引用本文： 王小勇, 冯敏, 唐小军. 超抗原葡萄球菌肠毒素 B 对 Lewis 肺癌荷瘤小鼠抗肿瘤研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(3): 195-199. doi: 10.7507/1671-6205.202112015 复制
肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，目前治疗效果仍令人不甚满意[1-3]。免疫治疗是近年来进展最大，也最令人期待的肿瘤治疗方法。将免疫原性强的外源性抗原引入肿瘤宿主，刺激宿主产生强烈的免疫反应，达到抑制甚至消除肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的策略之一。葡萄球菌肠毒素 B（staphylococcus enterotoxin B，SEB）是来源于金黄色葡萄球菌的一种外源性肠毒素，具有超抗原的特性，具有强烈的激活免疫系统能力[4-5]。本研究合成了 SEB 基因的表达质粒，通过瘤内注射，观察其对 Lewis 肺癌细胞在小鼠体内生长的抑制作用，并以此初步探索 SEB 作为外源性抗原基因的肺癌免疫基因治疗的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
SEB 基因由 Invitrogen 公司合成，小鼠 Lewis 肺癌细胞来源于中科院细胞库；C57 小鼠（无特定病原级）来源于四川大学［SCXK（川）2013-026］并饲养于西南医科大学实验动物中心［许可证号SYXK（川）2018-065］，伦理批准文号：SWMU202110422；脂质体（lipofectamine2000）购自 Invitrogen 公司；酶联免疫吸附试验试剂盒购于康肽生物；SEB 抗体购于 Abcam 公司；Dulbecco 改良 Eagle 培养基及小牛血清购买于 Hyclone 公司。
1.2 方法
1.2.1 制备 SEB 基因表达质粒
（1）SEB 基因的合成及验证。查询 GeneBank 中 SEB 基因的 cDNA 序列，合成含 SEB的基因序列（由 Invitrogen 完成）。
（2）SEB 基因的扩增。设计扩增 SEB 基因的引物，上游引物：5'-AAGTATCTAGAGATGCCACCATGTACAACAGACTCTTCGTCAGCC-3'，5’端含酶切位点XbaI（TCTAGA）；下游引物：5'-GCCGAGGATCCTCACTTCTTCTTAGTTGTCAGGTATA-3’，5’端含酶切位点 BamHI（GGATCC），聚合酶链反应扩增获取 SEB 基因，产物大小 801 bp。
（3）构建SEB表达质粒 PCDH-SEB-GFP。SEB 的聚合酶链反应扩增产物和载体质粒PCDH-CMV-GFP 用 XbaI、BamHI 进行双酶切，然后作连接反应，转化 DH5α 感受态细菌，质粒提取，获取的重组质粒做酶切鉴定，重建成功的 SEB 表达质粒命名为 PCDH-SEB-GFP。
1.2.2 SEB 表达质粒 PCDH-SEB-GFP 转染 Lewis 细胞并采用蛋白免疫印迹法检测 SEB的表达
（1）将 PCDH-SEB-GFP 转染 Lewis 肺癌细胞。在 6 孔培养板接种 Lewis 肺癌细胞，每孔细胞数目为 1.5×106 个，放入孵箱中培养至细胞汇合度达到 90% 左右。在 PCDH-SEB-GFP组中，将质粒 PCDH-SEB-GFP 4 µg加入 250 µL 无血清培养基组成溶液 A，将 16 µL 的脂质体加入到 50 µL 无血清培养基组成溶液 B，室温放置 5 min 后，将溶液 A、B 混合室温放置 20 min，加入到 6 孔板培养的 Lewis 肺癌细胞中，混合均匀，开始转染实验。PCDH-CMV-GFP 组采用相似方法将质粒 PCDH-CMV-GFP 转染 Lewis 肺癌细胞。而 Lewis 肺癌细胞组为未被转染的正常生长的 Lewis 肺癌细胞。转染 24 h 后在荧光显微镜下观察转染效果。
