引用本文： 冯净净, 邵川, 李俊卿, 施天昀, 都勇, 揭志军, 施劲东. 抑制p38丝裂素活化蛋白激酶途径调控Th17和Treg失衡减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤. 中国呼吸与危重监护杂志, 2023, 22(1): 44-51. doi: 10.7507/1671-6205.202205020 复制
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）以肺泡–毛细血管膜炎症损伤、多形核中性粒细胞黏附、活化和浸润为特征，严重ALI可导致肺水肿、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），最终出现呼吸衰竭[1]。促炎细胞因子参与的全身和局部炎症反应在ALI病理生理学中起着重要作用，过度炎症反应导致器官功能障碍，进而发展为ARDS[2]。尽管目前对ALI/ARDS的治疗研究较多，但仍然缺乏有效的治疗措施。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）被广泛用来建立ALI/ARDS小鼠模型，气道内注射LPS已被证明会损伤上皮细胞层，诱导上皮细胞凋亡，并导致活性氧、促炎细胞因子和趋化因子的释放，导致中性粒细胞聚集及肺组织损伤[3]。p38丝裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是MAPK家族成员之一。多种细胞外刺激可激活p38 MAPK，包括渗透和热应激、生长因子、炎症细胞因子和紫外线辐射，p38 MAPK影响各种细胞过程，包括增殖、分化、凋亡和炎症[4]。LPS刺激可激活MAPKs信号通路参与炎症反应的形成，亦有研究证实MAPKs信号转导通路参与了LPS诱导的ALI肺组织内炎性细胞的浸润，并发挥着重要作用[5]。研究显示通过抑制MAPKs和白细胞介素（interleukin，IL）-6/STAT3信号通路可改善LPS诱导的ALI[6]。SB203580已被鉴定是p38 MAPK抑制剂的分子靶点，更有效果且毒性更低，它的抗炎作用已被许多研究证实[7]。调节性T细胞（regulatory cells，Treg）和Th17细胞是CD4+ T细胞的两个亚群，在功能上具有相反的作用。Treg表达表面标志物CD25，并参与抑制过度的T细胞对自身和非自身抗原的反应，叉头框蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）是Treg发育和功能的关键转录因子，Treg细胞在ALI发病过程种起到了重要作用[8]。白细胞介素（interleukin，IL）-17A是Th17细胞释放的主要细胞因子，可诱导呼吸道上皮产生有利于中性粒细胞浸润的趋化因子，作为促炎介质参与ARDS的发生[9]。Treg和Th17之间的平衡对于避免肺损伤期间的组织炎症至关重要。研究显示阻断IL-2诱导的T细胞激酶信号可以通过调节Th17/Treg减弱ALI所致的氧化应激反应[10]。本研究拟通过腹腔注射LPS建立ALI小鼠模型，观察p38 MAPK信号通路在其中的作用，并通过抑制剂SB203580的作用阻断p38 MAPK信号通路的作用，观察Th17和Treg细胞平衡的变化，探讨该信号通路是否可以通过调控Th17和Treg平衡发挥肺保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验分组和动物模型制备
健康雄性Balb/c小鼠由中国上海实验动物研究所提供，小鼠体重在18～20 g，所有实验均经复旦大学上海医学院动物保护与使用委员会批准后实施。将小鼠随机分为对照组（n=8）、ALI组（n=8）和干预组（n=32）。对照组小鼠注射磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），ALI组小鼠腹腔注射40 mg/kg体重的LPS（Sigma，大肠杆菌O55∶B5），而干预组小鼠分别在LPS给药前1 h腹腔注射浓度为0.5、1、2、5 mg/kg体重的SB203580（Sigma）。各组小鼠均于腹腔注射LPS 12 h后，通过心包穿刺取血并处死小鼠。
1.2 方法
1.2.1 肺组织病理学检测
肺组织正常固定、脱水、包埋、切片获得苏木精–伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色切片。每个HE染色切片随机选择4个高倍视野，采用盲法选取两位观察者对肺组织病理变化程度进行评分，炎症评分采用5分制[11]，比较肺组织和炎性细胞的变化。
