引用本文： 李乃健, 戴周丽, 陈炽勇, 张佳欢, 何芳, 李靖, 周玉民, 李冰, 冉丕鑫. 通过粪菌移植建立慢性阻塞性肺疾病肠道菌群研究模型及其效果评价. 中国呼吸与危重监护杂志, 2021, 20(7): 465-471. doi: 10.7507/1671-6205.202104004 复制
越来越多的证据表明胃肠道和呼吸道之间的亲密关系，肠道菌群与宿主免疫系统间的相互作用影响着疾病的发生发展，因此提出了肠道与肺部间免疫和炎症的相关性，既“肠–肺轴”的概念[1]。随着近年来对肠道菌群认识的加深，肠道菌群失衡对呼吸系统疾病的影响及其可能的机制开始受到科研工作者的关注[2-3]。微生物–宿主之间的相互影响远远超出了肠道局部，甚至参与了肺部疾病的发生发展。
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种具有多种亚表型的复杂疾病，不仅能够影响肺部，还能够影响心血管、胃肠道和免疫系统[4-5]，但其机制尚未完全明了。慢阻肺虽然是呼吸道疾病，但慢阻肺患者的肺外表现，特别对胃肠道的影响却很常见[5]。最近有研究发现慢阻肺患者的粪便微生物组和代谢组与健康个体的不同，该结果或将有助于寻找慢阻肺的潜在生物标志物[6]。为进一步研究慢阻肺患者肠道菌群的致病机制，我们尝试通过粪菌移植（FMT）建立慢阻肺肠道菌群小鼠模型并初步评价其效果。现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 健康对照和慢阻肺患者入组和粪便收集流程
本研究中的健康对照和慢阻肺患者均来自既往慢阻肺研究队列（国家重点研发计划，No._2016YFC1304101）。在我们先前针对该人群的慢阻肺研究中[7-8]，获得了来自广州的代表性样本，健康人群和患者均来自同一居住区，具有相似的生活方式和饮食习惯。所招募的患者和健康受试者在收集粪便前均签署书面知情同意书。粪便收集流程：统一于清晨，根据 Bristol 粪便性状评估表[9]收集符合Ⅱ-Ⅴ型粪便性状的健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者新鲜粪便各 30 例于无菌容器中，干冰速冻并立即保存于–80 ℃ 低温冰箱。
1.2 肺通气功能检测
肺功能资料收集操作具体规程参照美国胸科协会（ATS）及欧洲呼吸学会（ERS）制定的指南[10]，采用意大利 COSMED 公司的多功能肺测试仪进行检测。主要收集指标包括用力肺活量（FVC）、用力肺活量占预计值百分比（FVC%pred）、第 1 秒用力呼气容积（FEV1）、第 1 秒呼气容积占预计值百分比（FEV1%pred），计算 FEV1 与 FVC 的比值（FEV1/FVC）。
1.3 实验动物与分组
40 只 6～8 周龄 SPF 级 C57BL/6 雄性小鼠购自广州中医药大学动物中心，动物生产许可证号为 SCXK（粤）2013-0034。所有实验方案均经广州医科大学动物管理与使用委员会批准（伦理编号：GY2018-084）。动物饲养设施中的温度和相对湿度分别控制在（23±2）℃ 和 40%～70%，连续 12 h 的光照（06: 00-18: 00）和黑暗交替，无限制提供经消毒的食物和饮水。小鼠在适应性喂养 7 d 后，随机分为四组：磷酸盐缓冲液（PBS）对照组（PBS FMT 组）、健康对照粪菌移植组（健康对照 FMT 组）、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级患者粪菌移植组（慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组）和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者粪菌移植组（慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 组）。每组各 10 只。
1.4 方法
通过 FMT 建立慢阻肺肠道菌群研究小鼠模型的实验流程图见图 1。主要包括小鼠肠道菌群预处理、FMT 和疾病模型评价。
图1
实验流程图
1.4.1 小鼠肠道菌群预处理
为了耗竭小鼠肠道原有微生物，在饮水中加入混合的广谱抗生素（氨苄青霉素 1 g/L、硫酸新霉素 1 g/L、甲硝唑 1 g/L 和万古霉素 0.5 g/L，均购自 Sigma 公司），供自由饮用 21 d 以清除小鼠原有肠道菌群[11]。在 FMT 前 2 天，停止在饮用水中使用广谱抗生素。随机收集 20 只小鼠在抗生素使用前后的粪便行 16S rRNA 测序分析。
1.4.2 FMT
