引用本文： 朱锦琪, 陈剑波, 杨红忠, 高欣. miR-27a调控PI3K/AKT通路介导的自噬途径减轻脂多糖诱导的人肺腺癌细胞A549凋亡. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(2): 118-125. doi: 10.7507/1671-6205.202109011 复制
急性肺损伤属危重症患者的肺部损伤，低氧、肺水肿、中性粒细胞在肺内积累导致肺实质性细胞死亡，肺实质性死亡是急性肺损伤的基础[1]。因此了解肺实质性死亡的发生机制可为治疗急性肺损伤提供有效支持。而细胞凋亡是一种细胞自杀过程，最终导致整个细胞死亡，细胞被分解和消化，这一过程中微RNA（miRNA）发挥重要作用[2]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肺泡上皮细胞中微RNA-27a（miR-27a）表达下调，miR-27a模拟物（mimic）可减少细胞凋亡，并下调B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）的表达，从而达到治疗疾病的目的[3]。细胞凋亡与细胞自噬关系密切，自噬是把双刃剑，既可以抑制细胞凋亡，又可以转化为凋亡，因此，了解自噬与凋亡之间的关系，可为更好的治疗疾病提供参考。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路参与细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等过程，亦是经典的自噬、炎症信号通路[4-5]，在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中PI3K/AKT通路处于激活状态，且与炎症、自噬、凋亡等关系密切[6]。人肺腺癌细胞A549细胞因其具有体外无限分裂、肺泡上皮细胞表征特点，被首选应用为体外肺损伤模型构建[7]。推测miR-27a可能通过PI3K/AKT通路影响LPS诱导的A549细胞凋亡。因此，本研究通过LPS诱导A549细胞建立急性肺损伤体外细胞模型，探讨miR-27a对细胞凋亡以及自噬的影响，为临床上治疗疾病提供一定依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
人肺腺癌细胞A549购自中国科学院细胞库，货号SCSP-503。
1.1.2 主要试剂与仪器
LPS（货号L8880）、PI3K激活剂740Y-P（货号M00988）购自北京索莱宝科技有限公司；LipofectamineTM2000试剂盒（货号C11058-3）、miR-27a模拟物（货号C10327-1）、miR-27a模拟物阴性对照（货号C10327-4）、磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基δ（phosphatidylinositol-3 kinase catalytic subunit delta，PIK3CD）野生型（PIK3CD WT。货号C1195）、PIK3CD突变型（PIK3CD MUT。货号C1198）购自广州锐博生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号11402ES60/80）、cDNA第一条链合成试剂盒（货号50193S）、荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（2×SYBR qPCR Mix。货号17216ES07）、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（annexin V - fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒（货号239ES65）、细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8。货号ES16674）购自上海翊圣生物科技有限公司；兔抗鼠PIK3CD（货号ab8805）、磷酸化AKT （phosphorylated-AKT，p-AKT。货号ab182733）、Bax（货号ab32124）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2。货号ab32042）、cleaved caspase-3（货号ab63817）、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3 II，LC3Ⅱ。货号ab15742）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH。货号ab10012）一抗、兔抗鼠二抗（货号ab10183）购自英国abcam公司。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）仪（型号7500）购自美国ABI公司；酶标仪（型号Multiskan Sky）购自美国赛默飞世尔公司；流式细胞仪（型号Rhapsody TM）购自美国BD公司；化学发光检测系统（型号GelDoc EZ）购自美国Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 双荧光素酶鉴定miR-27a与PIK3 CD的靶向位点
Starbase分析miR-27a与PIK3CD存在互补的结合位点；将miR-27a与PIK3CD结合位点及突变位点的序列克隆重组至pGL3-basic荧光素酶报告载体上构建PIK3CD WT及PIK3CD MUT荧光素酶报告载体，分别与miR-27a模拟物或miR-27a模拟物阴性对照共转染至A549细胞中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶相对活性[8]。
1.2.2 分组及细胞处理