1.2.2 肺泡灌洗液中总蛋白的表达及细胞计数
气管内插管进行2次1 mL PBS清洗，获取支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。300 g离心10 min，PBS重悬细胞，采用贝克曼库尔特（Beckman Coulter）计数。用Bradford蛋白测定试剂盒（BioRad，Hercules，CA）在595 nm读取上清蛋白含量，使用MAXline Kinetic microplate阅读器（Molecular Devices，Sunnyvale，CA），以牛血清白蛋白为标准。
1.2.3 实时聚合酶链反应检测RORγt和Foxp3 mRNA表达
将新鲜采集的肺左下叶快速冷冻，并在80 ℃保存。使用RNeasy Mini Kit试剂（Qiagen，美国）从冷冻组织中提取总RNA。采用实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）方法检测组织中视黄酸受体相关孤儿受体γt（retinoic acid receptor-related orphan receptor-γt，RORγt）和叉头框蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）mRNA表达量，β-肌动蛋白（β-actin）为管家基因。反应体系共25 μL，其中RNA模板（2.5 μL）、正向引物（10 μmol/L 0.75 μL），反向引物（10 μmol/L 0.75 μL）；20×Eva Green （12.5 μL），ddH2O （6.25 μL）。在Eppendorf扩增仪上进行扩增，反应条件为：42 ℃反转录30 min，95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸40 s，40个循环，退火延伸温度时收集荧光，加溶解曲线。根据CT值计算对照组与实验组目的基因的相对表达量。基因特异性引物序列见表1。
表1
PCR引物
1.2.4 酶联免疫吸附试验检测肺组织及血清中细胞因子的表达
提取新鲜肺组织细胞总蛋白，4 ℃离心，12000 g 30 min。收集上清液，利用酶联免疫吸附试验试剂盒测量细胞因子IL-6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-17、IL-10、IL-23和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β。R&D，Minneapolis，MN，美国）。每个样本做复孔。
1.2.5 流式细胞术检测脾脏组织中Th17和Treg细胞的表达
取脾脏组织，将组织解剖成小块、研磨，然后通过无菌网过滤提取单细胞悬浮液。红细胞溶解后进行流式细胞分析。利用CD4+CD25+ Foxp3+标记Treg细胞，淋巴细胞悬液中染色荧光标记的表面抗体，CD4（FITC标记。GK1.5；eBioscience，San Diego，CA，美国）和CD25（PerCP-Cy5.5标记。PC61.5；eBioscience），4 ℃避光环境中孵育30 min，再用Foxp3（PE标记）染色，在1×Fix/Perm缓冲液（eBioscience）中固定和渗透破膜30 min。CD3+CD4+IL-17A+标记Th17淋巴细胞，将细胞与CD3（PB标记）CD4（FITC标记）孵育表面染色，固定通透后，再用IL-17A （PE标记。eBio17B7；eBioscience）染色。PBS洗涤3次后，重悬细胞并接受流式细胞仪（BD Bioscience，San Jose，CA，美国）检测。使用FlowJo 7.6版软件（TreeStar，Ashland，OR）对数据进行分析。
1.3 统计学方法
使用GraphPad Prism 5软件（GraphPad software，La Jolla，CA，美国）进行统计学分析。呈正态分布的计量数据以均数±标准差（
±s）表示，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 p38 MAPK抑制剂能减轻LPS引起的肺组织损伤
HE染色光镜下观察评价小鼠肺组织病理变化（图1）。结果可见ALI组小鼠较对照组肺组织内可见明炎性细胞浸润，肺泡间质增厚，经SB203580干预组间质增厚较ALI组减轻，炎性细胞浸润减少。在5 mg/kg SB203580干预组，小鼠的组织学基本恢复正常。ALI组小鼠肺组织炎性评分较对照组明显升高（P<0.05），SB203580干预后肺组织炎性评分减低，且与用药浓度呈一定相关性，用药浓度越高，炎症评分越低。结果见图2。
