺表面可见弥漫性点状、片状出血，气管、支气管口见大量白色泡沫。
2.6.2 肺组织病理学变化
C 组大鼠的肺组织结构较为完整，肺泡腔、肺间质未见明显的水肿、出血以及炎性细胞浸润，肺泡壁厚度基本正常。R 组和 E 组大鼠镜下表现与 C 组相似。S 组大鼠的肺组织结构紊乱，肺泡壁增厚、肺泡腔塌陷、大量红细胞，可见灶性淋巴细胞浸润，支气管上皮细胞脱落，肺毛细血管充血。S+R 组大鼠的肺间质结构紊乱，但是肺泡壁明显薄于 S 组，肺泡出血较 S 组轻；灶性淋巴细胞浸润现象罕见；S+R 组肺损伤较 S 组轻。结果见图 2。
图2
各组大鼠肺组织病理检查像（HE）
a. S 组（a1 和 a2，×200；a3，×100）：大鼠肺组织可见肺组织结构紊乱，肺泡壁增厚、结构破坏、肺泡腔塌陷、炎性细胞浸润，肺泡腔、间质见大量红细胞，在支气管、血管周围常可见灶性淋巴细胞浸润，支气管内可见支气管上皮细胞脱落。b. S+R 组（b1 和 b2，×200；b3，×100）：大鼠肺组织可见肺泡壁增厚，肺泡腔内少量红细胞，较 S 组轻，支气管内上皮细胞脱落现象较 S 组轻。c. C 组（c1，×400）、R 组（c2，×200）、E 组（c3，×100）：C 组大鼠的肺组织结构较为完整，肺泡腔、肺间质未见明显的水肿、出血以及炎性细胞浸润，肺泡壁厚度基本正常，R、E 组大鼠肺组织结构与 C 组相仿。
3 讨论
查阅国内外文献，目前常见海水淹溺造模方法有：（1）颈前部分离后 T 行切开气管，插入“Y”型玻璃套管并固定，灌入海水 4 mL/kg，4 min 内灌完[12]；（2）纵行切开大鼠颈部皮肤，钝性分离至气管前，取 1 mL 注射器向大鼠气管内滴注配方海水（4 mL/kg）[13-15]（图 1a）。两种方法中以后一种更为多见，两种方法均采取颈前有创操作，分离过程中对颈部血管、神经、甲状腺均造成不同程度的损伤。本研究通过改良海水淹溺造模操作方法，改气管切开为经口气管插管（图 1b），模仿人类气管插管模型，直视下置入气管插管套管（深度约至隆突上 0.5～1 cm），淹溺后马上将手术台垂直桌面 90° 放置，舌体外拉固定，保证上气道通畅。此种操作方式简单，避免对大鼠颈部、气管的有创介入，减轻大鼠的疼痛。
在本研究中，海水淹溺后大鼠出现一过性呼吸暂停，2～5 s 后呼吸恢复，但是呼吸窘迫、费力，约 5 min 后变为浅快呼吸，呼吸费力情况改善。抽取大鼠腹主动脉血气分析提示Ⅱ型呼吸衰竭，PaO2 下降，PaCO2 升高，S 组较 S+R 组明显。随着淹溺时间延长，0.5～4 h，PaO2 渐渐回升至正常水平，S+R 组 PaO2 较 S 组回升更快。C、R、E 组 PaO2、PaCO2 将近正常，差异无统计学意义。研究结果提示海水淹溺后出现呼吸衰竭，而白藜芦醇预处理能减轻海水淹溺时大鼠呼吸衰竭情况，使大鼠缺氧情况改善更快，恢复更及时。而 C、R、E 组 PaO2、PaCO2 将近正常，三组之间差异无统计学意义，提示白藜芦醇灌胃、气管插管并未对大鼠造成通气、弥散功能影响。与 C 组相比，海水淹溺 S、S+R 组均出现 PaCO2 升高，考虑可能有三种因素。其一，海水淹溺后导致主气管黏膜水肿，引起通气功能障碍，导致 CO2 储留；其二，大鼠全麻后，自主呼吸功能减弱，咳嗽能力下降，海水灌注后少量液体反流至主气管，导致通气功能减弱、CO2 潴留；第三，海水淹溺及气管插管可能诱发大鼠出现气道痉挛，影响大鼠通气功能。海水淹溺后随着自主呼吸功能恢复，气道黏膜水肿消退，通气功能改善，PaCO2 渐下降，4 h 降至正常。此结果与顾兴等[16]兔海水淹溺实验的结果吻合。本研究中，气管插管组（E 组）未出现 PaCO2 升高的情况，与 C、R 组相比，差异无统计学意义。在顾兴等[16]兔海水淹溺实验中，单纯气管插管组 PaCO2 正常，与本实验结果相同。