分别在 30 例健康对照组、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级患者组和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者组中的每一例挑取 0.5 g 粪便，然后按组混合，然后以 1∶4 的比例将粪便重悬于 PBS 中并均质混匀。将混悬液在 4 ℃ 下以 200×g 离心 10 min，收集上清液即为待移植的粪菌液并–80 ℃ 保存。分别对健康对照 FMT 组、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 组待移植小鼠，隔天行单次灌胃 100 μL 菌液进行人–小鼠肠道菌群转移，在 28 d 内共进行 14 次灌胃，PBS FMT 组小鼠以 PBS 灌胃作为对照。
1.4.3 疾病模型评价
在 FMT 后第 29 天采集全血行单个核细胞分析，收集小鼠的粪便行 16S rRNA 测序分析。
根据体重（1% 戊巴比妥钠，80 mg/kg）通过腹膜内注射麻醉小鼠，通过心脏采血的方法收集全血。为评估 FMT 对小鼠免疫表型的影响，通过流式细胞术对小鼠全血中 T/B 淋巴细胞表型进行分析。T/B 淋巴细胞亚群定义为 B 淋巴细胞（CD3–CD19+），辅助 T 淋巴细胞（CD3+CD4+）和细胞毒性 T 淋巴细胞（CD3+CD8+）。流式细胞术检测：使用小鼠外周血单核细胞分离试剂盒（索莱宝，北京）分离外周血单个核细胞。首先在冰上将单个核细胞与抗 CD16/32 抗体孵育 15 min，从而阻断 Fc 受体，离心并洗涤细胞。室温下将细胞与 BB600 标记的抗小鼠 CD3、APC 标记的抗小鼠 CD19、BV421 标记的抗小鼠 CD8 和 FITC 标记的抗小鼠 CD4（BD Biosciences，美国）抗体混合物孵育 30 min 进行细胞表面染色。孵育结束后洗涤细胞除去未结合的抗体，FACS 裂解溶液（BD Biosciences，美国）固定细胞，CytoFLEX 流式细胞仪（贝克曼库尔特，美国）上机检测，并使用 FlowJo 软件进行分析。
使用 HiPure Stool DNA 试剂盒（Magen BioSciences，美国）对 100 mg 人和小鼠粪便样品进行总细菌 DNA 提取。以每个样品中提取的 DNA 为模板，PCR 扩增 16S rRNA 基因的 V3-V4 区域，根据 Illumina 基因组测序指南进行 16S rRNA 基因扩增、转录、标记以及杂交[12]。16S 扩增子 PCR 正向引物 5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3'；反向引物 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3'[13]。在 25 μL 的反应体系中进行 PCR 扩增，其中包含 2.5 μL 微生物 DNA（5 ng/μL），各 5 μL 的正反引物（1 μmol/L）和 12.5 μL 的 2× KAPA HiFi 高保真热启动 DNA 聚合酶预混液（KAPA Biosystems 公司，美国）。AMPure XP 磁珠（贝克曼库尔特公司，美国）对 16S V3-V4 区扩增子产物进行纯化，Nextera XT Index Kit（Illumina 公司，美国）制备 MiSeq 用文库，反应条件和步骤详见参考文献[12]。最后在 RiboBio 基因组中心（广东，广州）的 Illumina Miseq PE250 平台上进行测序分析。测序下机的数据经过处理后进行生物信息学分析[14]：对原始数据进行过滤，去除低质量数据，得到 clean data 后进行后续分析；将 Paired-end reads 拼接为 Tags，并且去冗余，获取 Unique Tags；对 Unique Tags 进行聚类，生成操作分类单元（OTU）；利用已经存在的 16S 数据库对 OTU 序列进行物种注释；利用生成的 OTU 进行物种分类、统计和样品间 α 多样性分析，以评估小鼠肠道菌群的丰度和多样性，其中，OTU 的数值初步说明了物种的丰富程度，Chao 1 和 Shannon 指数用于估算群落多样性的高低。本研究原始测序数据已上传至 Sequence Read Archive 数据库（
1.5 统计学方法
采用 SPSS 24.0 统计软件。符合正态分布数据以均数±标准差（
±s）表示，多组间比较分析采用单因素方差分析，使用 Bonferroni 方法对 P 值进行校正。不符合正态分布的变量以中位数（四分位数间距）［M（Q）］表示。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 入组对象一般特征
研究纳入健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者各 30 例，一般人口学特征以及肺功能差异如表 1 所示。与健康对照组相比，慢阻肺患者组吸烟指数明显升高，体重指数和肺功能明显下降。
表1
30 例健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ 级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者一般特征（
