引用本文： 吴吉荣, 何真, 曾晓丽, 包海荣, 刘晓菊. 细颗粒物对哮喘小鼠气道重塑及 Notch 信号通路的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(4): 274-281. doi: 10.7507/1671-6205.202202004 复制
支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见的慢性异质性气道疾病。气道炎症是哮喘发生发展的关键因素，长期反复炎症刺激可引起气道重塑，是哮喘重要的病理特征[1]。研究发现细颗粒物（particulate matter 2.5，PM2.5）浓度升高和哮喘患者门诊就诊及住院率增加密切相关[2-3]。PM2.5 可影响哮喘气道炎症和气道重塑[4-5]，但确切机制不清。Notch 信号通路是一条高度保守的信号转导途径，在调节细胞炎症、免疫失衡及上皮下纤维化等方面发挥重要作用[6]。Notch 信号调节的缺失，特别是 Notch1 的缺失，最近被认为与一些重要的肺部疾病的发病有关，特别是慢阻肺、哮喘、肺纤维化等[7]。研究发现转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和 Ⅰ 型胶原蛋白（type Ⅰ collagen，Col-Ⅰ）是早期气道重塑的重要标志[8-9]。PM2.5 对哮喘气道重塑的影响，其机制是否与Notch 信号通路有关尚不清楚。本研究以哮喘小鼠为研究对象，观察 PM2.5 对哮喘小鼠气道重塑及 TGF-β1、α-SMA和 Col-Ⅰ 表达的影响，并进一步探讨 PM2.5 对哮喘小鼠肺组织 Notch1 受体及其下游 Hes1 表达的影响，旨在初步明确 PM2.5 影响哮喘气道重塑的分子机制，为预防和治疗哮喘气道重塑奠定理论基础。
1 材料和方法
1.1 实验动物和主要材料
40 只 8 周龄无特定病原级雌性 BALB/c 小鼠，体重（20±2）g，购自兰州大学医学院实验动物中心［批号：SCXK（甘）2018-0002］。主要材料：鸡卵清蛋白（ovalbumin，OVA，美国 Sigma 公司）、10% 氢氧化铝佐剂（天津市恒兴化学试剂制造有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量检测试剂盒和羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）试剂盒（北京索莱宝生物公司），兔抗鼠 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 多克隆抗体（美国 Immunoway 公司）。2050 型空气智能总悬浮颗粒物综合采样器（青岛崂山应用技术研究所），雾化器（PARI BOY N型，德国百瑞公司），图像采集系统（日本尼康株式会社），Image Pro Plus 6.0 图像分析软件（美国 Media Cybernetics 公司），EMMS 动物肺功能测量系统（英国 EMMS 公司），BIO-RAD ChemiDocTM XRS 凝胶成像系统（美国 Bio-Rad 公司）。
1.2 方法
1.2.1 分组
40 只小鼠采用随机数字表法分为健康对照组、健康 PM2.5 组、哮喘组、哮喘 PM2.5 组，共 4 组，每组各 10 只。
1.2.2 PM2.5 的采集与制备
沿用 Chu 等[10]的 PM2.5 采集和制备方法，采集兰州市天水南路交通主干线旁 PM2.5。采样完毕后，将含有 PM2.5 的玻璃纤维滤膜剪成 1 cm ×1 cm 的小方块浸于双蒸水中，超声波震荡器（28 ℃、40 Hz、500 W）洗脱，再洗脱 1 次。将两次所得洗脱液混合，用 6 层纱布过滤，所得滤液即为 PM2.5 的混悬液。低温（–4 ℃）离心 12000 r/min，20 min，将下层 PM2.5 悬液冷冻干燥 48 h，即为 PM2.5，PM2.5 置于 4 ℃ 冰箱保存，实验时配置成所需浓度的混悬液，现配现用。
1.2.3 哮喘模型建立及 PM2.5 干预
参照雷泽林等[11]、Temelkovski 等[12]建模方法，采用 OVA 致敏和激发建立哮喘小鼠模型。哮喘组及哮喘 PM2.5 组分别于第 1、7、14 天腹腔注射致敏液（45 mL 磷酸盐缓冲液+ 5 mL 10% 氢氧化铝+5 mg OVA）200 μL致敏，第 21～28 天于自制雾化箱（20 cm×15 cm×10 cm）内以 2.5% OVA 雾化激发 30 min，每日 1 次。第 29～70 天，隔日 1 次上述雾化激发，每次雾化激发见小鼠出现呼吸急促、烦躁不安、腹肌痉挛等表现时判断为阳性反应；健康对照组及健康 PM2.5 组在致敏和雾化激发阶段给予等剂量生理盐水。参照 Chu 等[10]、Gu 等[13]的方法并加以改良，健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组将小鼠置于 20 cm×15 cm×10 cm 的玻璃熏箱内，于每次激发后给予雾化吸入 PM2.5（510 μg/m3）气溶胶，暴露 4次/d，15 min/次，间隔 0.5 h；健康对照组及哮喘组给予同等体积的生理盐水雾化吸入。
1.2.4 肺功能测定