MDA 和 SOD、MPO 是一组能够反映体内氧化应激情况的重要指标。正常情况下，机体可通过自身产生的抗氧化剂降解过量的 ROS，减轻组织损伤，其中 SOD 和 MPO 是最重要的抗氧化剂。细胞膜中的多价不饱和脂肪酸与氧自由基发生氧化反应，最终生成 MDA。MDA 为一种常用的体现氧化应激的生物学标记，其浓度可提示脂质过氧化情况，从而间接反映氧自由基的杀伤力及组织细胞的受损情况[17-18]。因此，SOD、MPO、MDA 是监测机体抗氧化功能状态的常用生物学指标。本研究证实，S、S+R 组 SOD、MPO 较 C 组降低，其中 S 组降低最明显；而 S、S+R 组 MDA 较 C、R、E 组升高，其中 S 组升高明显。此结果与马李杰[19]的乙酰化白藜芦醇对海水吸入型肺损伤的保护研究的结果一致。本实验结果提示海水淹溺后出现大鼠氧自由基产生增加，生成 MDA 增多。而机体自身的抗氧化剂，SOD、MPO 明显下降，提示海水淹溺可能通过氧化/抗氧化失衡的机制导致大鼠肺损伤。而白藜芦醇预处理的大鼠，MDA 升高程度较 S 组轻，SOD、MPO 下降程度也较 S 组轻，提示白藜芦醇预处理可能通过减轻氧化应激的途径达到肺保护作用。
细胞凋亡是机体内细胞死亡的重要途径，Caspase-3 是死亡受体介导的外部凋亡途径中的效应凋亡蛋白酶，在细胞凋亡中起到重要的作用。本研究结果显示，S、S+R 大鼠肺组织中 Caspase-3 含量高于 C、R、E 组，S 组增高明显。提示海水吸入后确实导致细胞凋亡增加，引起肺组织损伤。白藜芦醇预处理组 Caspase-3 含量升高，但是程度较 S 组轻，提示白藜芦醇可能通过减轻细胞凋亡而达到对海水淹溺肺损伤的保护作用。
S 组大鼠海水淹溺后肺组织肿胀明显，大鼠肺表面可见大小不等点状、片状出血灶，部分融合，严重者成肝样变，低垂部位明显。显微镜下均可见肺组织结构紊乱，肺泡壁增厚、结构破坏、肺泡腔塌陷、大量红细胞浸润，支气管上皮细胞脱落，而对比淹溺后同时间点的 S+R 组，肺组织肿胀减轻，出血灶减少，镜下肺泡结构紊乱、破坏程度轻。这提示经过白藜芦醇预处理后的大鼠肺损伤明显减轻。
综上所述，本研究结果提示海水淹溺后，大鼠出现肺水肿、抗氧化/抗氧化失衡、细胞凋亡增加，而白藜芦醇可能通过抗氧化、抑制细胞凋亡这两种途径，来减轻海水淹溺导致的大鼠的肺损伤。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
海水淹溺不仅是航海事故、海上生产作业、旅游的死亡原因之一，而且是军队海上训练、作战、抢滩登陆战斗和非战斗减员的重要原因[1]。2016 年，世界卫生组织（WHO）对来自 85 个国家的死亡数据进行统计，结果显示在符合数据标准的 48 个国家中，溺水是 1～14 岁儿童死亡的五大原因之一[2]。不同于淡水淹溺，海水化学成分复杂，加之其本身高渗透压的特性使海水吸入较淡水吸入导致的肺损伤更为严重。尽管淹溺致死率高，但是海水淹溺性肺损伤的相关研究并不多。在药物治疗方面，近年来动物研究证实氯沙坦[3]、4 邻羟基苯乙酸[4]、促红细胞生成素[5]均对大鼠海水淹溺性肺损伤具有一定的保护作用。白藜芦醇为中药虎杖甙成分中的一种化合物[6]。白藜芦醇苷在植物中分布广，含量高，可从天然植物提取，提取工序简单，容易获得[7]。目前已知白藜芦醇具有抗炎、心血管保护、抗休克等疗效[7-11]。本研究拟通过检测对比海水淹溺、白藜芦醇预处理后海水淹溺不同时间点的大鼠血气分析中动脉血氧分压（PaO2）、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）水平的变化，肺组织中超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的含量及活性，了解白藜芦醇是否能从抑制细胞凋亡、抗氧化这两条途径，改善海水淹溺导致肺损伤大鼠的预后，减轻海水淹溺导致的急性肺损伤。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂和仪器
