引用本文： 石丹丹, 朱黎明. KLF2调控S1P1～S1P5对类中性粒细胞迁移的作用机制. 中国呼吸与危重监护杂志, 2023, 22(2): 124-128. doi: 10.7507/1671-6205.202202009 复制
肺KLF（lung Krüppel-like factor，LKLF）/KLF2（Krüppel-like factor 2）属于锌指转录因子Krüppel-like因子（KLF）家族，参与多种生理病理过程，在细胞的生长、分化、凋亡，肺与血管的发育等过程中，都起到重要作用。本室前期研究发现，在哮喘患者中存在中性粒细胞的KLF2表达下调，延迟中性粒细胞凋亡 [1]。
1-磷酸鞘氨醇（ sphingosine-1-phosphate，S1P）是一种多效脂质介质，通过与高亲和力G蛋白偶联受体S1P1～S1P5结合，调节细胞的多种功能，如增殖、迁移、细胞骨架重排、黏附和炎症。研究发现，S1P与S1P1～S1P5受体信号系统在淋巴细胞运输中起着重要作用 [2]。S1P在血管和淋巴管中富集，而在细胞内或间质液中保持较低水平，形成陡峭的S1P梯度，从而促进淋巴细胞迁移至血管和淋巴管中 [3] 。Odumade等[4]发现KLF2通过直接激活S1P1的启动子，促进T细胞从胸腺移出，归巢到淋巴结 [5] 。中性粒细胞表面表达S1P1～S1P5 [6]，是否也存在KLF2调控S1P1～S1P5引起中性粒细胞迁移？
中性粒细胞来源于骨髓造血干细胞，释放入血后在血管内停留时间约6～8 h，它们很快穿过血管内皮细胞进入组织，发挥各种生理作用，然后凋亡或死亡。因此中性粒细胞的寿命短，且其为终末分化的细胞，不能进行遗传操纵，不适合用于科研。HL-60细胞是人早幼粒白血病细胞，当用含1.3%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的培养基培养HL-60细胞时，HL-60细胞体积会变小，核浆比变小，出现肾型核，此类细胞称为类中性粒细胞，类中性粒细胞内黏附分子LFA-1（CD11a/CD18）和Mac-1（CD11b/CD18）表达增加，使其具有迁移能力[7]。因此类中性粒细胞被广泛用于替代中性粒细胞用于科研[8-9] 。本研究通过干扰类中性粒细胞KLF2的表达，研究KLF2是否通过调控S1P1～S1P5表达，影响类中性粒细胞迁移。
1 材料与方法
1.1 实验材料
HL-60细胞（南京凯基生物科技发展有限公司）；无支原体胎牛血清（杭州四季青公司）；1640培养基（美国 Hyclone公司）；青霉素–链霉素双抗（江苏碧云天生物有限公司）；胰蛋白酶（美国Gibco生物公司）；迪夫快速细胞染色液（珠海贝索生物技术有限公司）；DMSO（德国Sigma公司）；人KLF2基因RNA干扰慢病毒载体、感染增强剂（Enhanced Infection Solution）、感染添加剂Polybrene（上海吉凯基因公司）；十二烷基硫酸钠、四甲基乙二胺、苯甲磺酰氟、细胞组织快速裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、一抗稀释液、二抗稀释液（江苏碧云天生物有限公司）；蛋白质标志物（Thermo Scientific Fermentas公司）；KLF2抗体（Santa Cruz公司）；S1P1抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（武汉博士德生物公司）；辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG（Jackson ImmunoRearch公司）；总RNA提取试剂、cDNA第一链合成试剂盒（Invitrogen life technologies）；PCR预混液、DMarker Ⅰ（康为世纪生物科技有限公司）；96孔培养板、细胞培养瓶、细胞迁移实验小室（Corning公司）、S1P（德国Sigma公司）。引物合成由上海英潍捷基公司完成。
1.2 方法
1.2.1 类中性粒细胞构建
用含1.3% DMSO的培养基培养HL-60细胞5 d，即为类中性粒细胞[10-11]。
1.2.2 慢病毒转染与定位
① 用细胞计数板计算细胞数目；② 6 孔板上选取3孔，分为空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组，每孔加入5×104个类中性粒细胞，按复感染指数（multiplicity of infection，MOI。计算公式：MOI=病毒数/细胞数）为 60 的比例，空白组加入1 mL不含双抗培养基、polybrene（终浓度为5 μg/mL），空载病毒组加入空载病毒、1 mL不含双抗培养基、polybrene（终浓度为 5 μg/mL），KLF2病毒干扰组加入KLF2干扰病毒、1 mL不含双抗培养基、polybrene（终浓度为 5 μg/mL），充分混匀后，放置CO2培养箱中培养； ③ 感染4 d后，荧光显微镜下观察感染效率达到 90%以上，收集细胞。
1.2.3 细胞迁移实验