末次激发及 PM2.5 干预 24 h 后，参照蓝凰齐等[14]方法，给予小鼠 1% 戊巴比妥钠（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，分离组织，暴露气管，插入插管连接 EMMS 动物肺功能测量系统测定第 0.1 秒用力呼气容积（forced expiratory volume in 0.1 second，FEV0. 1）、第 0.2 秒用力呼气末容积（FEV0. 2）、呼气峰流速（peak expiratory flow，PEF）、呼出 50% 潮气量时的流速（EF50）和增强呼吸间歇（enhanced pause，Penh）。
1.2.5 标本收集及保存
肺功能检测结束后，脱颈椎处死各组小鼠，置于冰台上，结扎右总支气管，于气管远端切下右肺，用 4% 的多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片；取左肺组织，迅速置于液氮中，然后保存于–80 ℃ 冰箱中行蛋白免疫印迹法检测。
1.2.6 肺组织病理学切片苏木精–伊红染色
取包埋石蜡块，常规石蜡及梯度乙醇脱水，苏木素染液染 5 min 后自来水冲洗，盐酸酒精分化 5 min 后再次用自来水冲洗，静置返蓝 10 min，再次梯度乙醇脱水，二甲苯透明 5 min，自然干燥后中性树胶封片。每只小鼠选取 3 张肺组织苏木精–伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色切片，每张切片以单盲法选取横断面较圆、直径 100 μm 的细支气管，至少观察 3 支。应用 Image-Pro Plus6.0 图像分析软件测定气道管壁总面积（wall area of bronchial tube，WAt）、平滑肌面积（wall area of bronchial smooth muscle，WAm）、支气管基底膜周径（perimeter of basement membrane，Pbm），用 Pbm 标准化，以 WAt/Pbm、WAm/Pbm 表示，分别代表支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度[15]。
1.2.7 肺组织病理学切片马松三色染色
石蜡切片脱蜡至水，马松（Masson）复合染液染 5 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，5% 磷钼酸溶液洗 1～2 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，苯胺蓝染色液染色 1～2 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，梯度酒精快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每只小鼠选取 3 张肺组织 Masson 染色切片，每张切片以单盲法选取横断面较圆、直径 100 μm 的细支气管，至少观察 3 支。应用 Image-Pro Plus6.0 图像分析软件测定气道基底膜胶原面积（wall area of collagen，WAc），同样用 Pbm 标准化，以 WAc/Pbm 表示，代表胶原沉积面积[15]。
1.2.8 免疫组织化学法观察肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表达
石蜡切片进行免疫组织化学分析。即经脱蜡固定后，加入抗 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 抗体和二抗孵育之后染色封片，显微镜观察。
1.2.9 蛋白印迹法检测肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表达
提取总蛋白后，BCA 蛋白定量检测试剂盒测定蛋白含量，取 50 μg 蛋白样品，10% 十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏氟乙烯膜，5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h，兔抗鼠 Notchl 多克隆抗体（1∶750）、兔抗鼠 Hesl 多克隆抗体（1∶200）、兔抗鼠 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 多克隆抗体（1∶1000）及内参照物 β-肌动蛋白（1∶200）4 ℃ 过夜，兔抗羊 IgG（1∶2000）、羊抗兔 IgG（1∶2000）室温 2 h，显影，检测蛋白条带。蛋白相对表达为目的基因灰度值/内参基因灰度值。
1.2.10 肺组织 HYP 含量测定
采用碱水法检测肺组织 HYP 含量。操作方法严格按照试剂盒说明书进行。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 21.0 统计软件。呈正态分布的计量资料数据以均数±标准差（
±s）表示，各组计量资料数据先进行正态检验和方差齐性检验，凡符合正态分布和方差齐性的数据，采用单因素方差分析，多组间两两比较采用 LSD-t 检验，Pearson 法进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 哮喘模型的建立