图1
各组小鼠肺组织病理检查像（HE×200）
a. 对照组；b. ALI组；c. 0.5 mg/kg药物干预组；d. 1 mg/kg药物干预组；e. 2 mg/kg药物干预组；f. 5 mg/kg药物干预组。ALI组小鼠较对照组肺组织内可见明炎性细胞浸润，肺泡间质增厚，经SB203580干预组间质增厚较ALI组减轻，炎性细胞浸润减少。在5 mg/kg SB203580干预组，小鼠的组织学基本恢复正常。
图2
各组小鼠肺组织病理评分
与对照组比较，#
2.2 p38 MAPK抑制剂减轻肺泡灌洗液中炎性细胞浸润及蛋白分泌
与肺组织病理变化结果一致，LPS刺激后的小鼠BALF中的细胞总数和蛋白较对照组增加（P<0.05）。SB203580干预组细胞数量和蛋白均明显减少。与对照组比较，BALF中单核细胞和中性粒细胞在ALI组明显升高。SB203580干预组总细胞数较ALI组有所下降，且随着用药浓度的增加，下降程度越明显，其中单核细胞和中性粒细胞在ALI组均有明显升高，药物干预后有所下降。结果见图3。
图3
SB203508对LPS诱导的ALI小鼠BALF中细胞数量和蛋白的影响
a. 细胞总数；b. 蛋白；c. 中性粒细胞计数；d. 巨噬细胞计数。与对照组比较，#
2.3 p38MAPK抑制剂能减轻Th17相关细胞因子的分泌，促进IL-10的表达
ALI组肺组织中IL-17、IL-23、TGF-β和IL-10细胞因子的表达较对照组均有明显的升高，SB203580干预后，血清中IL-6、TNF-α以及肺组织中IL-17、IL-23和TGF-β的表达受到抑制，其中TGF-β的表达的降低与SB203580呈浓度依赖性，IL-6、IL-23和IL-17在1 mg/kg的SB203580的浓度下抑制作用最明显。IL-10的表达呈相反趋势，SB203580干预组小鼠肺组织IL-10水平明显高于ALI组，经SB203580干预后能明显促进IL-10的表达，与浓度呈正相关。结果见图4。
图4
SB203508对LPS诱导的ALI小鼠血清及肺组织中炎性细胞因子的影响
a. 血清IL-6；b. 血清TNF-α；c. 肺组织IL-10；d. 肺组织IL-6；e. 肺组织IL-23；f. 肺组织IL-17；g. 肺组织TGF-β。与对照组比较，#
2.4 p38MAPK抑制剂可抑制Th17相关转录因子RORγt mRNA的表达，而促进Treg相关转录因子Foxp3 mRNA的表达
ALI组RORγt mRNA表达明显高于对照组，而SB203508组RORγt mRNA表达明显低于对照组。LPS也能诱导Foxp3 mRNA的表达，经SB203580干预后，小鼠肺组织中Foxp3 mRNA的表达水平进一步升高，明显高于ALI组。经SB203580干预后，转录水平RORγt/Foxp3比值降低，肺组织内更倾向于Foxp3的表达。结果见图5。
图5
SB203508对LPS诱导的ALI小鼠肺组织RORγt和Foxp3 mRNA表达的影响
a. 肺组织RORγt；b. 肺组织Foxp3；c. 肺组织RORγt与Foxp3的比值。与对照组比较，#
2.5 p38MAPK抑制剂可以纠正LPS导致的Th17/Treg细胞表达失衡
与正常小鼠比较，LPS所致的ALI小鼠脾脏淋巴细胞中Treg和Th17细胞数量均有明显增加。Th17/Treg平衡状态中倾向于Th17细胞的增多。SB203580干预后增加了Treg细胞的数量，降低了Th17细胞的比例。5 mg/kg SB203580干预组Th17/Treg比值降低，接近于对照组小鼠。结果见图6。
图6
SB203508对LPS诱导的ALI小鼠脾脏Th17和Treg细胞表达的影响
a. Th17细胞亚群流式细胞检测像；b. Treg细胞流式细胞检测像；c. Th17细胞亚群流式细胞检测结果；d. Treg细胞流式细胞检测结果；e. Th17细胞亚群与Treg细胞的比值。A. 对照组；B. ALI组；C. 0.5 mg/kg药物干预组；D. 1 mg/kg药物干预组；E. 2 mg/kg药物干预组；F. 5 mg/kg药物干预组。与对照组比较，#
3 讨论
肺内中性粒细胞等炎症细胞的浸润和炎症介质的释放是ALI的主要特征之一[12]。当肺部受到病原微生物攻击时，中性粒细胞在肺微血管、间质和支气管肺泡间隙聚集，并分泌蛋白酶，阳离子化合物和活性氧化剂等有效抗菌分子。然而，中性粒细胞的迁移及炎症过度反应也会导致肺泡腔的机械性损伤及加重肺泡腔内的渗出，从而发生ALI/ARDS[13]。本研究通过腹腔注射LPS建立ALI动物模型，LPS诱导肺组织出现炎症反应和BALF中炎症细胞及总蛋白水平的增加。SB203508干预后，LPS诱导的ALI小鼠肺泡灌洗液中各类细胞数和蛋白减少，HE染色提示肺部炎症有所减轻，提示SB203508可抑制炎症反应和炎性细胞的聚集，减轻LPS诱导的小鼠肺损伤，这种保护作用与剂量呈正相关。