DMEM培养液中添加10%胎牛血清制成完全培养液，A549细胞添加完全培养液，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每天观察细胞状态，隔天换液。实验分为正常组、LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组。取对数期细胞，LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组参考LipofectamineTM2000试剂盒说明书操作分别将miR-27a模拟物阴性对照、miR-27a模拟物、miR-27a模拟物转染至A549细胞，原培养液培养细胞6 h，更换为完全培养液培养细胞24 h，然后除正常组外，其余各组细胞添加10 mg/L LPS刺激24 h[9]，且LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组加入50 μg/mL PI3K激活剂740Y-P，正常组细胞用完全培养液正常培养相同时间[10]。
1.2.3 RT-qPCR检测细胞中miR-27a表达水平
6孔板培养处理细胞并收集，Trizol法提取总RNA，cDNA第一条链合成试剂盒合成cDNA，RT-qPCR检测细胞中miR-27a表达水平。所用引物由广州锐博生物科技有限公司合成。引物序列：miR-27a正向：5’-GCAGGGCTTAGCTGCTTG-3’，miR-27a反向：5’-GTGCAGGGCCGAGGT-3’；U6正向：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6反向：5’-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3’。cDNA稀释成50 ng/μL上样。20 μL反应体系：1 μL cDNA、10 μL 2×SYBR qPCR Mix、正/反向引物（均为10 μmol/L）各0.5 μL，8 μL ddH2O；反应条件：94℃、60 s；95℃、30 s，60℃、40 s，40个循环；72℃ 10 min。2-ΔΔCt法计算miR-27a相对表达水平。
1.2.4 CCK-8检测细胞增殖情况
处理好的细胞以1×104个/孔接种至6孔板中，每孔加100 μL完全培养液，待贴壁后培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃ 5% CO2培养箱内孵育2 h，酶标仪在450 nm处测定吸光度，细胞增殖率=（实验组吸光度/正常组吸光度）×100%。
1.2.5 Hoechst33342染色与流式细胞术检测细胞凋亡情况
6孔板培养处理细胞并收集，甲醛（4%）固定细胞，磷酸盐缓冲液洗涤并晾干后，加入Hoechst33342染色液，10 min后磷酸盐缓冲液洗涤，荧光显微镜下观察细胞形态；另取一定数量细胞，磷酸缓冲液清洗细胞3次后，加入195 μL Annexin V-FITC结合液、5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，然后加入10 μL PI染色液轻轻混匀。室温避光孵育20 min，随后置于冰浴中，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.6 透射电镜观察A549细胞自噬
6孔板培养处理细胞并收集，胰酶消化，离心弃上清，戊二醛固定、乙醇丙醇脱水，浸透、包埋、聚合，制备超薄切片（60 nm），醋酸铀与枸橼酸铅染色，电镜观察。
1.2.7 蛋白印迹法检测细胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平
6孔板培养处理细胞并收集，每孔板中添加100 μL蛋白裂解液，冰上裂解10 min，收集混合液至离心管中，12000 r/min 4 ℃离心20 min，收集上清即为细胞总蛋白。BCA试剂盒测定蛋白浓度，每个样品20 μg蛋白置凝胶电泳分离蛋白、蛋白转移至硝酸纤维素膜上、5%脱脂奶粉室温封闭硝酸纤维素膜2 h，加入PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ、GAPDH一抗（均是1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶3000稀释）室温孵育2 h，显色液显色、化学发光系统检测蛋白表达情况。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0统计软件。计量数据采用均数±标准差（
±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法。P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-27a与PIK3CD靶向关系验证
Starbase分析miR-27a与PIK3CD存在互补的结合位点，见图1。与miR-27a模拟物阴性对照+PIK3CD WT比较，miR-27a模拟物+PIK3CD WT荧光素酶相对活性下降（1.02±0.09比0.43±0.02，t=15.675，P<0.05）；miR-27a模拟物阴性对照+PIK3CD MUT与miR-27a模拟物+PIK3CD MUT荧光素酶相对活性差异无统计学意义（0.98±0.07比0.99±0.08，t=0.230，P>0.05）。
图1
miR-27a与PIK3 CD的靶位点验证
2.2 各组A549细胞中miR-27a表达水平
正常组、LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组miR-27a表达水平分别为（1.05±0.16）、（0.39±0.07）、（0.41±0.08）、（1.01±0.14）、（0.42±0.10）。与正常组相比，LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞中miR-27a表达水平降低（t=9.257、8.764、8.179，P<0.05）；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组A549细胞中miR-27a表达水平升高（t=9.703、9.115，P<0.05）；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞中miR-27a表达水平降低（t=8.400，P<0.05）。