（1）小鼠行为学的改变：哮喘组小鼠每次雾化激发后小鼠出现抓耳挠腮、烦躁不安、呼吸急促、腹肌痉挛、大小便失禁等反应；而健康对照组小鼠雾化后行为正常，呼吸平稳。（2）肺功能改变：哮喘组 FEV0.1、FEV0.2、PEF、EF50 值均显著低于健康对照组，Penh 显著高于健康对照组；PM2.5 干预后健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组小鼠 FEV0.1、FEV0.2、PEF 和 EF50 均显著降低，Penh 显著升高（均 P<0.01，表1）。（3）肺组织病理形态学改变：哮喘组小鼠管腔狭窄，气道黏膜褶皱增多、延长，气管及肺血管周围存在大量聚集成团的炎症细胞，平滑肌增厚，管壁周围胶原沉积明显增加；健康对照组无此类改变。PM2.5 干预后，与各自的对照组比较，健康 PM2.5 组气管及血管周围可见炎症细胞浸润；哮喘 PM2.5 组气道管腔明显狭窄，气管血管周围蓝色胶原沉积进一步加重，上皮下纤维化进一步加重，以上改变表明哮喘造模成功，且伴随气道炎症，出现气道重塑；PM2.5 加重哮喘肺功能及组织病理学改变。结果见图1 和图2。
表1
各组小鼠肺功能有关指标的比较（n=10，
）
图1
小鼠肺组织病理像（HE×200）
a. 健康对照组：气道上皮细胞排列整齐，气管及肺血管周围无或少量炎症细胞浸润；b. 健康 PM2.5 组：气管及血管周围可见炎症细胞浸润；c. 哮喘组：气道黏膜褶皱增多、延长，气管及血管周围大量炎症细胞聚集成团，平滑肌增厚；d. 哮喘 PM2.5 组：气道管腔明显狭窄，管腔内大量粘液渗出，周围大量炎性细胞浸润。
图2
小鼠肺组织病理像（Masson×200）
a. 健康对照组：气管血管周围仅见少量蓝色胶原沉积；b. 健康 PM2.5 组：气管血管周围蓝色胶原沉积增加；c. 哮喘组：气管血管周围大量蓝色胶原沉积，上皮下纤维化明显；d. 哮喘 PM2.5 组：气管血管周围蓝色胶原沉积进一步加重，上皮下纤维化进一步加重。
2.2 小鼠气道重塑指标比较
哮喘组气道管壁总面积、气道平滑肌面积及胶原沉积面积均显著高于健康对照组（均 P<0.01）；健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组均分别高于各自对照组，结果显示 PM2.5 对气道重塑有明显的促进作用（P<0.05 或 P<0.01）。结果见表2、图1 和图2。
表2
各组小鼠气道重塑指标比较［n=10，μm2/μm，（
）］
2.3 小鼠肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的免疫组织化学结果
哮喘组小鼠肺组织中 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表达呈强阳性，健康对照组表达较弱；PM2.5 干预后，与各自对照组比较，上述分子的表达强度进一步增加。结果见图3。
图3
小鼠肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 免疫组织化学染色结果（×200）
哮喘组小鼠肺组织中 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表达呈强阳性，健康对照组表达较弱；PM2.5 干预后，上述分子的表达强度进一步增加。
2.4 小鼠肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白测定结果
哮喘组 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ蛋白较健康对照组明显增加，健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组均分别高于各自对照组。结果见表3和图4。
表3
各组小鼠肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表达水平比较（n=10，
）
图4
小鼠肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表达
A：健康对照组；B：健康 PM2.5 组；C：哮喘组；D：哮喘 PM2.5 组
2.5 小鼠肺组织 HYP 含量
健康对照组、健康 PM2.5 组、哮喘组、哮喘 PM2.5 组小鼠肺组织 HYP 含量分别为（40.53±5.73）、（53.92±6.82）、（57.71±7.60）、（70.96±4.44）μg/100 mg，组内比较，差异有统计学意义（F=39.948，P<0.01）。其中，哮喘组肺组织中 HYP 含量较健康对照组明显升高；健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组均分别高于各自对照组（均 P<0.01）。
2.6 相关性分析
哮喘组及哮喘 PM2.5 组，Notch1、Hes1 蛋白和气道管壁总面积、气道平滑肌面积、胶原沉积面积及α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表达及 HYP 含量均呈正相关（P<0.01 或 P<0.05），结果见表4。
表4
各组小鼠 Notch1、Hes1 蛋白与气道重塑的相关性
3 讨论