LPS刺激导致的炎症反应是一个复杂的细胞因子网络，TNF-α、IL-6和其他促炎化合物的释放可引发、放大和延续炎症级联反应。IL-1β、IL-6和TNF-α被认为是ALI严重程度的预测指标[14]。研究发现车前草苷可以抑制p38MAPK信号通路的激活，减少IL-6和TNF-α等促炎性细胞因子的释放，减轻ALI小鼠的肺组织炎症反应[15]。IL-6细胞因子水平的下降，可以通过影响Th17和Treg细胞平衡减轻大鼠模型中宫内感染诱导早产儿的ARDS[16]。通过以上的研究结果推测p38MAPK信号通路的抑制使得IL-6等促炎性细胞因子分泌减少，IL-6可以通过影响Th17/Treg平衡影响ARDS的疾病进程。本研究发现经ALI小鼠体内存在IL-6细胞因子的过表达，干预组小鼠经SB203580干预后IL-6的表达明显下降，在1 mg/kg的剂量时抑制效果最明显，更多的药物浓度并没有带来更明显的IL-6水平的下降。Th17细胞的分化与IL-1、IL-6及转化生长因子相关联[17]。本研究还发现ALI组小鼠Th17细胞及相关细胞因子的表达明显升高，而干预组小鼠Th17细胞表达及相关细胞因子的分泌明显下降，这与IL-6的表达水平相一致，推测p38 MAPK信号通路被抑制后引起IL-6分泌的减少，进而减少了Th17细胞的生成。
Th17细胞在防御细胞外病原体中发挥关键作用，并参与许多自身免疫性炎症的形成。Treg细胞的主要功能是调节免疫应答的平衡，控制T细胞对病原体、严重炎症和组织破坏的适度应答。已有多项研究发现Th17和Treg细胞参与ALI/ARDS的病理过程。Yu等[18]研究发现ARDS患者外周血单核细胞中能检测到Th17细胞和相关的细胞因子IL-17的升高，ALI/ARDS的发病过程中会打破Th17细胞和Treg细胞平衡，该失衡状态进一步导致ALI/ARDS的进展。Treg细胞主要通过细胞与细胞之间的接触和分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1调节肺组织内免疫应答，对ALI/ARDS起保护作用[19]。Treg细胞的免疫调节功能通过一系列的细胞因子实现，主要有IL-10和TGF-β1，D'Alessio等[20]研究发现ALI小鼠和患者BALF中增多的Treg细胞可通过诱导TGF-β1和中性粒细胞的凋亡来减轻ALI的病理反应。既往研究发现Treg细胞分泌的IL-10是Treg细胞产生的保护性免疫调节细胞因子，IL-10可通过抑制TNF-α的产生在ALI/ARDS病理过程中起保护作用[21]，IL-10的作用被抑制将加重ARDS的病理反应[22]。本研究也发现ALI组小鼠体内IL-10表达明显升高，干预组小鼠IL-10的表达进一步升高。我们推测，抑制p38 MAPK信号通路可以通过调控如IL-10细胞因子的分泌，刺激Foxp3 mRNA的表达和Treg细胞的生成，从而发挥了对ALI的肺保护作用。TGF-β主要通过p38 MAPK和SMAD3信号通路参与炎症反应作用过程[23]。本研究也证实在抑制p38MAPK信号通路后，TGF-β的表达明显被抑制。我们的前期研究提示阻断p38 MAPK能抑制Th17细胞分泌相关细胞因子[24]。本实验结果也显示ALI小鼠中Th17和Treg细胞及其分泌的细胞因子均有升高，抑制p38 MAPK信号通路能调控Th17和Treg细胞分化过程中的关键细胞因子而调控Th17/Treg平衡，最终减轻肺组织损伤。
综上所述，LPS诱导ALI小鼠模型中，存在Th17/Treg细胞功能失衡现象。应用p38 MAPK抑制剂可抑制Th17相关转录因子RORγt mRNA的表达，进而减少IL-6、IL-23和TNF-α促炎因子的分泌，且促进Treg相关转录因子Foxp3 mRNA的表达，进而增加抑炎因子IL-10的分泌，最终在BALF炎症指标和组织病理学层面观察到ALI的减轻，且这种作用在一定范围内剂量与疗效呈正相关。因此，我们推测p38 MAPK抑制剂可能通过改变Th17/Treg失衡状态减轻LPS所致的小鼠肺损伤程度，提示p38 MAPK可能是ALI/ARDS治疗的一个潜在靶点。