（2）转染细胞蛋白提取。转染 Lewis 肺癌细胞 48 h 后，用 RIPA 裂解液提取细胞总蛋白。
（3）采用蛋白免疫印迹法检测转染细胞中 SEB 的表达。将步骤（2）获得的蛋白质，用蛋白免疫印迹法检测 SEB 的表达情况。过程简述如下：蛋白样品用 10% 的十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（浓缩胶电泳时电压 60 V，50 min，分离胶电泳时电压为 120 V，1 h），蛋白转于聚偏氟乙烯膜（转膜电压100 V，1 h）。5% 脱脂牛奶封闭 1 h，一抗孵育（SEB兔多克隆抗体，1∶500），4 ℃ 过夜，漂洗膜 5 次（5 min/次）后再进行二抗孵育（羊抗兔，1∶3000），室温孵育 2 h。经自动凝胶成像分析仪采集图像。
1.2.3 Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型构建
小鼠 18 只，雄性，4～6 周龄，体重 16～20 g。置于无特定病原体动物房中饲养，所需饲料、饮水经灭菌处理，采取自由进食及饮水，每天更换饮水、饲料及无菌垫料。取对数生长期的 Lewis 肺癌细胞，使用胰酶消化，检测细胞活性在 90% 以上，使用磷酸盐缓冲盐溶液调整细胞浓度为 1.5×107 个/mL。在小鼠右侧腋窝皮下接种 0.2 mL（3×106 个）细胞混悬液，当肿瘤体积达到约50 mm3 将小鼠随机分为实验组、阴性对照组和空白对照组，每组 6 只。
1.2.4 SEB 表达质粒 PCDH-SEB-GFP 治疗试验
将质粒与脂质体制备成转染混合液，其中，质粒 20 µg，脂质体 20 µL。实验组小鼠瘤内注射含质粒 PCDH-SEB-GFP 的混合液，阴性对照组瘤内注射等量的空载体质粒 PCDH-CMV-GFP 的混合液，空白对照组注射等体积磷酸盐缓冲盐溶液与脂质体制备的混合液，每 3 天注射1次，共进行 3 次注射，每 2 天计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，肿瘤体积=(A×B2）×0.5，其中，A 为肿瘤长径；B 为肿瘤短径。
1.2.5 不良反应观察
观察实验过程中小鼠有无呕吐、行动障碍、腹泻、死亡等。
1.2.6 病理检查
治疗试验开始后第 8 天处死荷瘤小鼠，解剖并完整取出瘤体，称量每只小鼠的瘤体质量。肿瘤组织用 4% 中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精–伊红染色，观察肿瘤组织坏死及炎症细胞浸润情况。免疫组织化学检测肿瘤组织中 SEB 的表达，SEB 抗体稀释液（1∶1000）50 µL，二抗（羊抗兔）稀释液（1∶2000）50 µL。
1.2.7 酶联免疫吸附试验检测各组小鼠血清炎症因子 γ 干扰素和肿瘤坏死因子-α 水平
治疗试验第 8 天剥除小鼠眼球采血，获得血清，4 ℃过夜后进行酶联免疫吸附试验，检测各组小鼠血清 γ 干扰素（interferon gamma，IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）水平。每孔加入 100 µL 待测溶液，孵育条件为 37 ℃、2 h，去除反应液后进行抗原洗脱和酶标抗体结合，孵育洗脱后，加入底物进行显色反应，计算光密度值。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 22 统计软件。结果采用均数±标准差（