哮喘是由包括气道炎症细胞和结构细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞、T 淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等）多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[16]。哮喘炎症细胞可以通过释放促炎细胞因子和生长因子等促进气道平滑肌细胞的迁移和增殖，气道慢性炎症得不到有效控制会导致气道的损伤，损伤后气道不完全或不恰当修复可导致气道壁结构的改变，即气道重塑[11, 17]。近年来研究表明哮喘的气道重塑可以和气道炎症同时存在，也可以不依赖于气道炎症而存在[18]。哮喘反复发作，对气道壁结构改变的影响逐渐明显，进而出现不完全可逆或不可逆的气流受限和肺功能下降，严重影响患者的生活质量。目前尚无有效的治疗方法可以逆转气道重塑。因此重视哮喘的早期气道重塑就显得尤为重要。
哮喘气道重塑的主要特征有平滑肌细胞增生和肥大、气道壁增厚、支气管管腔狭窄、气道纤维化等病理改变[19-20]。Zhu 等[21]研究显示，哮喘小鼠气管及细支气管周围存在大量炎症细胞浸润并伴随黏膜下水肿，嗜酸性粒细胞计数明显增高；存在气道平滑肌、基底膜增厚，杯状细胞增生，黏液高分泌及上皮损伤；同时，哮喘小鼠气道上皮厚度明显增加。TGF-β1 属于 TGF-β 超家族，主要参与调控哮喘气道重塑，直接影响气道壁胶原沉积，促进纤维化的形成等[22]。Shen 等[23]研究发现，哮喘小鼠肺组织 TGF-β1 的表达明显升高。α-SMA 可反映平滑肌细胞的数量及其收缩能力，是平滑肌的主要标志物，α-SMA 和 Col-Ⅰ 被认为是早期气道重塑的重要指标[24]。常琴等[25]研究发现哮喘大鼠肺组织 α-SMA 的表达明显升高，Huang 等[26]研究也表明哮喘小鼠肺组织 α-SMA、Col-Ⅰ 的表达量增高。HYP 是胶原蛋白的一种特有氨基酸，其含量可代表胶原的合成量[27]。本研究组织病理学观察到哮喘对照组小鼠气道及血管平滑肌增生肥大、气管管壁和基底膜增厚等气道重塑的表现，胶原沉积增加，哮喘小鼠肺组织 HYP 含量亦明显增加；同时哮喘组小鼠肺组织中 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表达呈强阳性；哮喘组 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白亦明显增加。这些有表明哮喘小鼠存在明显的气道重塑现象。
大气中的 PM2.5 组分复杂，是构成大气污染物的主要组份，包括有机成分（多环芳烃，长链烃）、无机成分（NH4+、SO42－、NO3－等）、重金属元素、病原微生物等[28]。研究表明 PM2.5 可以随细菌、病毒、花粉等物质在下呼吸道和肺泡沉积，引起或加重已有的肺部炎症[29]。也有研究发现在气道内颗粒物趋向于从大向小的气道位置沉积；颗粒物越小，其沉积在离气道口越远的区域，PM2.5 主要沉积在远端小气道[30]。本研究发现 PM2.5 干预后健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组小鼠小气道功能指标 EF50 显著降低，Penh 显著升高。Liu 等[31]研究发现 PM2.5 可显著增加哮喘小鼠肺组织炎症细胞浸润及支气管、血管周围炎症细胞评分，炎症细胞浸润以嗜酸性粒细胞为主；同时 PM2.5 亦可显著增加哮喘小鼠的支气管壁厚度。Xu 等[4]研究发现 PM2.5 可使哮喘大鼠支气管上皮和肺泡壁充血水肿更明显，且显著增加哮喘大鼠支气管壁厚度和平滑肌厚度。本研究结果显示 PM2.5 可增加哮喘小鼠气道壁总面积，气道平滑肌及气道、血管旁胶原沉积面积，同时，α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白及 HYP 含量也显著增加。这表明 PM2.5 可加剧哮喘及健康小鼠气道重塑。
完整的 Notch 信号通路由 Notch 受体、Notch 配体和细胞效应器分子组成。研究发现哺乳动物体内有 4 种同源 Notch 受体（Notch1/2/3/4）和 5 种同源配体（Jagged1/2、Delta1/3/4），通过细胞间的相互接触，活化下游靶基因 Hes 和 Hey 家族，共同调节细胞炎症、免疫失衡及上皮下纤维化等[6]。近年研究发现 Notch 信号通路抑制剂 GSI 可减轻哮喘小鼠气管及血管周围炎症细胞浸润，气道杯状细胞化生及粘液高分泌，同时也可以减轻气道平滑肌增生[32]。Hu 等[33]研究发现，使用 Notch 信号通路抑制剂 KyoT2 可通过 Hes1 依赖的机制减轻哮喘小鼠气道上皮纤维化这一气道重塑现象。Liu 等[34]发现 PM2.5 可以剂量依赖的方式激活 Notch 信号通路，上调 Hes1 的表达参与人支气管上皮细胞 Muc5ac 的表达。Xia 等[35]发现环境超细颗粒物可通过激活哮喘小鼠 Notch4 的表达，促进 T 细胞亚群的失衡，进而加剧哮喘小鼠气道炎症。本研究结果显示，哮喘组小鼠肺组织 Notch1 及 Hes1 蛋白明显增加，哮喘小鼠肺组织 Notch 信号通路活化，PM2.5 加剧此改变，相关性分析提示哮喘组和哮喘 PM2.5 组小鼠 Notch1、Hes1 蛋白表达与气道重塑相关指标 α-SMA、TGF-β1、Col-Ⅰ 和 HYP 呈正相关，表明 PM2.5 引起的哮喘小鼠肺组织 Notch1、Hes1 蛋白表达升高和气道重塑密切相关。