2.3 各组A549细胞增殖情况
正常组、LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组细胞增殖率分别为（100.00±0.00）%、（27.53±4.11）%、（26.98±4.02）%、（77.41±9.08）%、（56.08±6.57）%。与正常组相比，LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞增殖率降低（t=43.191、44.493、6.094、16.375，P<0.05）；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞增殖率升高（t=12.259、9.024、12.440、9.254，P<0.05）；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞增殖率降低（t=4.662，P<0.05）。
2.4 各组A549细胞凋亡情况
正常组细胞数量较多，细胞间排列紧密，可见核大小均一；与正常组相比，LPS组和LPS+miR-27a模拟物阴性对照组可见细胞变圆，细胞核固缩，形成团块现象；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组核固缩细胞数降低；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组核固缩细胞数升高。见图2。
图2
各组A549细胞凋亡形态学检测（Hoechst33342染色×100）
a为正常组；b为LPS组；c为LPS+miR-27a模拟物阴性对照组；d为LPS+miR-27a模拟物组；d为LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组。正常组细胞数量较多，细胞间排列紧密，可见核大小均一；与正常组相比，LPS组和LPS+miR-27a模拟物阴性对照组可见细胞变圆，细胞核固缩，形成团块现象；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组核固缩细胞数降低；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组核固缩细胞数升高。白箭指示凋亡细胞。
正常组、LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组细胞凋亡率分别为（1.92±0.11）%、（21.52±5.17）%、（19.43±4.86）%、（6.28±1.92）%、（12.10±3.05）%。与正常组相比，LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞凋亡率升高（t=9.289、8.828、8.178，P<0.05）；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞凋亡率降低（t=6.769、3.844、6.164、3.129，P<0.05）；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞凋亡率升高（t=3.956，P<0.05）。见图3。
图3
各组A549细胞凋亡流式细胞检测像
a为正常组；b为LPS组；c为LPS+miR-27a模拟物阴性对照组；d为LPS+miR-27a模拟物组；e为LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组。与正常组相比，LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞凋亡率升高（
2.5 各组A549细胞自噬情况
正常组细胞器结构正常；LPS组和LPS+miR-27a模拟物阴性对照组显现多个大小不一的圆形自噬泡；LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组均可见少量圆形自噬泡，但数目不一。见图4。
图4
各组A549透射电镜检查自噬情况（醋酸铀与枸橼酸铅染色
25000）
a为正常组；b为LPS组；c为LPS+miR-27a模拟物阴性对照组；d为LPS+miR-27a模拟物组；e为LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组。正常组细胞器结构正常；LPS组和LPS+miR-27a模拟物阴性对照组显现多个大小不一的圆形自噬泡；LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组均可见少量圆形自噬泡，但数目不一。白箭指示自噬泡。
2.6 各组A549细胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平
与正常组相比，LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞中PIK3CD（t=3.973、3.989、10.932，P<0.05）、p-AKT（t=4.131、4.300、5.303，P<0.05）、Bax（t=6.507、6.553、4.516，P<0.05）、cleaved caspase-3（t=8.250、8.106、6.939，P<0.05）、LC3Ⅱ（t=9.092、9.405、7.012，P<0.05）蛋白表达水平升高，Bcl-2（t=8.093、9.193、2.401，P<0.05）蛋白表达水平降低，LPS+miR-27a模拟物组Bax（t=2.787，P<0.05）、cleaved