）
2.2 广谱抗生素预处理对小鼠肠道菌群的影响
经 α 多样性分析后发现，与抗生素处理前相比经广谱抗生素预处理 21 d 后，小鼠肠道的 OTU、Chao 1 和 Shannon 指数均显著下降（P<0.001，图 2），证实在广谱抗生素预处理后小鼠肠道细菌的丰富程度和多样性显著下降，自身肠道菌群受到明显耗竭。
图2
广谱抗生素预处理前后小鼠肠道菌群的变化
经广谱抗生素预处理后小鼠肠道菌群显著耗竭，表现为物种的丰富程度减少（a）和多样性下降（b 和 c）。
2.3 FMT 后小鼠肠道菌群定植效果评价
与 PBS FMT 组相比，接受健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者 FMT 的受体小鼠其 OTU 显著升高（P<0.01，图 3a）。同样，代表菌群多样性指数的 Chao 1 和 Shannon 指数在接受健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者 FMT 的受体小鼠中亦显著升高（P<0.01 或 P<0.05，图 3b、c）。但是，OTU、Chao 1 和 Shannon 指数在健康对照 FMT 组、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 组中无显著性差异。在门水平，来自 PBS FMT 组、健康 FMT 组、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组受体小鼠中所有的粪便样本均包含四个主要细菌门（图 4a）。在拟杆菌门、厚壁菌门、变形杆菌门和放线门中，PBS FMT 组和其余 3 组 FMT 组之间细菌门的相对丰度具有显著性差异（P<0.05 或 P<0.01，图 4a，表 2）。接受 FMT 的受体小鼠表现出比 PBS FMT 组更高的菌群丰度和多样性，在细菌组成上亦存在显著性差异。
图3
FMT 后四组实验小鼠肠道菌群变化
与 PBS 移植组相比，接受健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ或慢阻肺Ⅲ-Ⅳ患者的 FMT 后，受体小鼠肠道菌群物种的丰富程度（a）和多样性指数（b 和 c）均得到显著升高，但健康对照 FMT 组、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组三组间无明显差异。
图4
FMT 后四组实验小鼠肠道菌群组成差异以及原粪菌液菌群与实验小鼠肠道菌群差异
a. FMT 后四组实验小鼠肠道菌群组成差异。四组实验小鼠粪便样本均包含拟杆菌门、厚壁菌门、变形杆菌门和放线门，占比超过 80% 以上。与 PBS FMT 组相比，接受健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者 FMT 的受体小鼠肠道菌群组成出现显著性差异。b-d. 原粪菌液菌群与实验小鼠肠道菌群差异。
表2
FMT 后四组实验小鼠肠道菌群差异［%，M（Q）］
与原粪菌液中的菌群进行比较，接受健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ或慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 后受体小鼠肠道菌群与原粪菌液在细菌组成上存在一定差异，均主要表现在拟杆菌门丰度降低，厚壁菌门和放线菌门丰度升高（P<0.05 或 P<0.01，图 4b～d），而变形菌门丰度基本相似。
2.4 FMT 对小鼠外周血免疫功能的影响
与健康对照组相比，接受慢阻肺Ⅰ-Ⅱ患者和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ患者粪便菌群的受体小鼠其外周血 CD3+ T 淋巴细胞、辅助 T 淋巴细胞和细胞毒性 T 淋巴细胞（P<0.05 或 P<0.01，图 5a-c）百分比明显升高，而 B 淋巴细胞百分比显著下降（P<0.05，图 5d）。
图5
FMT 对实验小鼠外周血 T/B 淋巴细胞表型的影响
a. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组 CD3+细胞百分比较健康对照 FMT 组升高。b. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组辅助 T 淋巴细胞（CD3+CD4+）百分比较健康对照 FMT 组升高。c. 慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组细胞毒性 T 淋巴细胞（CD3+CD8+）百分比较健康对照 FMT 组升高。d. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组 B 淋巴细胞（CD3–CD19+）百分比较健康对照 FMT 组减少。结果显示：±