综上所述，PM2.5 能够促进哮喘的早期气道重塑，Notch 信号通路的活化可能参与了 PM2.5 对早期气道重塑的促进作用。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见的慢性异质性气道疾病。气道炎症是哮喘发生发展的关键因素，长期反复炎症刺激可引起气道重塑，是哮喘重要的病理特征[1]。研究发现细颗粒物（particulate matter 2.5，PM2.5）浓度升高和哮喘患者门诊就诊及住院率增加密切相关[2-3]。PM2.5 可影响哮喘气道炎症和气道重塑[4-5]，但确切机制不清。Notch 信号通路是一条高度保守的信号转导途径，在调节细胞炎症、免疫失衡及上皮下纤维化等方面发挥重要作用[6]。Notch 信号调节的缺失，特别是 Notch1 的缺失，最近被认为与一些重要的肺部疾病的发病有关，特别是慢阻肺、哮喘、肺纤维化等[7]。研究发现转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和 Ⅰ 型胶原蛋白（type Ⅰ collagen，Col-Ⅰ）是早期气道重塑的重要标志[8-9]。PM2.5 对哮喘气道重塑的影响，其机制是否与Notch 信号通路有关尚不清楚。本研究以哮喘小鼠为研究对象，观察 PM2.5 对哮喘小鼠气道重塑及 TGF-β1、α-SMA和 Col-Ⅰ 表达的影响，并进一步探讨 PM2.5 对哮喘小鼠肺组织 Notch1 受体及其下游 Hes1 表达的影响，旨在初步明确 PM2.5 影响哮喘气道重塑的分子机制，为预防和治疗哮喘气道重塑奠定理论基础。
1 材料和方法
1.1 实验动物和主要材料
40 只 8 周龄无特定病原级雌性 BALB/c 小鼠，体重（20±2）g，购自兰州大学医学院实验动物中心［批号：SCXK（甘）2018-0002］。主要材料：鸡卵清蛋白（ovalbumin，OVA，美国 Sigma 公司）、10% 氢氧化铝佐剂（天津市恒兴化学试剂制造有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量检测试剂盒和羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）试剂盒（北京索莱宝生物公司），兔抗鼠 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 多克隆抗体（美国 Immunoway 公司）。2050 型空气智能总悬浮颗粒物综合采样器（青岛崂山应用技术研究所），雾化器（PARI BOY N型，德国百瑞公司），图像采集系统（日本尼康株式会社），Image Pro Plus 6.0 图像分析软件（美国 Media Cybernetics 公司），EMMS 动物肺功能测量系统（英国 EMMS 公司），BIO-RAD ChemiDocTM XRS 凝胶成像系统（美国 Bio-Rad 公司）。
1.2 方法
1.2.1 分组
40 只小鼠采用随机数字表法分为健康对照组、健康 PM2.5 组、哮喘组、哮喘 PM2.5 组，共 4 组，每组各 10 只。
1.2.2 PM2.5 的采集与制备
沿用 Chu 等[10]的 PM2.5 采集和制备方法，采集兰州市天水南路交通主干线旁 PM2.5。采样完毕后，将含有 PM2.5 的玻璃纤维滤膜剪成 1 cm ×1 cm 的小方块浸于双蒸水中，超声波震荡器（28 ℃、40 Hz、500 W）洗脱，再洗脱 1 次。将两次所得洗脱液混合，用 6 层纱布过滤，所得滤液即为 PM2.5 的混悬液。低温（–4 ℃）离心 12000 r/min，20 min，将下层 PM2.5 悬液冷冻干燥 48 h，即为 PM2.5，PM2.5 置于 4 ℃ 冰箱保存，实验时配置成所需浓度的混悬液，现配现用。
1.2.3 哮喘模型建立及 PM2.5 干预
参照雷泽林等[11]、Temelkovski 等[12]建模方法，采用 OVA 致敏和激发建立哮喘小鼠模型。哮喘组及哮喘 PM2.5 组分别于第 1、7、14 天腹腔注射致敏液（45 mL 磷酸盐缓冲液+ 5 mL 10% 氢氧化铝+5 mg OVA）200 μL致敏，第 21～28 天于自制雾化箱（20 cm×15 cm×10 cm）内以 2.5% OVA 雾化激发 30 min，每日 1 次。第 29～70 天，隔日 1 次上述雾化激发，每次雾化激发见小鼠出现呼吸急促、烦躁不安、腹肌痉挛等表现时判断为阳性反应；健康对照组及健康 PM2.5 组在致敏和雾化激发阶段给予等剂量生理盐水。参照 Chu 等[10]、Gu 等[13]的方法并加以改良，健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组将小鼠置于 20 cm×15 cm×10 cm 的玻璃熏箱内，于每次激发后给予雾化吸入 PM2.5（510 μg/m3）气溶胶，暴露 4次/d，15 min/次，间隔 0.5 h；健康对照组及哮喘组给予同等体积的生理盐水雾化吸入。
1.2.4 肺功能测定
末次激发及 PM2.5 干预 24 h 后，参照蓝凰齐等[14]方法，给予小鼠 1% 戊巴比妥钠（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，分离组织，暴露气管，插入插管连接 EMMS 动物肺功能测量系统测定第 0.1 秒用力呼气容积（forced expiratory volume in 0.1 second，FEV0. 1）、第 0.2 秒用力呼气末容积（FEV0. 2）、呼气峰流速（peak expiratory flow，PEF）、呼出 50% 潮气量时的流速（EF50）和增强呼吸间歇（enhanced pause，Penh）。