±s）表示，组间比较采用方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组质粒 PCDH-SEB-GFP 鉴定结果
凝胶电泳实验结果显示，重组质粒 PCDH-SEB-GFP 经 XbaI、BamHI 双酶切，在697～925 bp 间（黑色箭头）有 DNA 条带，该 DNA 条带大小与目的基因大小相符（图 1）。
图1
PCDH-SEB-GFP 质粒 XbaI、BamHI 双酶切鉴定结果
1：DNA Marker；2：未做酶切；3：单酶切；4：双酶切。黑箭指示条带的大小与目的基因大小相符。
2.2 荧光显微镜观察转染效果
转染实验后在 PCDH-SEB-GFP 组和 PCDH-CMV-GFP 组中均能观察到绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达（图 2）。
图2
转染实验荧光检测像（×100）
a. PCDH-SEB-GFP 组；b. PCDH-CMV-GFP 组。转染实验后在 PCDH-SEB-GFP 组和 PCDH-CMV-GFP 组中均能观察到GFP表达。
2.3 蛋白免疫印迹法检测结果
蛋白免疫印迹法检测结果显示，在 PCDH-SEB-GFP 组中用含有 SEB 基因的重组质粒PCDH-SEB-GFP 转染 Lewis 肺癌细胞后能检测到 SEB 蛋白表达，SEB 蛋白大小约 30 kD。而 Lewis 肺癌细胞组和 PCDH-CMV-GFP 组未检测到 SEB 蛋白表达（图 3）。
图3
蛋白免疫印迹法检测像
1. PCDH-CMV-GFP 组；2. Lewis 肺癌细胞组；3. PCDH-SEB-GFP 组。内参为 β 肌动蛋白，其大小为 43 kD。
2.4 肿瘤抑制实验结果
肿瘤抑制实验开始后，实验组、阴性对照组、空白对照组肿瘤体积呈逐渐增长趋势，实验组肿瘤体积增长最缓慢，空白对照组增长最迅速（图 4）。处死小鼠后获取肿瘤组织，三组平均瘤重分别为（1.02±0.47）、（2.24±0.87）、（3.32±1.04）g，各组间有显著差异（P=0.001）；两两比较：实验组平均瘤重低于空白对照组（P=0.000）及阴性对照组（P=0.022）；阴性对照组平均瘤重低于空白对照组（P=0.040）（图 5）。
图4
各组小鼠肿瘤生长曲线
图5
获取的各组小鼠肿瘤组织大体像
a. 实验组；b. 阴性对照组；c. 空白对照组。
2.5 移植瘤病理检查
实验组小鼠肿瘤见明显出血、坏死，伴有炎症细胞浸润；阴性对照组程度明显减轻；而空白对照组无上述改变（图 6）。免疫组织化学检测结果显示，实验组肿瘤组织中有 SEB 蛋白表达，而其余两组无 SEB 蛋白表达（图 7）。
图6
各组小鼠肿瘤病理检查（苏木精–伊红×100）
a. 实验组；b. 阴性对照组；c. 空白对照组。实验组小鼠移植瘤见明显出血、坏死，伴有炎症细胞浸润；阴性对照组上述程度明显减轻；而空白对照组无上述改变。
图7
各组小鼠移植瘤病理检查像（免疫组织化学×400）
a. 实验组；b. 阴性对照组；c. 空白对照组。实验组小鼠移植瘤组织中有 SEB 蛋白表达，而其余两组无 SEB 蛋白表达。
2.6 各组小鼠血清 TNF-α 和 IFN-γ 检测
实验组、阴性对照组、空白对照组血清 TNF-α 平均浓度分别为（157.0±97.1）、（141.7±69.3）、（92.6±43.2）pg/mL，差异无统计学意义（P=0.310）；血清 IFN-γ 平均浓度分别为（207.5±71.2）、（206.8±21.3）、（191.5±52.1）pg/mL，差异无统计学意义（P=0.838）。
3 讨论