3 讨论
迄今为止，开始有少数研究报道了肠道菌群与慢阻肺之间存在关联[6, 15-16]，肠道菌群失衡在慢阻肺发病中的作用及其机制开始受到关注。FMT 小鼠模型已经广泛应用于对炎症性肠病、自闭症、肺炎和肿瘤等疾病中出现的肠道菌群失衡的研究[11, 17-19]，但有关如何建立慢阻肺的肠道菌群研究模型却鲜有报道。在本研究中，证实了通过 FMT，可将慢阻肺患者肠道菌群移植到受体小鼠体内并定植，重建了受体小鼠肠道菌群，并且经过移植之后受体小鼠具有部分原慢阻肺患者肠道菌群特征，并在小鼠体内引起了免疫功能失调。
虽然慢阻肺是呼吸道疾病，但它与慢性胃肠道疾病常常并存[5]，肠道菌群失衡对慢阻肺发生发展的影响仍知之甚少。Bowerman 等[6]发现慢阻肺患者和健康对照组两组间的肠道菌群有 146 种菌群存在显著性差异，包括链球菌 sp000187445、前庭链球菌和链霉菌在内的多个种属与慢阻肺患者的肺功能下降相关。在建立吸烟诱导的慢阻肺小鼠模型上，通过同笼饲养、抗生素处理和 FMT 实验，证实了肠道菌群可影响慢阻肺的进展[15]。我们前期研究发现，在大气颗粒物暴露诱导的慢阻肺大鼠模型中，随着暴露时间的延长大鼠逐渐出现肠道菌群失调，短链脂肪酸减少和肠道菌群移位，这种变化与肺气肿严重程度成正相关，在动物模型上提示肠道菌群失衡可能参与了慢阻肺的发生发展[16]。上述有限的研究将慢阻肺和肠道菌群失衡建立起了联系，而通过 FMT 建立有效的慢阻肺肠道菌群模型则有助于研究的进一步开展。
肠道菌群以多种方式与人类宿主保持共生关系，包括调节宿主免疫力、消化食物、调控肠道内分泌和神经信号、影响药物作用和代谢、清除毒素以及产生影响宿主的多种化合物[20]。健康的肠道菌群可通过暴露结构配体［如脂多糖（LPS）和（或）肽聚糖］和分泌代谢物［如短链脂肪酸（SCFA）］来维持肠道内局部免疫应答的平衡和维持屏障完整性[21]。综合既往文献报道肠道菌群失衡参与慢阻肺发病的可能机制如下：各种原因所致的肠道菌群失衡，一方面引起肠道菌群有益代谢产物（如 SCFA、色氨酸代谢物和次级胆汁酸等）减少而有害代谢产物（如三甲胺）增加，导致肠道屏障受损、肠道上皮细胞暴露和肠道通透性增加；另一方面肠道菌群比例失衡引起条件致病菌比例增多，导致肠道菌群移位，微生物产物（如 LPS）和有害代谢产物与免疫细胞的相互作用[22-23]。上述两方面结果均可导致肠道局部免疫被激活，释放促炎性细胞因子入血并通过血液循环到达肺部，进而启动肺部的炎症级联反应，最终引起气道重塑、黏液高分泌和细胞基质破坏等病理改变。
FMT 作为重建肠道菌群的方法，已被证明在多种代谢和免疫性疾病中取得良好的临床疗效，也在如溃疡性结肠炎、克罗恩病和结肠癌等多种肠道疾病模型上得到广泛的应用。FMT 后菌群是否能够成功定植在受体小鼠肠道是 FMT 产生效果的基础，而供体和宿主之间种属的差异以及供体选择对于 FMT 的成功至关重要[24]。既往研究结果显示，与抗生素耗竭小鼠肠道菌群这种方法相比，采用无菌小鼠进行粪 FMT 在效果上更为精准，可免受肠道本底菌群的影响[25]，但无菌小鼠存在价格昂贵、饲养条件苛刻和无法暴露造模等缺点。本研究中采用广谱抗生素预处理小鼠后再进行 FMT，实验结果显示接受 FMT 的受体小鼠表现出比 PBS FMT 组更高的菌群丰度和多样性，在细菌组成上保留有原慢阻肺患者肠道菌群部分特征，证实了慢阻肺患者肠道菌群可成功进行移植。
本研究发现在移植慢阻肺患者粪便后受体小鼠出现免疫功能失调。慢阻肺 FMT 组与健康对照 FMT 组相比，CD3+CD4+和 CD3+CD8+ T 细胞的百分比明显升高。既往研究显示适应性免疫反应与慢阻肺的发病有关，尤其是 CD4+和 CD8+ T 细胞的数量和功能异常[26-28]。有研究证实肠道菌群介导的慢性低度炎症以及对免疫功能的影响，与肥胖、癌症等疾病的发生发展有关[29-30]，但肠道菌群介导的慢性炎症是否与慢阻肺相关目前尚不清楚。我们的小鼠实验支持了慢阻肺中微生物群和肠肺轴之间致病联系的观点[1, 31]。但本研究仍存在以下几点局限性。首先，我们是在横断面下对健康对照和慢阻肺患者的肠道微生物群进行测序，并未对所获得的数据进行深入分析，并且在缺乏纵向或干预性研究设计的情况下，很难确定肠道微生物群失调是慢阻肺的原因还是结果。其次，本研究是使用来自相同组别的健康对照和慢阻肺患者亚组的粪菌液进行混合后再移植，因此单个患者肠道菌群的特征对 FMT 结果的影响仍有待确定。第三，肠道菌群代表了一个庞大的微生物群落，每种细菌物种都应该在小鼠中进行单个菌群移植，以系统分析慢阻肺患者肠道菌群对宿主影响。
综上所述，通过 FMT 可成功建立慢阻肺肠道菌群研究模型，但肠道菌群在慢阻肺发病中的作用及其可能的机制仍有待进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