1.2.5 标本收集及保存
肺功能检测结束后，脱颈椎处死各组小鼠，置于冰台上，结扎右总支气管，于气管远端切下右肺，用 4% 的多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片；取左肺组织，迅速置于液氮中，然后保存于–80 ℃ 冰箱中行蛋白免疫印迹法检测。
1.2.6 肺组织病理学切片苏木精–伊红染色
取包埋石蜡块，常规石蜡及梯度乙醇脱水，苏木素染液染 5 min 后自来水冲洗，盐酸酒精分化 5 min 后再次用自来水冲洗，静置返蓝 10 min，再次梯度乙醇脱水，二甲苯透明 5 min，自然干燥后中性树胶封片。每只小鼠选取 3 张肺组织苏木精–伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色切片，每张切片以单盲法选取横断面较圆、直径 100 μm 的细支气管，至少观察 3 支。应用 Image-Pro Plus6.0 图像分析软件测定气道管壁总面积（wall area of bronchial tube，WAt）、平滑肌面积（wall area of bronchial smooth muscle，WAm）、支气管基底膜周径（perimeter of basement membrane，Pbm），用 Pbm 标准化，以 WAt/Pbm、WAm/Pbm 表示，分别代表支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度[15]。
1.2.7 肺组织病理学切片马松三色染色
石蜡切片脱蜡至水，马松（Masson）复合染液染 5 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，5% 磷钼酸溶液洗 1～2 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，苯胺蓝染色液染色 1～2 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，梯度酒精快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每只小鼠选取 3 张肺组织 Masson 染色切片，每张切片以单盲法选取横断面较圆、直径 100 μm 的细支气管，至少观察 3 支。应用 Image-Pro Plus6.0 图像分析软件测定气道基底膜胶原面积（wall area of collagen，WAc），同样用 Pbm 标准化，以 WAc/Pbm 表示，代表胶原沉积面积[15]。
1.2.8 免疫组织化学法观察肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表达
石蜡切片进行免疫组织化学分析。即经脱蜡固定后，加入抗 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 抗体和二抗孵育之后染色封片，显微镜观察。
1.2.9 蛋白印迹法检测肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表达
提取总蛋白后，BCA 蛋白定量检测试剂盒测定蛋白含量，取 50 μg 蛋白样品，10% 十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏氟乙烯膜，5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h，兔抗鼠 Notchl 多克隆抗体（1∶750）、兔抗鼠 Hesl 多克隆抗体（1∶200）、兔抗鼠 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 多克隆抗体（1∶1000）及内参照物 β-肌动蛋白（1∶200）4 ℃ 过夜，兔抗羊 IgG（1∶2000）、羊抗兔 IgG（1∶2000）室温 2 h，显影，检测蛋白条带。蛋白相对表达为目的基因灰度值/内参基因灰度值。
1.2.10 肺组织 HYP 含量测定
采用碱水法检测肺组织 HYP 含量。操作方法严格按照试剂盒说明书进行。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 21.0 统计软件。呈正态分布的计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，各组计量资料数据先进行正态检验和方差齐性检验，凡符合正态分布和方差齐性的数据，采用单因素方差分析，多组间两两比较采用 LSD-t 检验，Pearson 法进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 哮喘模型的建立