本研究还存在一定的局限性，首先，仅开展了小鼠动物模型实验，需要进一步通过ALI/ARDS患者血液样本及BALF样本进行验证；其次，造模使用的方法为腹腔注射LPS，仅代表革兰阴性杆菌感染所致ALI；最后，没有对p38 MAPK抑制剂调控Th17和Treg细胞的具体信号通路各环节进行研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）以肺泡–毛细血管膜炎症损伤、多形核中性粒细胞黏附、活化和浸润为特征，严重ALI可导致肺水肿、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），最终出现呼吸衰竭[1]。促炎细胞因子参与的全身和局部炎症反应在ALI病理生理学中起着重要作用，过度炎症反应导致器官功能障碍，进而发展为ARDS[2]。尽管目前对ALI/ARDS的治疗研究较多，但仍然缺乏有效的治疗措施。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）被广泛用来建立ALI/ARDS小鼠模型，气道内注射LPS已被证明会损伤上皮细胞层，诱导上皮细胞凋亡，并导致活性氧、促炎细胞因子和趋化因子的释放，导致中性粒细胞聚集及肺组织损伤[3]。p38丝裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是MAPK家族成员之一。多种细胞外刺激可激活p38 MAPK，包括渗透和热应激、生长因子、炎症细胞因子和紫外线辐射，p38 MAPK影响各种细胞过程，包括增殖、分化、凋亡和炎症[4]。LPS刺激可激活MAPKs信号通路参与炎症反应的形成，亦有研究证实MAPKs信号转导通路参与了LPS诱导的ALI肺组织内炎性细胞的浸润，并发挥着重要作用[5]。研究显示通过抑制MAPKs和白细胞介素（interleukin，IL）-6/STAT3信号通路可改善LPS诱导的ALI[6]。SB203580已被鉴定是p38 MAPK抑制剂的分子靶点，更有效果且毒性更低，它的抗炎作用已被许多研究证实[7]。调节性T细胞（regulatory cells，Treg）和Th17细胞是CD4+ T细胞的两个亚群，在功能上具有相反的作用。Treg表达表面标志物CD25，并参与抑制过度的T细胞对自身和非自身抗原的反应，叉头框蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）是Treg发育和功能的关键转录因子，Treg细胞在ALI发病过程种起到了重要作用[8]。白细胞介素（interleukin，IL）-17A是Th17细胞释放的主要细胞因子，可诱导呼吸道上皮产生有利于中性粒细胞浸润的趋化因子，作为促炎介质参与ARDS的发生[9]。Treg和Th17之间的平衡对于避免肺损伤期间的组织炎症至关重要。研究显示阻断IL-2诱导的T细胞激酶信号可以通过调节Th17/Treg减弱ALI所致的氧化应激反应[10]。本研究拟通过腹腔注射LPS建立ALI小鼠模型，观察p38 MAPK信号通路在其中的作用，并通过抑制剂SB203580的作用阻断p38 MAPK信号通路的作用，观察Th17和Treg细胞平衡的变化，探讨该信号通路是否可以通过调控Th17和Treg平衡发挥肺保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验分组和动物模型制备
健康雄性Balb/c小鼠由中国上海实验动物研究所提供，小鼠体重在18～20 g，所有实验均经复旦大学上海医学院动物保护与使用委员会批准后实施。将小鼠随机分为对照组（n=8）、ALI组（n=8）和干预组（n=32）。对照组小鼠注射磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），ALI组小鼠腹腔注射40 mg/kg体重的LPS（Sigma，大肠杆菌O55∶B5），而干预组小鼠分别在LPS给药前1 h腹腔注射浓度为0.5、1、2、5 mg/kg体重的SB203580（Sigma）。各组小鼠均于腹腔注射LPS 12 h后，通过心包穿刺取血并处死小鼠。
1.2 方法
1.2.1 肺组织病理学检测
肺组织正常固定、脱水、包埋、切片获得苏木精–伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色切片。每个HE染色切片随机选择4个高倍视野，采用盲法选取两位观察者对肺组织病理变化程度进行评分，炎症评分采用5分制[11]，比较肺组织和炎性细胞的变化。
1.2.2 肺泡灌洗液中总蛋白的表达及细胞计数