引入外源抗原基因使其在肿瘤中表达，刺激宿主产生强烈的免疫应答，以获得抗肿瘤作用，是肿瘤免疫治疗的策略之一[6]。超抗原为细菌、病毒产生的一类外分泌抗原物质[5]，微量剂量就能强烈刺激免疫细胞增殖，增强免疫能力。报道显示超抗原能使体内多达 40% 的 T 淋巴细胞激活，大幅超过普通抗原的激活能力[7]。SEB 为金黄色葡萄球菌外分泌蛋白之一，具有超抗原属性，通过直接呈递抗原的形式与主要组织相容性复合体 Ⅱ 类分子和 T 淋巴细胞受体的特定 Vβ 区结合，进而导致 T 淋巴细胞的激活，产生免疫效应分子（如白细胞介素-2、TNF-α 和 IFN-γ）杀灭肿瘤细胞，同时也可以激活 T 淋巴细胞直接杀灭肿瘤细胞[8-10]。SEB 在抗肿瘤领域具有重要研究价值，研究中发现 SEB 对伴有恶性胸腔积液的晚期肺癌、卵巢癌具有抗肿瘤作用[11-12]。Ejtehadifar 等[13]发现 SEB 具有的超抗原特性能抑制多发性骨髓瘤肿瘤细胞的增殖和存活，具有抗肿瘤生长作用。本实验发现实验组中肿瘤体积及质量明显小于其余两组，说明 SEB 能起到抑制小鼠 Lewis 肺癌生长的作用。
在将 SEB 基因转导入实验动物体内的途径有瘤体注射、体腔注射、静脉注射等，本研究采用了瘤内注射的方法，主要是考虑到含有 SEB 基因的质粒为非肿瘤靶向性载体，如果采用静脉或体腔注射，可能因药物缺乏选择性，出现抗肿瘤效果不佳，而加大剂量则可能导致严重的全身不良反应[14]。通过瘤内注射的方式可以使 SEB 表达及其诱导的免疫应答尽量局限于肿瘤局部，避免正常组织产生严重炎症反应。SEB 基因作为原核生物基因可以在原核表达体系中表达，能否在真核细胞中表达是该实验的关键所在[15]。朱大冕等[16]研究发现，构建含有超抗原SEA基因的真核表达载体，并将其转染人肺腺癌后可以检测到 SEA 蛋白的表达。我们的研究也进一步证实，在实验组小鼠瘤体内注射含有 SEB 基因的质粒，通过免疫组织化学方式可在小鼠肿瘤组织中检测到 SEB 的表达，说明该干预措施是可行和有效的，且实验组中有 SEB 表达，而其他两组无 SEB 表达。
本研究还发现，阴性对照组肿瘤体积及质量低于空白对照组，其可能的原因是阴性对照组小鼠瘤体内注射的质粒虽不含 SEB 基因，该载体含有 GFP 基因，相对小鼠而言，GFP 也是一种作为外源性蛋白，也具有一定的免疫原性，可以在肿瘤局部激活小鼠的免疫反应，从而产生抑瘤作用。实验组肿瘤体积及质量小于阴性对照组可能是 SEB 和 GFP 相结合而呈现出更明显的抑制肿瘤的作用。既往研究发现 GFP 可以通过主要组织相容性复合体介导的细胞毒性 T 细胞途径发挥免疫作用，已证实其可刺激免疫反应产生 IFN-γ 等达到抗肿瘤作用[17-18]。该观点与本文结论相符合。
通过瘤内注射的方式下，三组小鼠均未出现严重不良反应甚至死亡，尤其是实验组小鼠未出现严重不良反应，说明 SEB 虽具有强烈的刺激免疫能力，但瘤内注射是比较安全的干预途径。三组小鼠血清中细胞因子 IFN-γ、TNF-α 浓度没有明显的差异，分析原因可能是，通过瘤内注射的方式，免疫反应多局限于瘤体周围，全身免疫反应较轻，因此产生的细胞因子浓度较低。Fooladi 等[19]的研究也证实了瘤体注射局部产生的 IFN-γ 和 T 淋巴细胞浸润少于静脉注射。本实验也存在一定局限性，SEB 转染肿瘤细胞是非特异性的，如果能通过靶向性方式使肿瘤细胞特异性表达 SEB，抗肿瘤反应可局限在肿瘤周围，即起到抗肿瘤的目的，也尽量避免全身不良反应，为后续靶向性肿瘤免疫治疗提供依据。