① 取96孔板作为细胞迁移实验下室，取18个小孔，每孔加入600 µL培养基，18个孔分为空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组三组，每组设置0 µmol/L，0.025 µmol/L，0.05 µmol/L，0.1 µmol/L，0.2 µmol/L，0.4 µmol/L 6个不同梯度浓度的S1P，按不同浓度，分别加入S1P。② 上室中每组加入200 µL培养基，空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组三组都加入5×103个类中性粒细胞，细胞迁移实验小室放入37 ℃培养箱培养60 min。③ 收集下室的细胞，计数板计数细胞，将下室细胞除以5×103，即为各组迁移率。
1.2.4 实时PCR检测各组KLF2、S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5 mRNA表达情况
类中性粒细胞通过总RNA提取试剂进行总RNA提取，取2 µg总RNA进行反转录。反转录得到的cDNA进行实时定量PCR反应，检测KLF2、S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5 mRNA表达情况。
1.2.5 蛋白印迹法检测各组KLF2、S1P1表达
类中性粒细胞通过细胞组织快速裂解液进行总蛋白提取。从总蛋白中取50 µg蛋白通过10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离并电转移到聚偏氟乙烯膜上，1∶200稀释的抗KLF2和S1P1抗体分别进行蛋白印迹分析，ECL化学发光试剂盒显像，凝胶图像分析系统分析各蛋白条带灰度值，并以β-actin为内参标化各样品蛋白电泳条带的灰度数值。
1.3 统计学方法
所得计量资料用均数±标准差（
±s）表示，应用GraphPad Prism18.0统计软件分析，Bartlett检验判断4组计量资料两两之间方差齐性（P>0.1，认为满足方差齐性）后，多组间比较采用单因素方差分析比较，满足方差齐性时采用SNK-q检验，方差不齐时采用Dunnett T3检验。P<0.05认为有统计学意义。
2 结果
2.1 空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组KLF2 蛋白和 mRNA表达变化
慢病毒转染成功后，通过蛋白印迹法检测KLF2病毒干扰组、空载病毒组中KLF2的相对表达量，将KLF2病毒干扰组蛋白相对表达量/空载病毒组蛋白相对表达量×100%，为敲减率，当敲减率>70%，则基因敲减成功，可以继续后续试验。
2.1.1 KLF2蛋白相对表达量
蛋白印迹法检测结果显示，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的KLF2相对表达量分别为0.212±0.326、1.152±0.111、1.206±0.316，与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的KLF2蛋白相对表达量减少（P<0.05），空白组、空载病毒组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。其敲减率约为81%，空载病毒和KLF2病毒转染成功，满足实验需要。结果见图1。
图1
各组类中性粒细胞KLF2蛋白相对表达量
与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的KLF2蛋白相对表达量显著减少（
2.1.2 KLF2 mRNA表达量
实时PCR检测结果显示，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的KLF2 mRNA表达量分别为0.203±0.015、1.033±0.085、0.987±0.123，与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的KLF2 mRNA表达量较少（P<0.05），空白组、空载病毒组比较，表达基本相同（P>0.05）。结果见表1。
表1
各组类中性粒细胞KLF2、S1P1～S1P5 mRNA表达变化比较［n=3，（
）］
2.1.3 KLF2蛋白平均光密度
免疫荧光检测KLF2在类中性粒细胞内的表达，结果显示，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的KLF2平均光密度值分别为0.017±0.003、0.046±0.004、0.049±0.006，与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的KLF2平均光密度值减少（P<0.01），空白组、空载病毒组比较，表达基本相同。结果见图2。
图2
各组类中性粒细胞KLF2免疫荧光检查像
与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的KLF2平均光密度值显著减少（
2.2 细胞迁移实验