气管内插管进行2次1 mL PBS清洗，获取支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。300 g离心10 min，PBS重悬细胞，采用贝克曼库尔特（Beckman Coulter）计数。用Bradford蛋白测定试剂盒（BioRad，Hercules，CA）在595 nm读取上清蛋白含量，使用MAXline Kinetic microplate阅读器（Molecular Devices，Sunnyvale，CA），以牛血清白蛋白为标准。
1.2.3 实时聚合酶链反应检测RORγt和Foxp3 mRNA表达
将新鲜采集的肺左下叶快速冷冻，并在80 ℃保存。使用RNeasy Mini Kit试剂（Qiagen，美国）从冷冻组织中提取总RNA。采用实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）方法检测组织中视黄酸受体相关孤儿受体γt（retinoic acid receptor-related orphan receptor-γt，RORγt）和叉头框蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）mRNA表达量，β-肌动蛋白（β-actin）为管家基因。反应体系共25 μL，其中RNA模板（2.5 μL）、正向引物（10 μmol/L 0.75 μL），反向引物（10 μmol/L 0.75 μL）；20×Eva Green （12.5 μL），ddH2O （6.25 μL）。在Eppendorf扩增仪上进行扩增，反应条件为：42 ℃反转录30 min，95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸40 s，40个循环，退火延伸温度时收集荧光，加溶解曲线。根据CT值计算对照组与实验组目的基因的相对表达量。基因特异性引物序列见表1。
表1
PCR引物
1.2.4 酶联免疫吸附试验检测肺组织及血清中细胞因子的表达
提取新鲜肺组织细胞总蛋白，4 ℃离心，12000 g 30 min。收集上清液，利用酶联免疫吸附试验试剂盒测量细胞因子IL-6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-17、IL-10、IL-23和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β。R&D，Minneapolis，MN，美国）。每个样本做复孔。
1.2.5 流式细胞术检测脾脏组织中Th17和Treg细胞的表达
取脾脏组织，将组织解剖成小块、研磨，然后通过无菌网过滤提取单细胞悬浮液。红细胞溶解后进行流式细胞分析。利用CD4+CD25+ Foxp3+标记Treg细胞，淋巴细胞悬液中染色荧光标记的表面抗体，CD4（FITC标记。GK1.5；eBioscience，San Diego，CA，美国）和CD25（PerCP-Cy5.5标记。PC61.5；eBioscience），4 ℃避光环境中孵育30 min，再用Foxp3（PE标记）染色，在1×Fix/Perm缓冲液（eBioscience）中固定和渗透破膜30 min。CD3+CD4+IL-17A+标记Th17淋巴细胞，将细胞与CD3（PB标记）CD4（FITC标记）孵育表面染色，固定通透后，再用IL-17A （PE标记。eBio17B7；eBioscience）染色。PBS洗涤3次后，重悬细胞并接受流式细胞仪（BD Bioscience，San Jose，CA，美国）检测。使用FlowJo 7.6版软件（TreeStar，Ashland，OR）对数据进行分析。
1.3 统计学方法
使用GraphPad Prism 5软件（GraphPad software，La Jolla，CA，美国）进行统计学分析。呈正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 p38 MAPK抑制剂能减轻LPS引起的肺组织损伤
HE染色光镜下观察评价小鼠肺组织病理变化（图1）。结果可见ALI组小鼠较对照组肺组织内可见明炎性细胞浸润，肺泡间质增厚，经SB203580干预组间质增厚较ALI组减轻，炎性细胞浸润减少。在5 mg/kg SB203580干预组，小鼠的组织学基本恢复正常。ALI组小鼠肺组织炎性评分较对照组明显升高（P<0.05），SB203580干预后肺组织炎性评分减低，且与用药浓度呈一定相关性，用药浓度越高，炎症评分越低。结果见图2。
图1
各组小鼠肺组织病理检查像（HE×200）