caspase-3（t=3.787，P<0.05）、LC3Ⅱ（t=4.601，P<0.05）蛋白表达水平升高，Bcl-2（t=2.195，P<0.05）蛋白表达水平降低；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组A549细胞中PIK3CD（t=3.233、3.411，P<0.05）、p-AKT（t=3.342、3.560，P<0.05）、Bax（t=3.950、4.076，P<0.05）、cleaved caspase-3（t=4.566、4.600，P<0.05）、LC3Ⅱ（t=6.075、6.200，P<0.05）蛋白表达水平降低，Bcl-2（t=6.297、6.416，P<0.05）蛋白表达水平升高，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞中LC3Ⅱ（t=2.907、2.901，P<0.05）蛋白表达水平降低，Bcl-2（t=6.358、6.483，P<0.05）蛋白表达水平升高；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞中PIK3 CD（t=4.862，P<0.05）、p-AKT（t=4.879，P<0.05）、cleaved caspase-3（t=3.137，P<0.05）、LC3Ⅱ（t=3.387，P<0.05）蛋白表达水平升高。见图5、表1。
图5
各组A549细胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白印迹检测像
A为正常组；B为LPS组；C为LPS+miR-27a模拟物阴性对照组；D为LPS+miR-27a模拟物组；E为LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组。
表1
各组A549细胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平比较（
，n=6）
3 讨论
急性肺损伤是各种原因导致的急性、弥漫性肺损伤，发病率、病死率均较高，临床上颇为棘手，目前尚缺乏特效治疗药物[11]。LPS诱导的人A549细胞损伤与临床上急性肺损伤类似[12]。本研究采用LPS诱导A549细胞建立急性肺损伤体外细胞模型，探究miR-27a对LPS诱导的A549细胞增殖、凋亡、自噬以及PI3K/AKT通路相关蛋白的表达情况。
miRNA在多种肺部疾病中表达异常，在LPS诱导的急性肺损伤模型中微RNA-326（miR-326）表达下调，添加miR-326抑制剂后小鼠炎症、氧化应激指标升高，急性肺损伤加剧[13]。微RNA-486-5p（miR-486-5p）在急性肺损伤中表达升高，在小鼠模型中，注射miR-486-5p抑制剂后可显著降低LPS诱导的肺部炎症；在A549细胞中，敲低miR-486-5p可以降低LPS诱导的损伤及相应的炎症反应能力，进而保护细胞[14]。miR-33 s通过靶向p38丝裂原活化蛋白激酶负性调节LPS诱导的炎症反应[15]。miR-27a作为一种多功能miRNA，近年来已被报道调控细胞凋亡[16]，其不仅可以促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）的裂解，诱发caspase凋亡途径，还可抑制Bcl-2促进细胞凋亡[17-18]。在急性肺损伤miRNA芯片分析中发现miR-27a是显著下降的miRNA之一，高表达miR-27a可以改善肺损伤、减轻细胞凋亡从而改善小鼠[19]。鉴于miR-27a是参与凋亡途径中重要的一个环节，因此研究miR-27a在急性肺损伤中影响凋亡的机制，对于急性肺损伤的治疗意义重大。本研究发现，A549细胞中添加LPS后细胞中miR-27a表达水平降低，细胞凋亡率、细胞中促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表达水平升高，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低。提示LPS诱导A549细胞可降低miR-27a表达水平，细胞凋亡严重，推测miR-27a缺乏与LPS诱导的急性肺损伤存在某种联系，但具体机制尚待分析。而添加miR-27a模拟物后，细胞凋亡现象缓解、促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表达水平降低，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达水平升高。提示升高miR-27a表达水平可以缓解LPS诱导的细胞凋亡增加现象。
细胞死亡包括细胞凋亡、自噬细胞死亡和坏死，自噬主要降解溶酶体，被认为是重要的调节剂，是细胞死亡的执行者，LC3Ⅱ参与自噬调控，已被作为自噬标记物，其水平反映自噬体数量[20]。在急性肺损伤中抑制自噬过激可以有效改善LPS诱导的急性肺损伤[21]。PI3K由p110和p85构成，具有脂类激酶活性和蛋白激酶活性，可参与多种生物学信号过程，包括细胞骨架重组、细胞增殖、细胞自噬等，AKT作为PI3K/AKT通路的核心，可以通过对下游靶蛋白调控从而抑制凋亡[22-23]。但自噬、PI3K/AKT通路、凋亡三者之间的关系在不同疾病中存在差异。在脊髓损伤的自噬不足环境中激活自噬可以促进PI3K/AKT通路的表达从而阻止细胞凋亡[24]；在急性肺损伤中通过抑制PI3K/AKT通路的表达可以改善急性肺损伤诱导的炎症和病理症状[25]，但PI3K/AKT通路在急性肺损伤中与自噬、凋亡的关系目前尚不清楚。本研究发现在LPS诱导的A549细胞中PI3K/AKT通路处于激活状态，自噬小体形成增多，可以使自噬处于过度激活状态，自噬过激促进细胞凋亡，PI3K/AKT通路虽然可以起抗凋亡作用，但其效果有限，导致细胞总体凋亡率升高。添加miR-27a模拟物可以抑制PI3K/AKT通路抑制自噬水平，导致自噬促进的细胞凋亡减弱，最终实现对细胞的保护，而添加PI3K/AKT激活剂可以逆转上述过程，提示miR-27a可能通过调控PI3K/AKT通路发挥作用。
综上所述，miR-27a在LPS诱导的急性肺损伤细胞模型中低表达，高表达miR-27a可以靶向抑制PI3K/AKT通路，从而减轻LPS诱导的人肺腺癌细胞A549凋亡，而这一途径可能与自噬减少相关。但miR-27a调控机制复杂，亦可能通过其他途径影响细胞凋亡，尚需进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