白藜芦醇（北京索莱宝科技有限公司）；SOD、MDA、MPO、抗 Caspase-3 抗体检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；配方海水：严格根据中国国家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我国东南沿海海水主要成分及比例配制（NaCl 26.518 g/L，MgCl2 2.447 g/L，MgSO4 3.305 g/L，CaCl2 1.141 g/L，KCl 0.725 g/L，NaHCO3 0.202 g/L，NaBr 0.083 g/L）。配置好后置于 4℃ 冰箱保存备用，淹溺前配方海水复温至常温（20～25℃）。雅培便携式血气分析仪 i-stat300、雅培 EG7+血液测试片匣（美国雅培 i-STAT 公司）。
1.1.2 实验动物
健康雄性 SD 大鼠 112 只，体重 280～350 g，日龄 58～68 d，批号 SCXK（沪）2018-0006，购于上海斯莱克实验动物有限公司，由联勤保障部队第 900 医院比较医学科提供。实验通过联勤保障部队第 900 医院动物伦理委员会许可（许可证编号 2019-035）。动物外观健康、反应良好。实验动物饲养于联勤保障部队第 900 医院实验动物中心实验室，普通级，室温 20～25℃，层流房间通风良好，全营养饲料购于上海斯莱克实验动物有限公司。适应环境 1 周后按随机数字表法分组并用苦味酸标记。
1.2 方法
1.2.1 模型制备及实验分组
将健康的 SD 大鼠用配好的 2% 戊巴比妥钠 1.5 mL/kg（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰卧，四肢及头部松紧适度地固定于手术板。抬高鼠台头部与桌面呈 45°，直视下经口气管插管（置入深度距上齿 5～6 cm），小棉签间断清理声门上分泌物。用 1.0 mL 注射器连接气管插管、匀速向大鼠气管内灌入海水 2 mL/kg，1 min 内灌完，复制海水淹溺性急性肺损伤动物模型。若大鼠造模后死亡，应记录死亡数量，计算死亡率（死亡率=死亡数/海水淹溺总数，海水淹溺总数=S、S+R 组大鼠数+死亡大鼠数）。递补大鼠编号不变。
将 112 只大鼠随机分成 5 组，空白对照组（C 组）8 只，海水淹溺组（S 组）32 只，白黎芦醇+海水淹溺组（S+R 组）32 只，白黎芦醇组（R 组）8 只，气管插管组（E 组）32 只。S 组、S+R 组、E 组再按照取材时间分为 0.5、1、2、4 h 四个亚组，即 S0.5、S1、S2、S4、（S+R）0.5、（S+R）1、（S+R）2、（S+R）4、E0.5、E1、E2、E4 组，每个亚组 8 只。C 组仅 2% 戊巴比妥钠 1.5 mL/kg（30 mg/kg）腹腔注射麻醉。S 组造模后按不同时间点取动脉血、肺组织标本；S+R 组白藜芦醇 50 mg/kg 预处理（灌胃）3 d，每天 1 次，最后一次灌胃后 24 h 造模，造模后按不同亚组时间取动脉血、肺组织标本；R 组白藜芦醇 50 mg/kg 灌胃 3 d，最后一次灌胃后 24 h 取动脉血、肺组织标本；E 组气管插管 1 min 后拔除，按不同取材时间收集标本、处死。
1.2.2 检测指标