综上，本研究发现在 Lewis 肺癌细胞荷瘤小鼠瘤体内注射 SEB 基因表达质粒可以使SEB 在肿瘤组织中表达，并能抑制 Lewis 肺癌荷瘤小鼠体内肿瘤生长，且没有明显的全身毒副作用。本研究结果为以 SEB 为外源性抗原基因的肺癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了一定基础。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，目前治疗效果仍令人不甚满意[1-3]。免疫治疗是近年来进展最大，也最令人期待的肿瘤治疗方法。将免疫原性强的外源性抗原引入肿瘤宿主，刺激宿主产生强烈的免疫反应，达到抑制甚至消除肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的策略之一。葡萄球菌肠毒素 B（staphylococcus enterotoxin B，SEB）是来源于金黄色葡萄球菌的一种外源性肠毒素，具有超抗原的特性，具有强烈的激活免疫系统能力[4-5]。本研究合成了 SEB 基因的表达质粒，通过瘤内注射，观察其对 Lewis 肺癌细胞在小鼠体内生长的抑制作用，并以此初步探索 SEB 作为外源性抗原基因的肺癌免疫基因治疗的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
SEB 基因由 Invitrogen 公司合成，小鼠 Lewis 肺癌细胞来源于中科院细胞库；C57 小鼠（无特定病原级）来源于四川大学［SCXK（川）2013-026］并饲养于西南医科大学实验动物中心［许可证号SYXK（川）2018-065］，伦理批准文号：SWMU202110422；脂质体（lipofectamine2000）购自 Invitrogen 公司；酶联免疫吸附试验试剂盒购于康肽生物；SEB 抗体购于 Abcam 公司；Dulbecco 改良 Eagle 培养基及小牛血清购买于 Hyclone 公司。
1.2 方法
1.2.1 制备 SEB 基因表达质粒
（1）SEB 基因的合成及验证。查询 GeneBank 中 SEB 基因的 cDNA 序列，合成含 SEB的基因序列（由 Invitrogen 完成）。
（2）SEB 基因的扩增。设计扩增 SEB 基因的引物，上游引物：5'-AAGTATCTAGAGATGCCACCATGTACAACAGACTCTTCGTCAGCC-3'，5’端含酶切位点XbaI（TCTAGA）；下游引物：5'-GCCGAGGATCCTCACTTCTTCTTAGTTGTCAGGTATA-3’，5’端含酶切位点 BamHI（GGATCC），聚合酶链反应扩增获取 SEB 基因，产物大小 801 bp。
（3）构建SEB表达质粒 PCDH-SEB-GFP。SEB 的聚合酶链反应扩增产物和载体质粒PCDH-CMV-GFP 用 XbaI、BamHI 进行双酶切，然后作连接反应，转化 DH5α 感受态细菌，质粒提取，获取的重组质粒做酶切鉴定，重建成功的 SEB 表达质粒命名为 PCDH-SEB-GFP。
1.2.2 SEB 表达质粒 PCDH-SEB-GFP 转染 Lewis 细胞并采用蛋白免疫印迹法检测 SEB的表达
（1）将 PCDH-SEB-GFP 转染 Lewis 肺癌细胞。在 6 孔培养板接种 Lewis 肺癌细胞，每孔细胞数目为 1.5×106 个，放入孵箱中培养至细胞汇合度达到 90% 左右。在 PCDH-SEB-GFP组中，将质粒 PCDH-SEB-GFP 4 µg加入 250 µL 无血清培养基组成溶液 A，将 16 µL 的脂质体加入到 50 µL 无血清培养基组成溶液 B，室温放置 5 min 后，将溶液 A、B 混合室温放置 20 min，加入到 6 孔板培养的 Lewis 肺癌细胞中，混合均匀，开始转染实验。PCDH-CMV-GFP 组采用相似方法将质粒 PCDH-CMV-GFP 转染 Lewis 肺癌细胞。而 Lewis 肺癌细胞组为未被转染的正常生长的 Lewis 肺癌细胞。转染 24 h 后在荧光显微镜下观察转染效果。