急性肺损伤属危重症患者的肺部损伤，低氧、肺水肿、中性粒细胞在肺内积累导致肺实质性细胞死亡，肺实质性死亡是急性肺损伤的基础[1]。因此了解肺实质性死亡的发生机制可为治疗急性肺损伤提供有效支持。而细胞凋亡是一种细胞自杀过程，最终导致整个细胞死亡，细胞被分解和消化，这一过程中微RNA（miRNA）发挥重要作用[2]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肺泡上皮细胞中微RNA-27a（miR-27a）表达下调，miR-27a模拟物（mimic）可减少细胞凋亡，并下调B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）的表达，从而达到治疗疾病的目的[3]。细胞凋亡与细胞自噬关系密切，自噬是把双刃剑，既可以抑制细胞凋亡，又可以转化为凋亡，因此，了解自噬与凋亡之间的关系，可为更好的治疗疾病提供参考。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路参与细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等过程，亦是经典的自噬、炎症信号通路[4-5]，在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中PI3K/AKT通路处于激活状态，且与炎症、自噬、凋亡等关系密切[6]。人肺腺癌细胞A549细胞因其具有体外无限分裂、肺泡上皮细胞表征特点，被首选应用为体外肺损伤模型构建[7]。推测miR-27a可能通过PI3K/AKT通路影响LPS诱导的A549细胞凋亡。因此，本研究通过LPS诱导A549细胞建立急性肺损伤体外细胞模型，探讨miR-27a对细胞凋亡以及自噬的影响，为临床上治疗疾病提供一定依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
人肺腺癌细胞A549购自中国科学院细胞库，货号SCSP-503。
1.1.2 主要试剂与仪器
LPS（货号L8880）、PI3K激活剂740Y-P（货号M00988）购自北京索莱宝科技有限公司；LipofectamineTM2000试剂盒（货号C11058-3）、miR-27a模拟物（货号C10327-1）、miR-27a模拟物阴性对照（货号C10327-4）、磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基δ（phosphatidylinositol-3 kinase catalytic subunit delta，PIK3CD）野生型（PIK3CD WT。货号C1195）、PIK3CD突变型（PIK3CD MUT。货号C1198）购自广州锐博生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号11402ES60/80）、cDNA第一条链合成试剂盒（货号50193S）、荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（2×SYBR qPCR Mix。货号17216ES07）、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（annexin V - fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒（货号239ES65）、细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8。货号ES16674）购自上海翊圣生物科技有限公司；兔抗鼠PIK3CD（货号ab8805）、磷酸化AKT （phosphorylated-AKT，p-AKT。货号ab182733）、Bax（货号ab32124）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2。货号ab32042）、cleaved caspase-3（货号ab63817）、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3 II，LC3Ⅱ。货号ab15742）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH。货号ab10012）一抗、兔抗鼠二抗（货号ab10183）购自英国abcam公司。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）仪（型号7500）购自美国ABI公司；酶标仪（型号Multiskan Sky）购自美国赛默飞世尔公司；流式细胞仪（型号Rhapsody TM）购自美国BD公司；化学发光检测系统（型号GelDoc EZ）购自美国Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 双荧光素酶鉴定miR-27a与PIK3 CD的靶向位点
Starbase分析miR-27a与PIK3CD存在互补的结合位点；将miR-27a与PIK3CD结合位点及突变位点的序列克隆重组至pGL3-basic荧光素酶报告载体上构建PIK3CD WT及PIK3CD MUT荧光素酶报告载体，分别与miR-27a模拟物或miR-27a模拟物阴性对照共转染至A549细胞中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶相对活性[8]。
1.2.2 分组及细胞处理