a. 对照组；b. ALI组；c. 0.5 mg/kg药物干预组；d. 1 mg/kg药物干预组；e. 2 mg/kg药物干预组；f. 5 mg/kg药物干预组。ALI组小鼠较对照组肺组织内可见明炎性细胞浸润，肺泡间质增厚，经SB203580干预组间质增厚较ALI组减轻，炎性细胞浸润减少。在5 mg/kg SB203580干预组，小鼠的组织学基本恢复正常。
图2
各组小鼠肺组织病理评分
与对照组比较，#
2.2 p38 MAPK抑制剂减轻肺泡灌洗液中炎性细胞浸润及蛋白分泌
与肺组织病理变化结果一致，LPS刺激后的小鼠BALF中的细胞总数和蛋白较对照组增加（P<0.05）。SB203580干预组细胞数量和蛋白均明显减少。与对照组比较，BALF中单核细胞和中性粒细胞在ALI组明显升高。SB203580干预组总细胞数较ALI组有所下降，且随着用药浓度的增加，下降程度越明显，其中单核细胞和中性粒细胞在ALI组均有明显升高，药物干预后有所下降。结果见图3。
图3
SB203508对LPS诱导的ALI小鼠BALF中细胞数量和蛋白的影响
a. 细胞总数；b. 蛋白；c. 中性粒细胞计数；d. 巨噬细胞计数。与对照组比较，#
2.3 p38MAPK抑制剂能减轻Th17相关细胞因子的分泌，促进IL-10的表达
ALI组肺组织中IL-17、IL-23、TGF-β和IL-10细胞因子的表达较对照组均有明显的升高，SB203580干预后，血清中IL-6、TNF-α以及肺组织中IL-17、IL-23和TGF-β的表达受到抑制，其中TGF-β的表达的降低与SB203580呈浓度依赖性，IL-6、IL-23和IL-17在1 mg/kg的SB203580的浓度下抑制作用最明显。IL-10的表达呈相反趋势，SB203580干预组小鼠肺组织IL-10水平明显高于ALI组，经SB203580干预后能明显促进IL-10的表达，与浓度呈正相关。结果见图4。
图4
SB203508对LPS诱导的ALI小鼠血清及肺组织中炎性细胞因子的影响
a. 血清IL-6；b. 血清TNF-α；c. 肺组织IL-10；d. 肺组织IL-6；e. 肺组织IL-23；f. 肺组织IL-17；g. 肺组织TGF-β。与对照组比较，#
2.4 p38MAPK抑制剂可抑制Th17相关转录因子RORγt mRNA的表达，而促进Treg相关转录因子Foxp3 mRNA的表达
ALI组RORγt mRNA表达明显高于对照组，而SB203508组RORγt mRNA表达明显低于对照组。LPS也能诱导Foxp3 mRNA的表达，经SB203580干预后，小鼠肺组织中Foxp3 mRNA的表达水平进一步升高，明显高于ALI组。经SB203580干预后，转录水平RORγt/Foxp3比值降低，肺组织内更倾向于Foxp3的表达。结果见图5。
图5
SB203508对LPS诱导的ALI小鼠肺组织RORγt和Foxp3 mRNA表达的影响
a. 肺组织RORγt；b. 肺组织Foxp3；c. 肺组织RORγt与Foxp3的比值。与对照组比较，#
2.5 p38MAPK抑制剂可以纠正LPS导致的Th17/Treg细胞表达失衡
与正常小鼠比较，LPS所致的ALI小鼠脾脏淋巴细胞中Treg和Th17细胞数量均有明显增加。Th17/Treg平衡状态中倾向于Th17细胞的增多。SB203580干预后增加了Treg细胞的数量，降低了Th17细胞的比例。5 mg/kg SB203580干预组Th17/Treg比值降低，接近于对照组小鼠。结果见图6。
图6
SB203508对LPS诱导的ALI小鼠脾脏Th17和Treg细胞表达的影响
a. Th17细胞亚群流式细胞检测像；b. Treg细胞流式细胞检测像；c. Th17细胞亚群流式细胞检测结果；d. Treg细胞流式细胞检测结果；e. Th17细胞亚群与Treg细胞的比值。A. 对照组；B. ALI组；C. 0.5 mg/kg药物干预组；D. 1 mg/kg药物干预组；E. 2 mg/kg药物干预组；F. 5 mg/kg药物干预组。与对照组比较，#
3 讨论
肺内中性粒细胞等炎症细胞的浸润和炎症介质的释放是ALI的主要特征之一[12]。当肺部受到病原微生物攻击时，中性粒细胞在肺微血管、间质和支气管肺泡间隙聚集，并分泌蛋白酶，阳离子化合物和活性氧化剂等有效抗菌分子。然而，中性粒细胞的迁移及炎症过度反应也会导致肺泡腔的机械性损伤及加重肺泡腔内的渗出，从而发生ALI/ARDS[13]。本研究通过腹腔注射LPS建立ALI动物模型，LPS诱导肺组织出现炎症反应和BALF中炎症细胞及总蛋白水平的增加。SB203508干预后，LPS诱导的ALI小鼠肺泡灌洗液中各类细胞数和蛋白减少，HE染色提示肺部炎症有所减轻，提示SB203508可抑制炎症反应和炎性细胞的聚集，减轻LPS诱导的小鼠肺损伤，这种保护作用与剂量呈正相关。