越来越多的证据表明胃肠道和呼吸道之间的亲密关系，肠道菌群与宿主免疫系统间的相互作用影响着疾病的发生发展，因此提出了肠道与肺部间免疫和炎症的相关性，既“肠–肺轴”的概念[1]。随着近年来对肠道菌群认识的加深，肠道菌群失衡对呼吸系统疾病的影响及其可能的机制开始受到科研工作者的关注[2-3]。微生物–宿主之间的相互影响远远超出了肠道局部，甚至参与了肺部疾病的发生发展。
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种具有多种亚表型的复杂疾病，不仅能够影响肺部，还能够影响心血管、胃肠道和免疫系统[4-5]，但其机制尚未完全明了。慢阻肺虽然是呼吸道疾病，但慢阻肺患者的肺外表现，特别对胃肠道的影响却很常见[5]。最近有研究发现慢阻肺患者的粪便微生物组和代谢组与健康个体的不同，该结果或将有助于寻找慢阻肺的潜在生物标志物[6]。为进一步研究慢阻肺患者肠道菌群的致病机制，我们尝试通过粪菌移植（FMT）建立慢阻肺肠道菌群小鼠模型并初步评价其效果。现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 健康对照和慢阻肺患者入组和粪便收集流程
本研究中的健康对照和慢阻肺患者均来自既往慢阻肺研究队列（国家重点研发计划，No._2016YFC1304101）。在我们先前针对该人群的慢阻肺研究中[7-8]，获得了来自广州的代表性样本，健康人群和患者均来自同一居住区，具有相似的生活方式和饮食习惯。所招募的患者和健康受试者在收集粪便前均签署书面知情同意书。粪便收集流程：统一于清晨，根据 Bristol 粪便性状评估表[9]收集符合Ⅱ-Ⅴ型粪便性状的健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者新鲜粪便各 30 例于无菌容器中，干冰速冻并立即保存于–80 ℃ 低温冰箱。
1.2 肺通气功能检测
肺功能资料收集操作具体规程参照美国胸科协会（ATS）及欧洲呼吸学会（ERS）制定的指南[10]，采用意大利 COSMED 公司的多功能肺测试仪进行检测。主要收集指标包括用力肺活量（FVC）、用力肺活量占预计值百分比（FVC%pred）、第 1 秒用力呼气容积（FEV1）、第 1 秒呼气容积占预计值百分比（FEV1%pred），计算 FEV1 与 FVC 的比值（FEV1/FVC）。
1.3 实验动物与分组
40 只 6～8 周龄 SPF 级 C57BL/6 雄性小鼠购自广州中医药大学动物中心，动物生产许可证号为 SCXK（粤）2013-0034。所有实验方案均经广州医科大学动物管理与使用委员会批准（伦理编号：GY2018-084）。动物饲养设施中的温度和相对湿度分别控制在（23±2）℃ 和 40%～70%，连续 12 h 的光照（06: 00-18: 00）和黑暗交替，无限制提供经消毒的食物和饮水。小鼠在适应性喂养 7 d 后，随机分为四组：磷酸盐缓冲液（PBS）对照组（PBS FMT 组）、健康对照粪菌移植组（健康对照 FMT 组）、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级患者粪菌移植组（慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组）和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者粪菌移植组（慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 组）。每组各 10 只。
1.4 方法
通过 FMT 建立慢阻肺肠道菌群研究小鼠模型的实验流程图见图 1。主要包括小鼠肠道菌群预处理、FMT 和疾病模型评价。
图1
实验流程图
1.4.1 小鼠肠道菌群预处理
为了耗竭小鼠肠道原有微生物，在饮水中加入混合的广谱抗生素（氨苄青霉素 1 g/L、硫酸新霉素 1 g/L、甲硝唑 1 g/L 和万古霉素 0.5 g/L，均购自 Sigma 公司），供自由饮用 21 d 以清除小鼠原有肠道菌群[11]。在 FMT 前 2 天，停止在饮用水中使用广谱抗生素。随机收集 20 只小鼠在抗生素使用前后的粪便行 16S rRNA 测序分析。
1.4.2 FMT
分别在 30 例健康对照组、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级患者组和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者组中的每一例挑取 0.5 g 粪便，然后按组混合，然后以 1∶4 的比例将粪便重悬于 PBS 中并均质混匀。将混悬液在 4 ℃ 下以 200×g 离心 10 min，收集上清液即为待移植的粪菌液并–80 ℃ 保存。分别对健康对照 FMT 组、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 组待移植小鼠，隔天行单次灌胃 100 μL 菌液进行人–小鼠肠道菌群转移，在 28 d 内共进行 14 次灌胃，PBS FMT 组小鼠以 PBS 灌胃作为对照。