（2）转染细胞蛋白提取。转染 Lewis 肺癌细胞 48 h 后，用 RIPA 裂解液提取细胞总蛋白。
（3）采用蛋白免疫印迹法检测转染细胞中 SEB 的表达。将步骤（2）获得的蛋白质，用蛋白免疫印迹法检测 SEB 的表达情况。过程简述如下：蛋白样品用 10% 的十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（浓缩胶电泳时电压 60 V，50 min，分离胶电泳时电压为 120 V，1 h），蛋白转于聚偏氟乙烯膜（转膜电压100 V，1 h）。5% 脱脂牛奶封闭 1 h，一抗孵育（SEB兔多克隆抗体，1∶500），4 ℃ 过夜，漂洗膜 5 次（5 min/次）后再进行二抗孵育（羊抗兔，1∶3000），室温孵育 2 h。经自动凝胶成像分析仪采集图像。
1.2.3 Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型构建
小鼠 18 只，雄性，4～6 周龄，体重 16～20 g。置于无特定病原体动物房中饲养，所需饲料、饮水经灭菌处理，采取自由进食及饮水，每天更换饮水、饲料及无菌垫料。取对数生长期的 Lewis 肺癌细胞，使用胰酶消化，检测细胞活性在 90% 以上，使用磷酸盐缓冲盐溶液调整细胞浓度为 1.5×107 个/mL。在小鼠右侧腋窝皮下接种 0.2 mL（3×106 个）细胞混悬液，当肿瘤体积达到约50 mm3 将小鼠随机分为实验组、阴性对照组和空白对照组，每组 6 只。
1.2.4 SEB 表达质粒 PCDH-SEB-GFP 治疗试验
将质粒与脂质体制备成转染混合液，其中，质粒 20 µg，脂质体 20 µL。实验组小鼠瘤内注射含质粒 PCDH-SEB-GFP 的混合液，阴性对照组瘤内注射等量的空载体质粒 PCDH-CMV-GFP 的混合液，空白对照组注射等体积磷酸盐缓冲盐溶液与脂质体制备的混合液，每 3 天注射1次，共进行 3 次注射，每 2 天计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，肿瘤体积=(A×B2）×0.5，其中，A 为肿瘤长径；B 为肿瘤短径。
1.2.5 不良反应观察
观察实验过程中小鼠有无呕吐、行动障碍、腹泻、死亡等。
1.2.6 病理检查
治疗试验开始后第 8 天处死荷瘤小鼠，解剖并完整取出瘤体，称量每只小鼠的瘤体质量。肿瘤组织用 4% 中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精–伊红染色，观察肿瘤组织坏死及炎症细胞浸润情况。免疫组织化学检测肿瘤组织中 SEB 的表达，SEB 抗体稀释液（1∶1000）50 µL，二抗（羊抗兔）稀释液（1∶2000）50 µL。
1.2.7 酶联免疫吸附试验检测各组小鼠血清炎症因子 γ 干扰素和肿瘤坏死因子-α 水平
治疗试验第 8 天剥除小鼠眼球采血，获得血清，4 ℃过夜后进行酶联免疫吸附试验，检测各组小鼠血清 γ 干扰素（interferon gamma，IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）水平。每孔加入 100 µL 待测溶液，孵育条件为 37 ℃、2 h，去除反应液后进行抗原洗脱和酶标抗体结合，孵育洗脱后，加入底物进行显色反应，计算光密度值。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 22 统计软件。结果采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组质粒 PCDH-SEB-GFP 鉴定结果