LPS刺激导致的炎症反应是一个复杂的细胞因子网络，TNF-α、IL-6和其他促炎化合物的释放可引发、放大和延续炎症级联反应。IL-1β、IL-6和TNF-α被认为是ALI严重程度的预测指标[14]。研究发现车前草苷可以抑制p38MAPK信号通路的激活，减少IL-6和TNF-α等促炎性细胞因子的释放，减轻ALI小鼠的肺组织炎症反应[15]。IL-6细胞因子水平的下降，可以通过影响Th17和Treg细胞平衡减轻大鼠模型中宫内感染诱导早产儿的ARDS[16]。通过以上的研究结果推测p38MAPK信号通路的抑制使得IL-6等促炎性细胞因子分泌减少，IL-6可以通过影响Th17/Treg平衡影响ARDS的疾病进程。本研究发现经ALI小鼠体内存在IL-6细胞因子的过表达，干预组小鼠经SB203580干预后IL-6的表达明显下降，在1 mg/kg的剂量时抑制效果最明显，更多的药物浓度并没有带来更明显的IL-6水平的下降。Th17细胞的分化与IL-1、IL-6及转化生长因子相关联[17]。本研究还发现ALI组小鼠Th17细胞及相关细胞因子的表达明显升高，而干预组小鼠Th17细胞表达及相关细胞因子的分泌明显下降，这与IL-6的表达水平相一致，推测p38 MAPK信号通路被抑制后引起IL-6分泌的减少，进而减少了Th17细胞的生成。
Th17细胞在防御细胞外病原体中发挥关键作用，并参与许多自身免疫性炎症的形成。Treg细胞的主要功能是调节免疫应答的平衡，控制T细胞对病原体、严重炎症和组织破坏的适度应答。已有多项研究发现Th17和Treg细胞参与ALI/ARDS的病理过程。Yu等[18]研究发现ARDS患者外周血单核细胞中能检测到Th17细胞和相关的细胞因子IL-17的升高，ALI/ARDS的发病过程中会打破Th17细胞和Treg细胞平衡，该失衡状态进一步导致ALI/ARDS的进展。Treg细胞主要通过细胞与细胞之间的接触和分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1调节肺组织内免疫应答，对ALI/ARDS起保护作用[19]。Treg细胞的免疫调节功能通过一系列的细胞因子实现，主要有IL-10和TGF-β1，D'Alessio等[20]研究发现ALI小鼠和患者BALF中增多的Treg细胞可通过诱导TGF-β1和中性粒细胞的凋亡来减轻ALI的病理反应。既往研究发现Treg细胞分泌的IL-10是Treg细胞产生的保护性免疫调节细胞因子，IL-10可通过抑制TNF-α的产生在ALI/ARDS病理过程中起保护作用[21]，IL-10的作用被抑制将加重ARDS的病理反应[22]。本研究也发现ALI组小鼠体内IL-10表达明显升高，干预组小鼠IL-10的表达进一步升高。我们推测，抑制p38 MAPK信号通路可以通过调控如IL-10细胞因子的分泌，刺激Foxp3 mRNA的表达和Treg细胞的生成，从而发挥了对ALI的肺保护作用。TGF-β主要通过p38 MAPK和SMAD3信号通路参与炎症反应作用过程[23]。本研究也证实在抑制p38MAPK信号通路后，TGF-β的表达明显被抑制。我们的前期研究提示阻断p38 MAPK能抑制Th17细胞分泌相关细胞因子[24]。本实验结果也显示ALI小鼠中Th17和Treg细胞及其分泌的细胞因子均有升高，抑制p38 MAPK信号通路能调控Th17和Treg细胞分化过程中的关键细胞因子而调控Th17/Treg平衡，最终减轻肺组织损伤。
综上所述，LPS诱导ALI小鼠模型中，存在Th17/Treg细胞功能失衡现象。应用p38 MAPK抑制剂可抑制Th17相关转录因子RORγt mRNA的表达，进而减少IL-6、IL-23和TNF-α促炎因子的分泌，且促进Treg相关转录因子Foxp3 mRNA的表达，进而增加抑炎因子IL-10的分泌，最终在BALF炎症指标和组织病理学层面观察到ALI的减轻，且这种作用在一定范围内剂量与疗效呈正相关。因此，我们推测p38 MAPK抑制剂可能通过改变Th17/Treg失衡状态减轻LPS所致的小鼠肺损伤程度，提示p38 MAPK可能是ALI/ARDS治疗的一个潜在靶点。本研究还存在一定的局限性，首先，仅开展了小鼠动物模型实验，需要进一步通过ALI/ARDS患者血液样本及BALF样本进行验证；其次，造模使用的方法为腹腔注射LPS，仅代表革兰阴性杆菌感染所致ALI；最后，没有对p38 MAPK抑制剂调控Th17和Treg细胞的具体信号通路各环节进行研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