1.4.3 疾病模型评价
在 FMT 后第 29 天采集全血行单个核细胞分析，收集小鼠的粪便行 16S rRNA 测序分析。
根据体重（1% 戊巴比妥钠，80 mg/kg）通过腹膜内注射麻醉小鼠，通过心脏采血的方法收集全血。为评估 FMT 对小鼠免疫表型的影响，通过流式细胞术对小鼠全血中 T/B 淋巴细胞表型进行分析。T/B 淋巴细胞亚群定义为 B 淋巴细胞（CD3–CD19+），辅助 T 淋巴细胞（CD3+CD4+）和细胞毒性 T 淋巴细胞（CD3+CD8+）。流式细胞术检测：使用小鼠外周血单核细胞分离试剂盒（索莱宝，北京）分离外周血单个核细胞。首先在冰上将单个核细胞与抗 CD16/32 抗体孵育 15 min，从而阻断 Fc 受体，离心并洗涤细胞。室温下将细胞与 BB600 标记的抗小鼠 CD3、APC 标记的抗小鼠 CD19、BV421 标记的抗小鼠 CD8 和 FITC 标记的抗小鼠 CD4（BD Biosciences，美国）抗体混合物孵育 30 min 进行细胞表面染色。孵育结束后洗涤细胞除去未结合的抗体，FACS 裂解溶液（BD Biosciences，美国）固定细胞，CytoFLEX 流式细胞仪（贝克曼库尔特，美国）上机检测，并使用 FlowJo 软件进行分析。
使用 HiPure Stool DNA 试剂盒（Magen BioSciences，美国）对 100 mg 人和小鼠粪便样品进行总细菌 DNA 提取。以每个样品中提取的 DNA 为模板，PCR 扩增 16S rRNA 基因的 V3-V4 区域，根据 Illumina 基因组测序指南进行 16S rRNA 基因扩增、转录、标记以及杂交[12]。16S 扩增子 PCR 正向引物 5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3'；反向引物 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3'[13]。在 25 μL 的反应体系中进行 PCR 扩增，其中包含 2.5 μL 微生物 DNA（5 ng/μL），各 5 μL 的正反引物（1 μmol/L）和 12.5 μL 的 2× KAPA HiFi 高保真热启动 DNA 聚合酶预混液（KAPA Biosystems 公司，美国）。AMPure XP 磁珠（贝克曼库尔特公司，美国）对 16S V3-V4 区扩增子产物进行纯化，Nextera XT Index Kit（Illumina 公司，美国）制备 MiSeq 用文库，反应条件和步骤详见参考文献[12]。最后在 RiboBio 基因组中心（广东，广州）的 Illumina Miseq PE250 平台上进行测序分析。测序下机的数据经过处理后进行生物信息学分析[14]：对原始数据进行过滤，去除低质量数据，得到 clean data 后进行后续分析；将 Paired-end reads 拼接为 Tags，并且去冗余，获取 Unique Tags；对 Unique Tags 进行聚类，生成操作分类单元（OTU）；利用已经存在的 16S 数据库对 OTU 序列进行物种注释；利用生成的 OTU 进行物种分类、统计和样品间 α 多样性分析，以评估小鼠肠道菌群的丰度和多样性，其中，OTU 的数值初步说明了物种的丰富程度，Chao 1 和 Shannon 指数用于估算群落多样性的高低。本研究原始测序数据已上传至 Sequence Read Archive 数据库（
1.5 统计学方法
采用 SPSS 24.0 统计软件。符合正态分布数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较分析采用单因素方差分析，使用 Bonferroni 方法对 P 值进行校正。不符合正态分布的变量以中位数（四分位数间距）［M（Q）］表示。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 入组对象一般特征
研究纳入健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者各 30 例，一般人口学特征以及肺功能差异如表 1 所示。与健康对照组相比，慢阻肺患者组吸烟指数明显升高，体重指数和肺功能明显下降。
表1
30 例健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ 级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者一般特征（）
2.2 广谱抗生素预处理对小鼠肠道菌群的影响