（1）小鼠行为学的改变：哮喘组小鼠每次雾化激发后小鼠出现抓耳挠腮、烦躁不安、呼吸急促、腹肌痉挛、大小便失禁等反应；而健康对照组小鼠雾化后行为正常，呼吸平稳。（2）肺功能改变：哮喘组 FEV0.1、FEV0.2、PEF、EF50 值均显著低于健康对照组，Penh 显著高于健康对照组；PM2.5 干预后健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组小鼠 FEV0.1、FEV0.2、PEF 和 EF50 均显著降低，Penh 显著升高（均 P<0.01，表1）。（3）肺组织病理形态学改变：哮喘组小鼠管腔狭窄，气道黏膜褶皱增多、延长，气管及肺血管周围存在大量聚集成团的炎症细胞，平滑肌增厚，管壁周围胶原沉积明显增加；健康对照组无此类改变。PM2.5 干预后，与各自的对照组比较，健康 PM2.5 组气管及血管周围可见炎症细胞浸润；哮喘 PM2.5 组气道管腔明显狭窄，气管血管周围蓝色胶原沉积进一步加重，上皮下纤维化进一步加重，以上改变表明哮喘造模成功，且伴随气道炎症，出现气道重塑；PM2.5 加重哮喘肺功能及组织病理学改变。结果见图1 和图2。
表1
各组小鼠肺功能有关指标的比较（n=10，）
图1
小鼠肺组织病理像（HE×200）
a. 健康对照组：气道上皮细胞排列整齐，气管及肺血管周围无或少量炎症细胞浸润；b. 健康 PM2.5 组：气管及血管周围可见炎症细胞浸润；c. 哮喘组：气道黏膜褶皱增多、延长，气管及血管周围大量炎症细胞聚集成团，平滑肌增厚；d. 哮喘 PM2.5 组：气道管腔明显狭窄，管腔内大量粘液渗出，周围大量炎性细胞浸润。
图2
小鼠肺组织病理像（Masson×200）
a. 健康对照组：气管血管周围仅见少量蓝色胶原沉积；b. 健康 PM2.5 组：气管血管周围蓝色胶原沉积增加；c. 哮喘组：气管血管周围大量蓝色胶原沉积，上皮下纤维化明显；d. 哮喘 PM2.5 组：气管血管周围蓝色胶原沉积进一步加重，上皮下纤维化进一步加重。
2.2 小鼠气道重塑指标比较
哮喘组气道管壁总面积、气道平滑肌面积及胶原沉积面积均显著高于健康对照组（均 P<0.01）；健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组均分别高于各自对照组，结果显示 PM2.5 对气道重塑有明显的促进作用（P<0.05 或 P<0.01）。结果见表2、图1 和图2。
表2
各组小鼠气道重塑指标比较［n=10，μm2/μm，（）］
2.3 小鼠肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的免疫组织化学结果
哮喘组小鼠肺组织中 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表达呈强阳性，健康对照组表达较弱；PM2.5 干预后，与各自对照组比较，上述分子的表达强度进一步增加。结果见图3。
图3
小鼠肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 免疫组织化学染色结果（×200）
哮喘组小鼠肺组织中 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表达呈强阳性，健康对照组表达较弱；PM2.5 干预后，上述分子的表达强度进一步增加。
2.4 小鼠肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白测定结果
哮喘组 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ蛋白较健康对照组明显增加，健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组均分别高于各自对照组。结果见表3和图4。
表3
各组小鼠肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表达水平比较（n=10，）
图4
小鼠肺组织 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表达
A：健康对照组；B：健康 PM2.5 组；C：哮喘组；D：哮喘 PM2.5 组
2.5 小鼠肺组织 HYP 含量
健康对照组、健康 PM2.5 组、哮喘组、哮喘 PM2.5 组小鼠肺组织 HYP 含量分别为（40.53±5.73）、（53.92±6.82）、（57.71±7.60）、（70.96±4.44）μg/100 mg，组内比较，差异有统计学意义（F=39.948，P<0.01）。其中，哮喘组肺组织中 HYP 含量较健康对照组明显升高；健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组均分别高于各自对照组（均 P<0.01）。
2.6 相关性分析
哮喘组及哮喘 PM2.5 组，Notch1、Hes1 蛋白和气道管壁总面积、气道平滑肌面积、胶原沉积面积及α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表达及 HYP 含量均呈正相关（P<0.01 或 P<0.05），结果见表4。
表4
各组小鼠 Notch1、Hes1 蛋白与气道重塑的相关性
3 讨论