DMEM培养液中添加10%胎牛血清制成完全培养液，A549细胞添加完全培养液，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每天观察细胞状态，隔天换液。实验分为正常组、LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组。取对数期细胞，LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组参考LipofectamineTM2000试剂盒说明书操作分别将miR-27a模拟物阴性对照、miR-27a模拟物、miR-27a模拟物转染至A549细胞，原培养液培养细胞6 h，更换为完全培养液培养细胞24 h，然后除正常组外，其余各组细胞添加10 mg/L LPS刺激24 h[9]，且LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组加入50 μg/mL PI3K激活剂740Y-P，正常组细胞用完全培养液正常培养相同时间[10]。
1.2.3 RT-qPCR检测细胞中miR-27a表达水平
6孔板培养处理细胞并收集，Trizol法提取总RNA，cDNA第一条链合成试剂盒合成cDNA，RT-qPCR检测细胞中miR-27a表达水平。所用引物由广州锐博生物科技有限公司合成。引物序列：miR-27a正向：5’-GCAGGGCTTAGCTGCTTG-3’，miR-27a反向：5’-GTGCAGGGCCGAGGT-3’；U6正向：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6反向：5’-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3’。cDNA稀释成50 ng/μL上样。20 μL反应体系：1 μL cDNA、10 μL 2×SYBR qPCR Mix、正/反向引物（均为10 μmol/L）各0.5 μL，8 μL ddH2O；反应条件：94℃、60 s；95℃、30 s，60℃、40 s，40个循环；72℃ 10 min。2-ΔΔCt法计算miR-27a相对表达水平。
1.2.4 CCK-8检测细胞增殖情况
处理好的细胞以1×104个/孔接种至6孔板中，每孔加100 μL完全培养液，待贴壁后培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃ 5% CO2培养箱内孵育2 h，酶标仪在450 nm处测定吸光度，细胞增殖率=（实验组吸光度/正常组吸光度）×100%。
1.2.5 Hoechst33342染色与流式细胞术检测细胞凋亡情况
6孔板培养处理细胞并收集，甲醛（4%）固定细胞，磷酸盐缓冲液洗涤并晾干后，加入Hoechst33342染色液，10 min后磷酸盐缓冲液洗涤，荧光显微镜下观察细胞形态；另取一定数量细胞，磷酸缓冲液清洗细胞3次后，加入195 μL Annexin V-FITC结合液、5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，然后加入10 μL PI染色液轻轻混匀。室温避光孵育20 min，随后置于冰浴中，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.6 透射电镜观察A549细胞自噬
6孔板培养处理细胞并收集，胰酶消化，离心弃上清，戊二醛固定、乙醇丙醇脱水，浸透、包埋、聚合，制备超薄切片（60 nm），醋酸铀与枸橼酸铅染色，电镜观察。
1.2.7 蛋白印迹法检测细胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平
6孔板培养处理细胞并收集，每孔板中添加100 μL蛋白裂解液，冰上裂解10 min，收集混合液至离心管中，12000 r/min 4 ℃离心20 min，收集上清即为细胞总蛋白。BCA试剂盒测定蛋白浓度，每个样品20 μg蛋白置凝胶电泳分离蛋白、蛋白转移至硝酸纤维素膜上、5%脱脂奶粉室温封闭硝酸纤维素膜2 h，加入PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ、GAPDH一抗（均是1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶3000稀释）室温孵育2 h，显色液显色、化学发光系统检测蛋白表达情况。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0统计软件。计量数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法。P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-27a与PIK3CD靶向关系验证
Starbase分析miR-27a与PIK3CD存在互补的结合位点，见图1。与miR-27a模拟物阴性对照+PIK3CD WT比较，miR-27a模拟物+PIK3CD WT荧光素酶相对活性下降（1.02±0.09比0.43±0.02，t=15.675，P<0.05）；miR-27a模拟物阴性对照+PIK3CD MUT与miR-27a模拟物+PIK3CD MUT荧光素酶相对活性差异无统计学意义（0.98±0.07比0.99±0.08，t=0.230，P>0.05）。
图1
miR-27a与PIK3 CD的靶位点验证
2.2 各组A549细胞中miR-27a表达水平
正常组、LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组miR-27a表达水平分别为（1.05±0.16）、（0.39±0.07）、（0.41±0.08）、（1.01±0.14）、（0.42±0.10）。与正常组相比，LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞中miR-27a表达水平降低（t=9.257、8.764、8.179，P<0.05）；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组A549细胞中miR-27a表达水平升高（t=9.703、9.115，P<0.05）；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞中miR-27a表达水平降低（t=8.400，P<0.05）。