KLF2病毒干扰组较空白组、空载病毒组，迁移率明显减少（P<0.05），空载病毒组和空白组迁移率基本相同（P>0.05）。从0 µmol/L至0.1 µmol/L，随着浓度的增加，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组迁移率明显增加（P<0.05），从0.1 µmol/L至0.4 µmol/L ，随着浓度的增加，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组迁移率基本相同（P>0.05）。结果见表2。
表2
不同S1P浓度下各组类中性粒细胞迁移率［n=3，（
）］
2.3 空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组S1P1～S1P5 mRNA表达变化
实时PCR检测结果显示，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的S1P1 mRNA表达量分别为0.383±0.035、1.080±0.121、0.923±0.075，与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的S1P1 mRNA表达量较少（P<0.05），空白组、空载病毒组比较，表达基本相同（P>0.05）。实时PCR检测结果显示，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的S1P2～S1P5 mRNA在各组的表达差异均没有统计学意义（P>0.05）。结果见表1。类中性粒细胞中KLF2不调控S1P2～S1P5表达。
2.4 空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组S1P1 蛋白表达变化
蛋白印迹法检测结果表明，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的S1P1蛋白相对表达量分别为0.474±0.136、2.739±0.115、2.935±0.103，与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的S1P1蛋白相对表达量减少（P<0.05），空白组与空载病毒组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图3。
图3
空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组的S1P1蛋白表达变化
与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的S1P1蛋白相对表达量减少
3 讨论
KLF2做为一种转录因子，参与细胞的迁移，在不同的细胞中，KLF2的作用不同。在成熟T细胞中，KLF2促进T细胞迁移[12]，而在肾透明细胞癌中，KLF2通过促进细胞铁死亡，抑制癌细胞转移[13]。我们的实验通过干扰类中性粒细胞KLF2基因，证明KLF2促进类中性粒细胞迁移。
S1P是鞘氨醇的一种代谢产物，血液中S1P为0.1～1 µmol/L，淋巴结为0.030～0.3 µmol/L，哮喘患者诱导痰中S1P为0.1～10 µmol/L[14]。我们的实验证明从0 µmol/L至0.1 µmol/L，随着浓度的增加，类中性细胞的迁移增加，从0.1 µmol/L至0.4 µmol/L，随着浓度的增加，迁移率无改变，提示已达到S1P的饱和浓度。S1P通过与其受体S1P1～S1P5结合而发挥作用，肺组织中广泛表达S1P1～S1P5，而在中性粒细胞中仅广泛表达S1P1、S1P4和S1P5，S1P2、S1P3表达具有个体差异性。我们的结果显示类中性粒细胞中，S1P1～S1P5都有表达，但KLF2主要调控S1P1，促进类中性粒细胞迁移，我们的研究结果与Odumade等[4]的结果一致。
HL-60细胞表达bak、bik、bax、bad、bcl-2、bcl-w、bcl-xL、bfl-1、fas，以及caspases 1～4和7-10等因子。当DMSO诱导HL-60细胞为类中性粒细胞以后，细胞的凋亡基因bak、bax、bad、fas上调，而抗凋亡基因bik表达下调，达到中性粒细胞的水平[15]。类中性粒细胞也具有黏附迁移能力，能在趋化因子N-甲酰–蛋氨酸–亮氨酸–苯丙氨酸 （N-Formyl-Met-Leu-Phe，fMLP ）和白细胞介素-8的作用下，像中性粒细胞一样形成收缩的尾巴和皱褶的前端的极化外形，也伴随有肌动蛋白丝的重组，然后细胞迁移，在fMLP作用下，类中性粒细胞的迁移能力与中性粒细胞相同[16]。因此类中性粒细胞被广泛用于替代中性粒细胞用于科研[8-9] 。支气管哮喘作为呼吸系统的常见病多发病，近年来发病率呈上升趋势，以致越来越引起人们重视。研究发现哮喘患者气道中性粒细胞较健康人增多，并且和哮喘严重程度成正相关[17]。因此，我们的实验为下一步支气管哮喘患者中性粒细胞向肺部迁移黏附实验提供了相关理论依据，促进了中性粒细胞哮喘的机制发展。此外，由于本研究中KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组之间比较，S1P2～S1P5 mRNA表达量基本相同，提示KLF2不调控S1P2～S1P5表达，因此只检测了S1P1蛋白的表达情况，没有检测S1P2～S1P5蛋白的表达，此为本研究的不足。因此，是否存在其他多个层面机制去共同调控中性粒细胞的黏附迁移，还需进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