凝胶电泳实验结果显示，重组质粒 PCDH-SEB-GFP 经 XbaI、BamHI 双酶切，在697～925 bp 间（黑色箭头）有 DNA 条带，该 DNA 条带大小与目的基因大小相符（图 1）。
图1
PCDH-SEB-GFP 质粒 XbaI、BamHI 双酶切鉴定结果
1：DNA Marker；2：未做酶切；3：单酶切；4：双酶切。黑箭指示条带的大小与目的基因大小相符。
2.2 荧光显微镜观察转染效果
转染实验后在 PCDH-SEB-GFP 组和 PCDH-CMV-GFP 组中均能观察到绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达（图 2）。
图2
转染实验荧光检测像（×100）
a. PCDH-SEB-GFP 组；b. PCDH-CMV-GFP 组。转染实验后在 PCDH-SEB-GFP 组和 PCDH-CMV-GFP 组中均能观察到GFP表达。
2.3 蛋白免疫印迹法检测结果
蛋白免疫印迹法检测结果显示，在 PCDH-SEB-GFP 组中用含有 SEB 基因的重组质粒PCDH-SEB-GFP 转染 Lewis 肺癌细胞后能检测到 SEB 蛋白表达，SEB 蛋白大小约 30 kD。而 Lewis 肺癌细胞组和 PCDH-CMV-GFP 组未检测到 SEB 蛋白表达（图 3）。
图3
蛋白免疫印迹法检测像
1. PCDH-CMV-GFP 组；2. Lewis 肺癌细胞组；3. PCDH-SEB-GFP 组。内参为 β 肌动蛋白，其大小为 43 kD。
2.4 肿瘤抑制实验结果
肿瘤抑制实验开始后，实验组、阴性对照组、空白对照组肿瘤体积呈逐渐增长趋势，实验组肿瘤体积增长最缓慢，空白对照组增长最迅速（图 4）。处死小鼠后获取肿瘤组织，三组平均瘤重分别为（1.02±0.47）、（2.24±0.87）、（3.32±1.04）g，各组间有显著差异（P=0.001）；两两比较：实验组平均瘤重低于空白对照组（P=0.000）及阴性对照组（P=0.022）；阴性对照组平均瘤重低于空白对照组（P=0.040）（图 5）。
图4
各组小鼠肿瘤生长曲线
图5
获取的各组小鼠肿瘤组织大体像
a. 实验组；b. 阴性对照组；c. 空白对照组。
2.5 移植瘤病理检查
实验组小鼠肿瘤见明显出血、坏死，伴有炎症细胞浸润；阴性对照组程度明显减轻；而空白对照组无上述改变（图 6）。免疫组织化学检测结果显示，实验组肿瘤组织中有 SEB 蛋白表达，而其余两组无 SEB 蛋白表达（图 7）。
图6
各组小鼠肿瘤病理检查（苏木精–伊红×100）
a. 实验组；b. 阴性对照组；c. 空白对照组。实验组小鼠移植瘤见明显出血、坏死，伴有炎症细胞浸润；阴性对照组上述程度明显减轻；而空白对照组无上述改变。
图7
各组小鼠移植瘤病理检查像（免疫组织化学×400）
a. 实验组；b. 阴性对照组；c. 空白对照组。实验组小鼠移植瘤组织中有 SEB 蛋白表达，而其余两组无 SEB 蛋白表达。
2.6 各组小鼠血清 TNF-α 和 IFN-γ 检测
实验组、阴性对照组、空白对照组血清 TNF-α 平均浓度分别为（157.0±97.1）、（141.7±69.3）、（92.6±43.2）pg/mL，差异无统计学意义（P=0.310）；血清 IFN-γ 平均浓度分别为（207.5±71.2）、（206.8±21.3）、（191.5±52.1）pg/mL，差异无统计学意义（P=0.838）。
3 讨论