2.3 各组A549细胞增殖情况
正常组、LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组细胞增殖率分别为（100.00±0.00）%、（27.53±4.11）%、（26.98±4.02）%、（77.41±9.08）%、（56.08±6.57）%。与正常组相比，LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞增殖率降低（t=43.191、44.493、6.094、16.375，P<0.05）；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞增殖率升高（t=12.259、9.024、12.440、9.254，P<0.05）；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞增殖率降低（t=4.662，P<0.05）。
2.4 各组A549细胞凋亡情况
正常组细胞数量较多，细胞间排列紧密，可见核大小均一；与正常组相比，LPS组和LPS+miR-27a模拟物阴性对照组可见细胞变圆，细胞核固缩，形成团块现象；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组核固缩细胞数降低；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组核固缩细胞数升高。见图2。
图2
各组A549细胞凋亡形态学检测（Hoechst33342染色×100）
a为正常组；b为LPS组；c为LPS+miR-27a模拟物阴性对照组；d为LPS+miR-27a模拟物组；d为LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组。正常组细胞数量较多，细胞间排列紧密，可见核大小均一；与正常组相比，LPS组和LPS+miR-27a模拟物阴性对照组可见细胞变圆，细胞核固缩，形成团块现象；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组核固缩细胞数降低；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组核固缩细胞数升高。白箭指示凋亡细胞。
正常组、LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组细胞凋亡率分别为（1.92±0.11）%、（21.52±5.17）%、（19.43±4.86）%、（6.28±1.92）%、（12.10±3.05）%。与正常组相比，LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞凋亡率升高（t=9.289、8.828、8.178，P<0.05）；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞凋亡率降低（t=6.769、3.844、6.164、3.129，P<0.05）；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞凋亡率升高（t=3.956，P<0.05）。见图3。
图3
各组A549细胞凋亡流式细胞检测像
a为正常组；b为LPS组；c为LPS+miR-27a模拟物阴性对照组；d为LPS+miR-27a模拟物组；e为LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组。与正常组相比，LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞凋亡率升高（
2.5 各组A549细胞自噬情况
正常组细胞器结构正常；LPS组和LPS+miR-27a模拟物阴性对照组显现多个大小不一的圆形自噬泡；LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组均可见少量圆形自噬泡，但数目不一。见图4。
图4
各组A549透射电镜检查自噬情况（醋酸铀与枸橼酸铅染色25000）
a为正常组；b为LPS组；c为LPS+miR-27a模拟物阴性对照组；d为LPS+miR-27a模拟物组；e为LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组。正常组细胞器结构正常；LPS组和LPS+miR-27a模拟物阴性对照组显现多个大小不一的圆形自噬泡；LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组均可见少量圆形自噬泡，但数目不一。白箭指示自噬泡。
2.6 各组A549细胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平
与正常组相比，LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞中PIK3CD（t=3.973、3.989、10.932，P<0.05）、p-AKT（t=4.131、4.300、5.303，P<0.05）、Bax（t=6.507、6.553、4.516，P<0.05）、cleaved caspase-3（t=8.250、8.106、6.939，P<0.05）、LC3Ⅱ（t=9.092、9.405、7.012，P<0.05）蛋白表达水平升高，Bcl-2（t=8.093、9.193、2.401，P<0.05）蛋白表达水平降低，LPS+miR-27a模拟物组Bax（t=2.787，P<0.05）、cleaved caspase-3（t=3.787，P<0.05）、LC3Ⅱ（t=4.601，P<0.05）蛋白表达水平升高，Bcl-2（t=2.195，P<0.05）蛋白表达水平降低；分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比，LPS+miR-27a模拟物组A549细胞中PIK3CD（t=3.233、3.411，P<0.05）、p-AKT（t=3.342、3.560，P<0.05）、Bax（t=3.950、4.076，P<0.05）、cleaved