肺KLF（lung Krüppel-like factor，LKLF）/KLF2（Krüppel-like factor 2）属于锌指转录因子Krüppel-like因子（KLF）家族，参与多种生理病理过程，在细胞的生长、分化、凋亡，肺与血管的发育等过程中，都起到重要作用。本室前期研究发现，在哮喘患者中存在中性粒细胞的KLF2表达下调，延迟中性粒细胞凋亡 [1]。
1-磷酸鞘氨醇（ sphingosine-1-phosphate，S1P）是一种多效脂质介质，通过与高亲和力G蛋白偶联受体S1P1～S1P5结合，调节细胞的多种功能，如增殖、迁移、细胞骨架重排、黏附和炎症。研究发现，S1P与S1P1～S1P5受体信号系统在淋巴细胞运输中起着重要作用 [2]。S1P在血管和淋巴管中富集，而在细胞内或间质液中保持较低水平，形成陡峭的S1P梯度，从而促进淋巴细胞迁移至血管和淋巴管中 [3] 。Odumade等[4]发现KLF2通过直接激活S1P1的启动子，促进T细胞从胸腺移出，归巢到淋巴结 [5] 。中性粒细胞表面表达S1P1～S1P5 [6]，是否也存在KLF2调控S1P1～S1P5引起中性粒细胞迁移？
中性粒细胞来源于骨髓造血干细胞，释放入血后在血管内停留时间约6～8 h，它们很快穿过血管内皮细胞进入组织，发挥各种生理作用，然后凋亡或死亡。因此中性粒细胞的寿命短，且其为终末分化的细胞，不能进行遗传操纵，不适合用于科研。HL-60细胞是人早幼粒白血病细胞，当用含1.3%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的培养基培养HL-60细胞时，HL-60细胞体积会变小，核浆比变小，出现肾型核，此类细胞称为类中性粒细胞，类中性粒细胞内黏附分子LFA-1（CD11a/CD18）和Mac-1（CD11b/CD18）表达增加，使其具有迁移能力[7]。因此类中性粒细胞被广泛用于替代中性粒细胞用于科研[8-9] 。本研究通过干扰类中性粒细胞KLF2的表达，研究KLF2是否通过调控S1P1～S1P5表达，影响类中性粒细胞迁移。
1 材料与方法
1.1 实验材料
HL-60细胞（南京凯基生物科技发展有限公司）；无支原体胎牛血清（杭州四季青公司）；1640培养基（美国 Hyclone公司）；青霉素–链霉素双抗（江苏碧云天生物有限公司）；胰蛋白酶（美国Gibco生物公司）；迪夫快速细胞染色液（珠海贝索生物技术有限公司）；DMSO（德国Sigma公司）；人KLF2基因RNA干扰慢病毒载体、感染增强剂（Enhanced Infection Solution）、感染添加剂Polybrene（上海吉凯基因公司）；十二烷基硫酸钠、四甲基乙二胺、苯甲磺酰氟、细胞组织快速裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、一抗稀释液、二抗稀释液（江苏碧云天生物有限公司）；蛋白质标志物（Thermo Scientific Fermentas公司）；KLF2抗体（Santa Cruz公司）；S1P1抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（武汉博士德生物公司）；辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG（Jackson ImmunoRearch公司）；总RNA提取试剂、cDNA第一链合成试剂盒（Invitrogen life technologies）；PCR预混液、DMarker Ⅰ（康为世纪生物科技有限公司）；96孔培养板、细胞培养瓶、细胞迁移实验小室（Corning公司）、S1P（德国Sigma公司）。引物合成由上海英潍捷基公司完成。
1.2 方法
1.2.1 类中性粒细胞构建
用含1.3% DMSO的培养基培养HL-60细胞5 d，即为类中性粒细胞[10-11]。
1.2.2 慢病毒转染与定位
① 用细胞计数板计算细胞数目；② 6 孔板上选取3孔，分为空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组，每孔加入5×104个类中性粒细胞，按复感染指数（multiplicity of infection，MOI。计算公式：MOI=病毒数/细胞数）为 60 的比例，空白组加入1 mL不含双抗培养基、polybrene（终浓度为5 μg/mL），空载病毒组加入空载病毒、1 mL不含双抗培养基、polybrene（终浓度为 5 μg/mL），KLF2病毒干扰组加入KLF2干扰病毒、1 mL不含双抗培养基、polybrene（终浓度为 5 μg/mL），充分混匀后，放置CO2培养箱中培养； ③ 感染4 d后，荧光显微镜下观察感染效率达到 90%以上，收集细胞。
1.2.3 细胞迁移实验