经 α 多样性分析后发现，与抗生素处理前相比经广谱抗生素预处理 21 d 后，小鼠肠道的 OTU、Chao 1 和 Shannon 指数均显著下降（P<0.001，图 2），证实在广谱抗生素预处理后小鼠肠道细菌的丰富程度和多样性显著下降，自身肠道菌群受到明显耗竭。
图2
广谱抗生素预处理前后小鼠肠道菌群的变化
经广谱抗生素预处理后小鼠肠道菌群显著耗竭，表现为物种的丰富程度减少（a）和多样性下降（b 和 c）。
2.3 FMT 后小鼠肠道菌群定植效果评价
与 PBS FMT 组相比，接受健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者 FMT 的受体小鼠其 OTU 显著升高（P<0.01，图 3a）。同样，代表菌群多样性指数的 Chao 1 和 Shannon 指数在接受健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者 FMT 的受体小鼠中亦显著升高（P<0.01 或 P<0.05，图 3b、c）。但是，OTU、Chao 1 和 Shannon 指数在健康对照 FMT 组、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 组中无显著性差异。在门水平，来自 PBS FMT 组、健康 FMT 组、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组受体小鼠中所有的粪便样本均包含四个主要细菌门（图 4a）。在拟杆菌门、厚壁菌门、变形杆菌门和放线门中，PBS FMT 组和其余 3 组 FMT 组之间细菌门的相对丰度具有显著性差异（P<0.05 或 P<0.01，图 4a，表 2）。接受 FMT 的受体小鼠表现出比 PBS FMT 组更高的菌群丰度和多样性，在细菌组成上亦存在显著性差异。
图3
FMT 后四组实验小鼠肠道菌群变化
与 PBS 移植组相比，接受健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ或慢阻肺Ⅲ-Ⅳ患者的 FMT 后，受体小鼠肠道菌群物种的丰富程度（a）和多样性指数（b 和 c）均得到显著升高，但健康对照 FMT 组、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组三组间无明显差异。
图4
FMT 后四组实验小鼠肠道菌群组成差异以及原粪菌液菌群与实验小鼠肠道菌群差异
a. FMT 后四组实验小鼠肠道菌群组成差异。四组实验小鼠粪便样本均包含拟杆菌门、厚壁菌门、变形杆菌门和放线门，占比超过 80% 以上。与 PBS FMT 组相比，接受健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ级和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ级患者 FMT 的受体小鼠肠道菌群组成出现显著性差异。b-d. 原粪菌液菌群与实验小鼠肠道菌群差异。
表2
FMT 后四组实验小鼠肠道菌群差异［%，M（Q）］
与原粪菌液中的菌群进行比较，接受健康对照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ或慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 后受体小鼠肠道菌群与原粪菌液在细菌组成上存在一定差异，均主要表现在拟杆菌门丰度降低，厚壁菌门和放线菌门丰度升高（P<0.05 或 P<0.01，图 4b～d），而变形菌门丰度基本相似。
2.4 FMT 对小鼠外周血免疫功能的影响
与健康对照组相比，接受慢阻肺Ⅰ-Ⅱ患者和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ患者粪便菌群的受体小鼠其外周血 CD3+ T 淋巴细胞、辅助 T 淋巴细胞和细胞毒性 T 淋巴细胞（P<0.05 或 P<0.01，图 5a-c）百分比明显升高，而 B 淋巴细胞百分比显著下降（P<0.05，图 5d）。
图5
FMT 对实验小鼠外周血 T/B 淋巴细胞表型的影响
a. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组 CD3+细胞百分比较健康对照 FMT 组升高。b. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组辅助 T 淋巴细胞（CD3+CD4+）百分比较健康对照 FMT 组升高。c. 慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组细胞毒性 T 淋巴细胞（CD3+CD8+）百分比较健康对照 FMT 组升高。d. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 组和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 组 B 淋巴细胞（CD3–CD19+）百分比较健康对照 FMT 组减少。结果显示：±