各组收集动脉血行血气分析检测。大鼠处死后，取肺后分离左全肺，称湿重，用吸水纸清除表面血迹和水分，放置于电子天平称量湿重并记录，后置于 110 ℃ 恒温烤箱烘烤 36 h（预实验已知，此时肺组织称重已恒定）后称干重，计算肺组织湿/干重比（W/D）；右肺中、下叶制备 10% 肺组织匀浆后用 ELISA 法检测肺组织中 SOD、MPO 活性及 MDA 含量、Caspase-3 蛋白表达；右肺上叶于 10% 甲醛浸泡 24 h 后行常规包埋蜡块，切片，苏木素–伊红（HE）染色，100 倍光镜下观察肺病理变化并摄片。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 22.0 统计软件。呈正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，使用独立样本 t 检验或者单因素方差分析（One-way ANOVA）。非正态分布的计量资料采用中位数（四分位数）［M（Q）］表示。不服从正态分布或方差不齐采用两独立样本 Wilcoxon 符号秩和检验，多个独立样本比较的 Kruskal-Wallis H 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
本实验总共 120 只大鼠（入组 112 只，死亡 8 只），其中 S 组、S+R 组大鼠共 72 只（造模成功 64 只，死亡 8 只），海水淹溺后，大鼠均出现一过性呼吸暂停（2～5 s），之后恢复呼吸，呼吸频率慢（50～70 次/min）、呼吸费力，平均 5 min 后转为浅快呼吸（110～130 次/min）。平均 40 min 后神志恢复清醒，精神萎靡，反应迟钝，呼吸浅快。所有海水淹溺大鼠胸部外观均未见明显异常。本实验中有 8 只大鼠死亡，死亡率 11.1%（8/72）。本实验采用经口气管插管灌注海水代替传统的颈前气管切开，置管后灌注海水（图 1）。大鼠海水淹溺后局部损伤轻，对颈部血管、神经、甲状腺无任何损伤。麻醉药物代谢后神志恢复清醒，避免颈前切开导致大鼠伤口疼痛。
图1
各种海水淹溺造模方式
a. 传统造模方式采用颈前分离后切开气管，置入导管，注入海水；b. 本研究中造模方式采用经口气管插管，接 1 mL 注射器后注入海水；c. 海水淹溺后死亡大鼠，口鼻腔见白色透明泡沫溢出。
2.2 血气分析
海水淹溺后 0.5 h，腹主动脉血气分析提示大鼠存在Ⅱ型呼吸衰竭、呼吸性酸中毒，随时间进展，缺氧情况渐好转，PaCO2 稍有下降。S+R 组大鼠海水淹溺后 PaO2 下降情况较 S 组明显减轻（各时间点对比，0.5 h、1 h、2 h 组差异均有统计学意义），呼吸性酸中毒明显改善（各时间点对比，0.5 h、1 h 组差异均有统计学意义），恢复时间较 S 组短。C 组、R 组、E 组三组 PaO2、PaCO2 比较差异均无统计学意义。结果见表 1。
表1
各组不同时间 PaO2、PaCO2、MDA、MPO、SOD、Caspase-3、W/D 比值的变化［n=8，M（Q）］
2.3 肺组织 MDA、MPO、SOD 含量
海水淹溺后大鼠出现 MDA 含量明显升高，MPO、SOD 活性明显下降；1 h 之后，MDA 含量渐下降，MPO、SOD 活性渐回升；4 h 时 S 组与 C 组差异无统计学意义。而 S+R 组海水淹溺后也出现 MDA 含量升高，MPO、SOD 活性下降，但是程度较 S 组轻（各时间点对比，0.5 h、1 h、2 h 组差异均有统计学意义），恢复较 S 组快。C 组、R 组、E 组三组 MDA 含量、MPO、SOD 活性比较差异均无统计学意义。结果见表 1。
2.4 肺组织 Caspase-3 含量
海水淹溺后 0.5 h，S 组、S+R 组大鼠肺组织检测 Caspase-3 表达明显高于 C 组，各个时间点 S 组 Caspase-3 较 S+R 组表达水平升高明显（各时间点对比，0.5 h、1 h、2 h、4 h 组差异均有统计学意义）。1 h 之后，S 组、S+R 组 Caspase-3 不同程度下降，S 组下降速度比 S+R 组慢。C 组、R 组、E 组三组 Caspase-3 含量比较差异均无统计学意义。结果见表 1。