① 取96孔板作为细胞迁移实验下室，取18个小孔，每孔加入600 µL培养基，18个孔分为空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组三组，每组设置0 µmol/L，0.025 µmol/L，0.05 µmol/L，0.1 µmol/L，0.2 µmol/L，0.4 µmol/L 6个不同梯度浓度的S1P，按不同浓度，分别加入S1P。② 上室中每组加入200 µL培养基，空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组三组都加入5×103个类中性粒细胞，细胞迁移实验小室放入37 ℃培养箱培养60 min。③ 收集下室的细胞，计数板计数细胞，将下室细胞除以5×103，即为各组迁移率。
1.2.4 实时PCR检测各组KLF2、S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5 mRNA表达情况
类中性粒细胞通过总RNA提取试剂进行总RNA提取，取2 µg总RNA进行反转录。反转录得到的cDNA进行实时定量PCR反应，检测KLF2、S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5 mRNA表达情况。
1.2.5 蛋白印迹法检测各组KLF2、S1P1表达
类中性粒细胞通过细胞组织快速裂解液进行总蛋白提取。从总蛋白中取50 µg蛋白通过10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离并电转移到聚偏氟乙烯膜上，1∶200稀释的抗KLF2和S1P1抗体分别进行蛋白印迹分析，ECL化学发光试剂盒显像，凝胶图像分析系统分析各蛋白条带灰度值，并以β-actin为内参标化各样品蛋白电泳条带的灰度数值。
1.3 统计学方法
所得计量资料用均数±标准差（±s）表示，应用GraphPad Prism18.0统计软件分析，Bartlett检验判断4组计量资料两两之间方差齐性（P>0.1，认为满足方差齐性）后，多组间比较采用单因素方差分析比较，满足方差齐性时采用SNK-q检验，方差不齐时采用Dunnett T3检验。P<0.05认为有统计学意义。
2 结果
2.1 空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组KLF2 蛋白和 mRNA表达变化
慢病毒转染成功后，通过蛋白印迹法检测KLF2病毒干扰组、空载病毒组中KLF2的相对表达量，将KLF2病毒干扰组蛋白相对表达量/空载病毒组蛋白相对表达量×100%，为敲减率，当敲减率>70%，则基因敲减成功，可以继续后续试验。
2.1.1 KLF2蛋白相对表达量
蛋白印迹法检测结果显示，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的KLF2相对表达量分别为0.212±0.326、1.152±0.111、1.206±0.316，与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的KLF2蛋白相对表达量减少（P<0.05），空白组、空载病毒组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。其敲减率约为81%，空载病毒和KLF2病毒转染成功，满足实验需要。结果见图1。
图1
各组类中性粒细胞KLF2蛋白相对表达量
与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的KLF2蛋白相对表达量显著减少（
2.1.2 KLF2 mRNA表达量
实时PCR检测结果显示，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的KLF2 mRNA表达量分别为0.203±0.015、1.033±0.085、0.987±0.123，与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的KLF2 mRNA表达量较少（P<0.05），空白组、空载病毒组比较，表达基本相同（P>0.05）。结果见表1。
表1
各组类中性粒细胞KLF2、S1P1～S1P5 mRNA表达变化比较［n=3，（）］
2.1.3 KLF2蛋白平均光密度
免疫荧光检测KLF2在类中性粒细胞内的表达，结果显示，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的KLF2平均光密度值分别为0.017±0.003、0.046±0.004、0.049±0.006，与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的KLF2平均光密度值减少（P<0.01），空白组、空载病毒组比较，表达基本相同。结果见图2。
图2
各组类中性粒细胞KLF2免疫荧光检查像
与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的KLF2平均光密度值显著减少（
2.2 细胞迁移实验