引入外源抗原基因使其在肿瘤中表达，刺激宿主产生强烈的免疫应答，以获得抗肿瘤作用，是肿瘤免疫治疗的策略之一[6]。超抗原为细菌、病毒产生的一类外分泌抗原物质[5]，微量剂量就能强烈刺激免疫细胞增殖，增强免疫能力。报道显示超抗原能使体内多达 40% 的 T 淋巴细胞激活，大幅超过普通抗原的激活能力[7]。SEB 为金黄色葡萄球菌外分泌蛋白之一，具有超抗原属性，通过直接呈递抗原的形式与主要组织相容性复合体 Ⅱ 类分子和 T 淋巴细胞受体的特定 Vβ 区结合，进而导致 T 淋巴细胞的激活，产生免疫效应分子（如白细胞介素-2、TNF-α 和 IFN-γ）杀灭肿瘤细胞，同时也可以激活 T 淋巴细胞直接杀灭肿瘤细胞[8-10]。SEB 在抗肿瘤领域具有重要研究价值，研究中发现 SEB 对伴有恶性胸腔积液的晚期肺癌、卵巢癌具有抗肿瘤作用[11-12]。Ejtehadifar 等[13]发现 SEB 具有的超抗原特性能抑制多发性骨髓瘤肿瘤细胞的增殖和存活，具有抗肿瘤生长作用。本实验发现实验组中肿瘤体积及质量明显小于其余两组，说明 SEB 能起到抑制小鼠 Lewis 肺癌生长的作用。
在将 SEB 基因转导入实验动物体内的途径有瘤体注射、体腔注射、静脉注射等，本研究采用了瘤内注射的方法，主要是考虑到含有 SEB 基因的质粒为非肿瘤靶向性载体，如果采用静脉或体腔注射，可能因药物缺乏选择性，出现抗肿瘤效果不佳，而加大剂量则可能导致严重的全身不良反应[14]。通过瘤内注射的方式可以使 SEB 表达及其诱导的免疫应答尽量局限于肿瘤局部，避免正常组织产生严重炎症反应。SEB 基因作为原核生物基因可以在原核表达体系中表达，能否在真核细胞中表达是该实验的关键所在[15]。朱大冕等[16]研究发现，构建含有超抗原SEA基因的真核表达载体，并将其转染人肺腺癌后可以检测到 SEA 蛋白的表达。我们的研究也进一步证实，在实验组小鼠瘤体内注射含有 SEB 基因的质粒，通过免疫组织化学方式可在小鼠肿瘤组织中检测到 SEB 的表达，说明该干预措施是可行和有效的，且实验组中有 SEB 表达，而其他两组无 SEB 表达。
本研究还发现，阴性对照组肿瘤体积及质量低于空白对照组，其可能的原因是阴性对照组小鼠瘤体内注射的质粒虽不含 SEB 基因，该载体含有 GFP 基因，相对小鼠而言，GFP 也是一种作为外源性蛋白，也具有一定的免疫原性，可以在肿瘤局部激活小鼠的免疫反应，从而产生抑瘤作用。实验组肿瘤体积及质量小于阴性对照组可能是 SEB 和 GFP 相结合而呈现出更明显的抑制肿瘤的作用。既往研究发现 GFP 可以通过主要组织相容性复合体介导的细胞毒性 T 细胞途径发挥免疫作用，已证实其可刺激免疫反应产生 IFN-γ 等达到抗肿瘤作用[17-18]。该观点与本文结论相符合。
通过瘤内注射的方式下，三组小鼠均未出现严重不良反应甚至死亡，尤其是实验组小鼠未出现严重不良反应，说明 SEB 虽具有强烈的刺激免疫能力，但瘤内注射是比较安全的干预途径。三组小鼠血清中细胞因子 IFN-γ、TNF-α 浓度没有明显的差异，分析原因可能是，通过瘤内注射的方式，免疫反应多局限于瘤体周围，全身免疫反应较轻，因此产生的细胞因子浓度较低。Fooladi 等[19]的研究也证实了瘤体注射局部产生的 IFN-γ 和 T 淋巴细胞浸润少于静脉注射。本实验也存在一定局限性，SEB 转染肿瘤细胞是非特异性的，如果能通过靶向性方式使肿瘤细胞特异性表达 SEB，抗肿瘤反应可局限在肿瘤周围，即起到抗肿瘤的目的，也尽量避免全身不良反应，为后续靶向性肿瘤免疫治疗提供依据。
综上，本研究发现在 Lewis 肺癌细胞荷瘤小鼠瘤体内注射 SEB 基因表达质粒可以使SEB 在肿瘤组织中表达，并能抑制 Lewis 肺癌荷瘤小鼠体内肿瘤生长，且没有明显的全身毒副作用。本研究结果为以 SEB 为外源性抗原基因的肺癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了一定基础。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