2.5 肺组织 W/D 比值
大鼠海水淹溺后，肺组织明显肿胀、充血，S 组较 S+R 组更为严重，S+R 组肺组织 W/D 比值低于同时间段 S 组（各时间点对比，0.5 h、1 h、2 h 组差异均有统计学意义）。1 h 之后，S 组、S+R 组 W/D 比值缓慢下降，造模 4 h 后，S 组、S+R 组 W/D 比值仍高于空白组，差异有统计学意义。C 组、R 组、E 组三组 W/D 比值比较差异均无统计学意义。结果见表 1。
2.6 海水淹溺后肺组织病理变化
2.6.1 大体观
海水淹溺后，所有大鼠胸部外观均未见明显异常。解剖大鼠，胸腔未见积液，夹闭气管后取出整个肺组织，肺部充血、水肿，大鼠肺表面可见大小不等点状、片状出血灶，部分融合，严重者成肝样变，低垂部位明显。分离各叶肺组织，见气管、支气管口白色泡沫溢出。以淹溺后 0.5、1 h 最为明显，至淹溺后 4 h 双肺肿胀减轻，偶有散在出血点，未见明显出血灶。切面可见暗红色斑片灶及大量粉红色泡沫样液体渗出。死亡大鼠解剖胸腔未见积液，双肺对称、均匀地弥漫性肿胀，占满整个胸腔。双肺体积增大、肿胀更加明显。双肺表面可见弥漫性点状、片状出血，气管、支气管口见大量白色泡沫。
2.6.2 肺组织病理学变化
C 组大鼠的肺组织结构较为完整，肺泡腔、肺间质未见明显的水肿、出血以及炎性细胞浸润，肺泡壁厚度基本正常。R 组和 E 组大鼠镜下表现与 C 组相似。S 组大鼠的肺组织结构紊乱，肺泡壁增厚、肺泡腔塌陷、大量红细胞，可见灶性淋巴细胞浸润，支气管上皮细胞脱落，肺毛细血管充血。S+R 组大鼠的肺间质结构紊乱，但是肺泡壁明显薄于 S 组，肺泡出血较 S 组轻；灶性淋巴细胞浸润现象罕见；S+R 组肺损伤较 S 组轻。结果见图 2。
图2
各组大鼠肺组织病理检查像（HE）
a. S 组（a1 和 a2，×200；a3，×100）：大鼠肺组织可见肺组织结构紊乱，肺泡壁增厚、结构破坏、肺泡腔塌陷、炎性细胞浸润，肺泡腔、间质见大量红细胞，在支气管、血管周围常可见灶性淋巴细胞浸润，支气管内可见支气管上皮细胞脱落。b. S+R 组（b1 和 b2，×200；b3，×100）：大鼠肺组织可见肺泡壁增厚，肺泡腔内少量红细胞，较 S 组轻，支气管内上皮细胞脱落现象较 S 组轻。c. C 组（c1，×400）、R 组（c2，×200）、E 组（c3，×100）：C 组大鼠的肺组织结构较为完整，肺泡腔、肺间质未见明显的水肿、出血以及炎性细胞浸润，肺泡壁厚度基本正常，R、E 组大鼠肺组织结构与 C 组相仿。
3 讨论
查阅国内外文献，目前常见海水淹溺造模方法有：（1）颈前部分离后 T 行切开气管，插入“Y”型玻璃套管并固定，灌入海水 4 mL/kg，4 min 内灌完[12]；（2）纵行切开大鼠颈部皮肤，钝性分离至气管前，取 1 mL 注射器向大鼠气管内滴注配方海水（4 mL/kg）[13-15]（图 1a）。两种方法中以后一种更为多见，两种方法均采取颈前有创操作，分离过程中对颈部血管、神经、甲状腺均造成不同程度的损伤。本研究通过改良海水淹溺造模操作方法，改气管切开为经口气管插管（图 1b），模仿人类气管插管模型，直视下置入气管插管套管（深度约至隆突上 0.5～1 cm），淹溺后马上将手术台垂直桌面 90° 放置，舌体外拉固定，保证上气道通畅。此种操作方式简单，避免对大鼠颈部、气管的有创介入，减轻大鼠的疼痛。