KLF2病毒干扰组较空白组、空载病毒组，迁移率明显减少（P<0.05），空载病毒组和空白组迁移率基本相同（P>0.05）。从0 µmol/L至0.1 µmol/L，随着浓度的增加，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组迁移率明显增加（P<0.05），从0.1 µmol/L至0.4 µmol/L ，随着浓度的增加，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组迁移率基本相同（P>0.05）。结果见表2。
表2
不同S1P浓度下各组类中性粒细胞迁移率［n=3，（）］
2.3 空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组S1P1～S1P5 mRNA表达变化
实时PCR检测结果显示，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的S1P1 mRNA表达量分别为0.383±0.035、1.080±0.121、0.923±0.075，与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的S1P1 mRNA表达量较少（P<0.05），空白组、空载病毒组比较，表达基本相同（P>0.05）。实时PCR检测结果显示，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的S1P2～S1P5 mRNA在各组的表达差异均没有统计学意义（P>0.05）。结果见表1。类中性粒细胞中KLF2不调控S1P2～S1P5表达。
2.4 空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组S1P1 蛋白表达变化
蛋白印迹法检测结果表明，KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组的S1P1蛋白相对表达量分别为0.474±0.136、2.739±0.115、2.935±0.103，与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的S1P1蛋白相对表达量减少（P<0.05），空白组与空载病毒组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图3。
图3
空白组、空载病毒组、KLF2病毒干扰组的S1P1蛋白表达变化
与空白组、空载病毒组比较，KLF2病毒干扰组的S1P1蛋白相对表达量减少
3 讨论
KLF2做为一种转录因子，参与细胞的迁移，在不同的细胞中，KLF2的作用不同。在成熟T细胞中，KLF2促进T细胞迁移[12]，而在肾透明细胞癌中，KLF2通过促进细胞铁死亡，抑制癌细胞转移[13]。我们的实验通过干扰类中性粒细胞KLF2基因，证明KLF2促进类中性粒细胞迁移。
S1P是鞘氨醇的一种代谢产物，血液中S1P为0.1～1 µmol/L，淋巴结为0.030～0.3 µmol/L，哮喘患者诱导痰中S1P为0.1～10 µmol/L[14]。我们的实验证明从0 µmol/L至0.1 µmol/L，随着浓度的增加，类中性细胞的迁移增加，从0.1 µmol/L至0.4 µmol/L，随着浓度的增加，迁移率无改变，提示已达到S1P的饱和浓度。S1P通过与其受体S1P1～S1P5结合而发挥作用，肺组织中广泛表达S1P1～S1P5，而在中性粒细胞中仅广泛表达S1P1、S1P4和S1P5，S1P2、S1P3表达具有个体差异性。我们的结果显示类中性粒细胞中，S1P1～S1P5都有表达，但KLF2主要调控S1P1，促进类中性粒细胞迁移，我们的研究结果与Odumade等[4]的结果一致。
HL-60细胞表达bak、bik、bax、bad、bcl-2、bcl-w、bcl-xL、bfl-1、fas，以及caspases 1～4和7-10等因子。当DMSO诱导HL-60细胞为类中性粒细胞以后，细胞的凋亡基因bak、bax、bad、fas上调，而抗凋亡基因bik表达下调，达到中性粒细胞的水平[15]。类中性粒细胞也具有黏附迁移能力，能在趋化因子N-甲酰–蛋氨酸–亮氨酸–苯丙氨酸 （N-Formyl-Met-Leu-Phe，fMLP ）和白细胞介素-8的作用下，像中性粒细胞一样形成收缩的尾巴和皱褶的前端的极化外形，也伴随有肌动蛋白丝的重组，然后细胞迁移，在fMLP作用下，类中性粒细胞的迁移能力与中性粒细胞相同[16]。因此类中性粒细胞被广泛用于替代中性粒细胞用于科研[8-9] 。支气管哮喘作为呼吸系统的常见病多发病，近年来发病率呈上升趋势，以致越来越引起人们重视。研究发现哮喘患者气道中性粒细胞较健康人增多，并且和哮喘严重程度成正相关[17]。因此，我们的实验为下一步支气管哮喘患者中性粒细胞向肺部迁移黏附实验提供了相关理论依据，促进了中性粒细胞哮喘的机制发展。此外，由于本研究中KLF2病毒干扰组、空白组、空载病毒组之间比较，S1P2～S1P5 mRNA表达量基本相同，提示KLF2不调控S1P2～S1P5表达，因此只检测了S1P1蛋白的表达情况，没有检测S1P2～S1P5蛋白的表达，此为本研究的不足。因此，是否存在其他多个层面机制去共同调控中性粒细胞的黏附迁移，还需进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