哮喘是由包括气道炎症细胞和结构细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞、T 淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等）多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[16]。哮喘炎症细胞可以通过释放促炎细胞因子和生长因子等促进气道平滑肌细胞的迁移和增殖，气道慢性炎症得不到有效控制会导致气道的损伤，损伤后气道不完全或不恰当修复可导致气道壁结构的改变，即气道重塑[11, 17]。近年来研究表明哮喘的气道重塑可以和气道炎症同时存在，也可以不依赖于气道炎症而存在[18]。哮喘反复发作，对气道壁结构改变的影响逐渐明显，进而出现不完全可逆或不可逆的气流受限和肺功能下降，严重影响患者的生活质量。目前尚无有效的治疗方法可以逆转气道重塑。因此重视哮喘的早期气道重塑就显得尤为重要。
哮喘气道重塑的主要特征有平滑肌细胞增生和肥大、气道壁增厚、支气管管腔狭窄、气道纤维化等病理改变[19-20]。Zhu 等[21]研究显示，哮喘小鼠气管及细支气管周围存在大量炎症细胞浸润并伴随黏膜下水肿，嗜酸性粒细胞计数明显增高；存在气道平滑肌、基底膜增厚，杯状细胞增生，黏液高分泌及上皮损伤；同时，哮喘小鼠气道上皮厚度明显增加。TGF-β1 属于 TGF-β 超家族，主要参与调控哮喘气道重塑，直接影响气道壁胶原沉积，促进纤维化的形成等[22]。Shen 等[23]研究发现，哮喘小鼠肺组织 TGF-β1 的表达明显升高。α-SMA 可反映平滑肌细胞的数量及其收缩能力，是平滑肌的主要标志物，α-SMA 和 Col-Ⅰ 被认为是早期气道重塑的重要指标[24]。常琴等[25]研究发现哮喘大鼠肺组织 α-SMA 的表达明显升高，Huang 等[26]研究也表明哮喘小鼠肺组织 α-SMA、Col-Ⅰ 的表达量增高。HYP 是胶原蛋白的一种特有氨基酸，其含量可代表胶原的合成量[27]。本研究组织病理学观察到哮喘对照组小鼠气道及血管平滑肌增生肥大、气管管壁和基底膜增厚等气道重塑的表现，胶原沉积增加，哮喘小鼠肺组织 HYP 含量亦明显增加；同时哮喘组小鼠肺组织中 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表达呈强阳性；哮喘组 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白亦明显增加。这些有表明哮喘小鼠存在明显的气道重塑现象。
大气中的 PM2.5 组分复杂，是构成大气污染物的主要组份，包括有机成分（多环芳烃，长链烃）、无机成分（NH4+、SO42－、NO3－等）、重金属元素、病原微生物等[28]。研究表明 PM2.5 可以随细菌、病毒、花粉等物质在下呼吸道和肺泡沉积，引起或加重已有的肺部炎症[29]。也有研究发现在气道内颗粒物趋向于从大向小的气道位置沉积；颗粒物越小，其沉积在离气道口越远的区域，PM2.5 主要沉积在远端小气道[30]。本研究发现 PM2.5 干预后健康 PM2.5 组和哮喘 PM2.5 组小鼠小气道功能指标 EF50 显著降低，Penh 显著升高。Liu 等[31]研究发现 PM2.5 可显著增加哮喘小鼠肺组织炎症细胞浸润及支气管、血管周围炎症细胞评分，炎症细胞浸润以嗜酸性粒细胞为主；同时 PM2.5 亦可显著增加哮喘小鼠的支气管壁厚度。Xu 等[4]研究发现 PM2.5 可使哮喘大鼠支气管上皮和肺泡壁充血水肿更明显，且显著增加哮喘大鼠支气管壁厚度和平滑肌厚度。本研究结果显示 PM2.5 可增加哮喘小鼠气道壁总面积，气道平滑肌及气道、血管旁胶原沉积面积，同时，α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白及 HYP 含量也显著增加。这表明 PM2.5 可加剧哮喘及健康小鼠气道重塑。
完整的 Notch 信号通路由 Notch 受体、Notch 配体和细胞效应器分子组成。研究发现哺乳动物体内有 4 种同源 Notch 受体（Notch1/2/3/4）和 5 种同源配体（Jagged1/2、Delta1/3/4），通过细胞间的相互接触，活化下游靶基因 Hes 和 Hey 家族，共同调节细胞炎症、免疫失衡及上皮下纤维化等[6]。近年研究发现 Notch 信号通路抑制剂 GSI 可减轻哮喘小鼠气管及血管周围炎症细胞浸润，气道杯状细胞化生及粘液高分泌，同时也可以减轻气道平滑肌增生[32]。Hu 等[33]研究发现，使用 Notch 信号通路抑制剂 KyoT2 可通过 Hes1 依赖的机制减轻哮喘小鼠气道上皮纤维化这一气道重塑现象。Liu 等[34]发现 PM2.5 可以剂量依赖的方式激活 Notch 信号通路，上调 Hes1 的表达参与人支气管上皮细胞 Muc5ac 的表达。Xia 等[35]发现环境超细颗粒物可通过激活哮喘小鼠 Notch4 的表达，促进 T 细胞亚群的失衡，进而加剧哮喘小鼠气道炎症。本研究结果显示，哮喘组小鼠肺组织 Notch1 及 Hes1 蛋白明显增加，哮喘小鼠肺组织 Notch 信号通路活化，PM2.5 加剧此改变，相关性分析提示哮喘组和哮喘 PM2.5 组小鼠 Notch1、Hes1 蛋白表达与气道重塑相关指标 α-SMA、TGF-β1、Col-Ⅰ 和 HYP 呈正相关，表明 PM2.5 引起的哮喘小鼠肺组织 Notch1、Hes1 蛋白表达升高和气道重塑密切相关。
综上所述，PM2.5 能够促进哮喘的早期气道重塑，Notch 信号通路的活化可能参与了 PM2.5 对早期气道重塑的促进作用。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