在本研究中，海水淹溺后大鼠出现一过性呼吸暂停，2～5 s 后呼吸恢复，但是呼吸窘迫、费力，约 5 min 后变为浅快呼吸，呼吸费力情况改善。抽取大鼠腹主动脉血气分析提示Ⅱ型呼吸衰竭，PaO2 下降，PaCO2 升高，S 组较 S+R 组明显。随着淹溺时间延长，0.5～4 h，PaO2 渐渐回升至正常水平，S+R 组 PaO2 较 S 组回升更快。C、R、E 组 PaO2、PaCO2 将近正常，差异无统计学意义。研究结果提示海水淹溺后出现呼吸衰竭，而白藜芦醇预处理能减轻海水淹溺时大鼠呼吸衰竭情况，使大鼠缺氧情况改善更快，恢复更及时。而 C、R、E 组 PaO2、PaCO2 将近正常，三组之间差异无统计学意义，提示白藜芦醇灌胃、气管插管并未对大鼠造成通气、弥散功能影响。与 C 组相比，海水淹溺 S、S+R 组均出现 PaCO2 升高，考虑可能有三种因素。其一，海水淹溺后导致主气管黏膜水肿，引起通气功能障碍，导致 CO2 储留；其二，大鼠全麻后，自主呼吸功能减弱，咳嗽能力下降，海水灌注后少量液体反流至主气管，导致通气功能减弱、CO2 潴留；第三，海水淹溺及气管插管可能诱发大鼠出现气道痉挛，影响大鼠通气功能。海水淹溺后随着自主呼吸功能恢复，气道黏膜水肿消退，通气功能改善，PaCO2 渐下降，4 h 降至正常。此结果与顾兴等[16]兔海水淹溺实验的结果吻合。本研究中，气管插管组（E 组）未出现 PaCO2 升高的情况，与 C、R 组相比，差异无统计学意义。在顾兴等[16]兔海水淹溺实验中，单纯气管插管组 PaCO2 正常，与本实验结果相同。
MDA 和 SOD、MPO 是一组能够反映体内氧化应激情况的重要指标。正常情况下，机体可通过自身产生的抗氧化剂降解过量的 ROS，减轻组织损伤，其中 SOD 和 MPO 是最重要的抗氧化剂。细胞膜中的多价不饱和脂肪酸与氧自由基发生氧化反应，最终生成 MDA。MDA 为一种常用的体现氧化应激的生物学标记，其浓度可提示脂质过氧化情况，从而间接反映氧自由基的杀伤力及组织细胞的受损情况[17-18]。因此，SOD、MPO、MDA 是监测机体抗氧化功能状态的常用生物学指标。本研究证实，S、S+R 组 SOD、MPO 较 C 组降低，其中 S 组降低最明显；而 S、S+R 组 MDA 较 C、R、E 组升高，其中 S 组升高明显。此结果与马李杰[19]的乙酰化白藜芦醇对海水吸入型肺损伤的保护研究的结果一致。本实验结果提示海水淹溺后出现大鼠氧自由基产生增加，生成 MDA 增多。而机体自身的抗氧化剂，SOD、MPO 明显下降，提示海水淹溺可能通过氧化/抗氧化失衡的机制导致大鼠肺损伤。而白藜芦醇预处理的大鼠，MDA 升高程度较 S 组轻，SOD、MPO 下降程度也较 S 组轻，提示白藜芦醇预处理可能通过减轻氧化应激的途径达到肺保护作用。
细胞凋亡是机体内细胞死亡的重要途径，Caspase-3 是死亡受体介导的外部凋亡途径中的效应凋亡蛋白酶，在细胞凋亡中起到重要的作用。本研究结果显示，S、S+R 大鼠肺组织中 Caspase-3 含量高于 C、R、E 组，S 组增高明显。提示海水吸入后确实导致细胞凋亡增加，引起肺组织损伤。白藜芦醇预处理组 Caspase-3 含量升高，但是程度较 S 组轻，提示白藜芦醇可能通过减轻细胞凋亡而达到对海水淹溺肺损伤的保护作用。
S 组大鼠海水淹溺后肺组织肿胀明显，大鼠肺表面可见大小不等点状、片状出血灶，部分融合，严重者成肝样变，低垂部位明显。显微镜下均可见肺组织结构紊乱，肺泡壁增厚、结构破坏、肺泡腔塌陷、大量红细胞浸润，支气管上皮细胞脱落，而对比淹溺后同时间点的 S+R 组，肺组织肿胀减轻，出血灶减少，镜下肺泡结构紊乱、破坏程度轻。这提示经过白藜芦醇预处理后的大鼠肺损伤明显减轻。
综上所述，本研究结果提示海水淹溺后，大鼠出现肺水肿、抗氧化/抗氧化失衡、细胞凋亡增加，而白藜芦醇可能通过抗氧化、抑制细胞凋亡这两种途径，来减轻海水淹溺导致的大鼠的肺损伤。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