3 讨论
迄今为止，开始有少数研究报道了肠道菌群与慢阻肺之间存在关联[6, 15-16]，肠道菌群失衡在慢阻肺发病中的作用及其机制开始受到关注。FMT 小鼠模型已经广泛应用于对炎症性肠病、自闭症、肺炎和肿瘤等疾病中出现的肠道菌群失衡的研究[11, 17-19]，但有关如何建立慢阻肺的肠道菌群研究模型却鲜有报道。在本研究中，证实了通过 FMT，可将慢阻肺患者肠道菌群移植到受体小鼠体内并定植，重建了受体小鼠肠道菌群，并且经过移植之后受体小鼠具有部分原慢阻肺患者肠道菌群特征，并在小鼠体内引起了免疫功能失调。
虽然慢阻肺是呼吸道疾病，但它与慢性胃肠道疾病常常并存[5]，肠道菌群失衡对慢阻肺发生发展的影响仍知之甚少。Bowerman 等[6]发现慢阻肺患者和健康对照组两组间的肠道菌群有 146 种菌群存在显著性差异，包括链球菌 sp000187445、前庭链球菌和链霉菌在内的多个种属与慢阻肺患者的肺功能下降相关。在建立吸烟诱导的慢阻肺小鼠模型上，通过同笼饲养、抗生素处理和 FMT 实验，证实了肠道菌群可影响慢阻肺的进展[15]。我们前期研究发现，在大气颗粒物暴露诱导的慢阻肺大鼠模型中，随着暴露时间的延长大鼠逐渐出现肠道菌群失调，短链脂肪酸减少和肠道菌群移位，这种变化与肺气肿严重程度成正相关，在动物模型上提示肠道菌群失衡可能参与了慢阻肺的发生发展[16]。上述有限的研究将慢阻肺和肠道菌群失衡建立起了联系，而通过 FMT 建立有效的慢阻肺肠道菌群模型则有助于研究的进一步开展。
肠道菌群以多种方式与人类宿主保持共生关系，包括调节宿主免疫力、消化食物、调控肠道内分泌和神经信号、影响药物作用和代谢、清除毒素以及产生影响宿主的多种化合物[20]。健康的肠道菌群可通过暴露结构配体［如脂多糖（LPS）和（或）肽聚糖］和分泌代谢物［如短链脂肪酸（SCFA）］来维持肠道内局部免疫应答的平衡和维持屏障完整性[21]。综合既往文献报道肠道菌群失衡参与慢阻肺发病的可能机制如下：各种原因所致的肠道菌群失衡，一方面引起肠道菌群有益代谢产物（如 SCFA、色氨酸代谢物和次级胆汁酸等）减少而有害代谢产物（如三甲胺）增加，导致肠道屏障受损、肠道上皮细胞暴露和肠道通透性增加；另一方面肠道菌群比例失衡引起条件致病菌比例增多，导致肠道菌群移位，微生物产物（如 LPS）和有害代谢产物与免疫细胞的相互作用[22-23]。上述两方面结果均可导致肠道局部免疫被激活，释放促炎性细胞因子入血并通过血液循环到达肺部，进而启动肺部的炎症级联反应，最终引起气道重塑、黏液高分泌和细胞基质破坏等病理改变。
FMT 作为重建肠道菌群的方法，已被证明在多种代谢和免疫性疾病中取得良好的临床疗效，也在如溃疡性结肠炎、克罗恩病和结肠癌等多种肠道疾病模型上得到广泛的应用。FMT 后菌群是否能够成功定植在受体小鼠肠道是 FMT 产生效果的基础，而供体和宿主之间种属的差异以及供体选择对于 FMT 的成功至关重要[24]。既往研究结果显示，与抗生素耗竭小鼠肠道菌群这种方法相比，采用无菌小鼠进行粪 FMT 在效果上更为精准，可免受肠道本底菌群的影响[25]，但无菌小鼠存在价格昂贵、饲养条件苛刻和无法暴露造模等缺点。本研究中采用广谱抗生素预处理小鼠后再进行 FMT，实验结果显示接受 FMT 的受体小鼠表现出比 PBS FMT 组更高的菌群丰度和多样性，在细菌组成上保留有原慢阻肺患者肠道菌群部分特征，证实了慢阻肺患者肠道菌群可成功进行移植。
本研究发现在移植慢阻肺患者粪便后受体小鼠出现免疫功能失调。慢阻肺 FMT 组与健康对照 FMT 组相比，CD3+CD4+和 CD3+CD8+ T 细胞的百分比明显升高。既往研究显示适应性免疫反应与慢阻肺的发病有关，尤其是 CD4+和 CD8+ T 细胞的数量和功能异常[26-28]。有研究证实肠道菌群介导的慢性低度炎症以及对免疫功能的影响，与肥胖、癌症等疾病的发生发展有关[29-30]，但肠道菌群介导的慢性炎症是否与慢阻肺相关目前尚不清楚。我们的小鼠实验支持了慢阻肺中微生物群和肠肺轴之间致病联系的观点[1, 31]。但本研究仍存在以下几点局限性。首先，我们是在横断面下对健康对照和慢阻肺患者的肠道微生物群进行测序，并未对所获得的数据进行深入分析，并且在缺乏纵向或干预性研究设计的情况下，很难确定肠道微生物群失调是慢阻肺的原因还是结果。其次，本研究是使用来自相同组别的健康对照和慢阻肺患者亚组的粪菌液进行混合后再移植，因此单个患者肠道菌群的特征对 FMT 结果的影响仍有待确定。第三，肠道菌群代表了一个庞大的微生物群落，每种细菌物种都应该在小鼠中进行单个菌群移植，以系统分析慢阻肺患者肠道菌群对宿主影响。
综上所述，通过 FMT 可成功建立慢阻肺肠道菌群研究模型，但肠道菌群在慢阻肺发病中的作用及其可能的机制仍有待进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