caspase-3（t=4.566、4.600，P<0.05）、LC3Ⅱ（t=6.075、6.200，P<0.05）蛋白表达水平降低，Bcl-2（t=6.297、6.416，P<0.05）蛋白表达水平升高，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞中LC3Ⅱ（t=2.907、2.901，P<0.05）蛋白表达水平降低，Bcl-2（t=6.358、6.483，P<0.05）蛋白表达水平升高；与LPS+miR-27a模拟物组相比，LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组A549细胞中PIK3 CD（t=4.862，P<0.05）、p-AKT（t=4.879，P<0.05）、cleaved caspase-3（t=3.137，P<0.05）、LC3Ⅱ（t=3.387，P<0.05）蛋白表达水平升高。见图5、表1。
图5
各组A549细胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白印迹检测像
A为正常组；B为LPS组；C为LPS+miR-27a模拟物阴性对照组；D为LPS+miR-27a模拟物组；E为LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组。
表1
各组A549细胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平比较（，n=6）
3 讨论
急性肺损伤是各种原因导致的急性、弥漫性肺损伤，发病率、病死率均较高，临床上颇为棘手，目前尚缺乏特效治疗药物[11]。LPS诱导的人A549细胞损伤与临床上急性肺损伤类似[12]。本研究采用LPS诱导A549细胞建立急性肺损伤体外细胞模型，探究miR-27a对LPS诱导的A549细胞增殖、凋亡、自噬以及PI3K/AKT通路相关蛋白的表达情况。
miRNA在多种肺部疾病中表达异常，在LPS诱导的急性肺损伤模型中微RNA-326（miR-326）表达下调，添加miR-326抑制剂后小鼠炎症、氧化应激指标升高，急性肺损伤加剧[13]。微RNA-486-5p（miR-486-5p）在急性肺损伤中表达升高，在小鼠模型中，注射miR-486-5p抑制剂后可显著降低LPS诱导的肺部炎症；在A549细胞中，敲低miR-486-5p可以降低LPS诱导的损伤及相应的炎症反应能力，进而保护细胞[14]。miR-33 s通过靶向p38丝裂原活化蛋白激酶负性调节LPS诱导的炎症反应[15]。miR-27a作为一种多功能miRNA，近年来已被报道调控细胞凋亡[16]，其不仅可以促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）的裂解，诱发caspase凋亡途径，还可抑制Bcl-2促进细胞凋亡[17-18]。在急性肺损伤miRNA芯片分析中发现miR-27a是显著下降的miRNA之一，高表达miR-27a可以改善肺损伤、减轻细胞凋亡从而改善小鼠[19]。鉴于miR-27a是参与凋亡途径中重要的一个环节，因此研究miR-27a在急性肺损伤中影响凋亡的机制，对于急性肺损伤的治疗意义重大。本研究发现，A549细胞中添加LPS后细胞中miR-27a表达水平降低，细胞凋亡率、细胞中促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表达水平升高，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低。提示LPS诱导A549细胞可降低miR-27a表达水平，细胞凋亡严重，推测miR-27a缺乏与LPS诱导的急性肺损伤存在某种联系，但具体机制尚待分析。而添加miR-27a模拟物后，细胞凋亡现象缓解、促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表达水平降低，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达水平升高。提示升高miR-27a表达水平可以缓解LPS诱导的细胞凋亡增加现象。
细胞死亡包括细胞凋亡、自噬细胞死亡和坏死，自噬主要降解溶酶体，被认为是重要的调节剂，是细胞死亡的执行者，LC3Ⅱ参与自噬调控，已被作为自噬标记物，其水平反映自噬体数量[20]。在急性肺损伤中抑制自噬过激可以有效改善LPS诱导的急性肺损伤[21]。PI3K由p110和p85构成，具有脂类激酶活性和蛋白激酶活性，可参与多种生物学信号过程，包括细胞骨架重组、细胞增殖、细胞自噬等，AKT作为PI3K/AKT通路的核心，可以通过对下游靶蛋白调控从而抑制凋亡[22-23]。但自噬、PI3K/AKT通路、凋亡三者之间的关系在不同疾病中存在差异。在脊髓损伤的自噬不足环境中激活自噬可以促进PI3K/AKT通路的表达从而阻止细胞凋亡[24]；在急性肺损伤中通过抑制PI3K/AKT通路的表达可以改善急性肺损伤诱导的炎症和病理症状[25]，但PI3K/AKT通路在急性肺损伤中与自噬、凋亡的关系目前尚不清楚。本研究发现在LPS诱导的A549细胞中PI3K/AKT通路处于激活状态，自噬小体形成增多，可以使自噬处于过度激活状态，自噬过激促进细胞凋亡，PI3K/AKT通路虽然可以起抗凋亡作用，但其效果有限，导致细胞总体凋亡率升高。添加miR-27a模拟物可以抑制PI3K/AKT通路抑制自噬水平，导致自噬促进的细胞凋亡减弱，最终实现对细胞的保护，而添加PI3K/AKT激活剂可以逆转上述过程，提示miR-27a可能通过调控PI3K/AKT通路发挥作用。
综上所述，miR-27a在LPS诱导的急性肺损伤细胞模型中低表达，高表达miR-27a可以靶向抑制PI3K/AKT通路，从而减轻LPS诱导的人肺腺癌细胞A549凋亡，而这一途径可能与自噬减少相关。但miR-27a调控机制复杂，亦可能通过其他途径影响细胞凋亡，尚需进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
