引用本文： 黄硕, 胡瑞成, 谭双香, 符代炎, 甘桂香. Runt相关转录因子1调控上皮间质转化在卷烟烟雾诱导的气道上皮细胞中的作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(9): 658-664. doi: 10.7507/1671-6205.202205037 复制
上皮–间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞紧密连接和细胞极性等特性发生改变，转化为间质样细胞过程，EMT在器官纤维化、肿瘤发生、损伤修复等过程中起着至关重要的作用[1-3]。体外研究表明，正常人支气管上皮细胞接触卷烟烟雾提取物（cigarette smoking extract，CSE）会诱发EMT活性，并增加间质标记物的表达。上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）表达的丧失是EMT中的关键事件，它与细胞之间的连接相关，且涉及到与细胞极性相关的细胞骨架和细胞外基质的重塑。EMT可能是肺部多种疾病如支气管哮喘、肺纤维化以及慢性阻塞性肺疾病发生发展过程中核心病理生理因素[4-6]。
Runt相关转录因子1（Runt-related transcription factor 1，RUNX1）是1991年染色体重排中被发现，其易位和点突变可导致急性白血病的发生，基因定位于染色体21q22.3，由12个外显子构成，全长超过260 kb[7]。2001年相关研究发现Runx1蛋白在小鼠胚胎中的多个部位如肝脏、胸腺、鼻腔、食管、胃、支气管以及气道上皮等广泛表达[7-8]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是机体重要的转录因子之一，研究显示NF-κB在气道炎症疾病如慢性阻塞性肺疾病中发挥了关键作用[9]。锌指转录因子Snail能够调节EMT，在促进EMT的进程中发挥重要作用[10]。研究发现RUNX1通过调节NF-κB调控炎症反应，在急性肺损伤中RUNX1的缺失导致NF-κB信号的活化[11]，提示RUNX1是NF-κB的上游调控因子。近期研究显示NF-κB是通过增加EMT关键转录因子Snail促进EMT的发生发展[12-13]。本研究采用转染RUNX1干扰和过表达载体进行基因干预，借助免疫组织化学、蛋白印迹法（Western blot）等方法进行研究，探讨在支气管上皮细胞在卷烟烟雾刺激下RUNX1的表达情况，并探讨其对上皮间质转化的调控作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和设备
CSE、RUNX1过表达载体、RUNX1干扰载体、SD大鼠均由中洪博元分子实验室提供；抗RUNX1（ab92336，英国Abcam公司），抗NF-κB（8242T，美国CST公司），抗Snail（13099-1-ap）、抗波形蛋白（vimentin，VIM。10366-1-ap）和抗E-cad（20874-1-ap，美国Proteintech公司），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH。TA-08，中国中杉金桥）；全自动酶标仪（北京六一生物科技），离心机（长沙英泰仪器有限公司），DMEM/F-12培养基（10565018，中国赛默飞世尔科技有限公司），CCK-8法细胞增殖检测试剂盒（KGA317）和磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS。KGB5001）均由江苏凯基生物技术股份有限公司提供，微型离心机（D1008E，美国赛洛捷克公司），干式电加热器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），旋涡混合器（常州越新仪器制造有限公司），倒置荧光显微镜（广州市明美光电有限公司），低温高速离心机（5424R，德国Eppendorf公司），紫外分光光度仪（NP80，德国茵普恩公司）。
1.2 方法
1.2.1 原代细胞分离及鉴定
大鼠全身消毒3 min，无菌条件下连着肺组织将气管–支气管剪下，放入预冷的PBS中，去除肺组织和气管表面残留的脂肪和筋膜，反复灌洗干净，剪碎组织至0.5～1 mm3的小块后转移至离心管中，静置，弃上清液，加入DMEM/F-12培养基重悬，调整密度后加入到准备好的培养皿中贴壁培养。培养条件为37 ℃，5% CO2。免疫荧光鉴定分离的细胞，鉴定目的蛋白-广谱细胞角蛋白（Pan cytokeratin）（bs-1712R，Bioss）[14]。将已贴壁生长的细胞用PBS浸洗3次后用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培养皿，用0.5% Triton X-100（PBS配制）室温通透20 min，PBS浸洗培养皿后移液枪吸干PBS，在培养皿内滴加5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），37 ℃封闭30 min。移液枪吸掉封闭液，培养皿内滴加足够量的稀释好的一抗anti- Pan cytokeratin（1∶200）；4 ℃孵育过夜。浸洗培养皿3次，移液枪吸干培养皿内多余液体后滴加稀释好的荧光二抗Cy3（1∶200），37 ℃孵育45 min，PBS浸洗，滴加6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）避光孵育5 min，对标本进行核染，用PBS冲洗多余的DAPI；用50%甘油封闭培养皿，然后在荧光显微镜下观察采集图像。从加荧光二抗起，后面的操作步骤都在暗室进行。实验进行3次重复。
1.2.2 细胞处理及CCK-8检测
为了探讨在卷烟诱导下RUNX1对支气管上皮细胞EMT的影响，在体外构建CSE对支气管上皮细胞暴露模型，对照组不进行CSE处理。将细胞铺板，细胞状态良好后用1%、5%、10%、15%、20%浓度CSE处理细胞，24 h和48 h后细胞消化、重悬，计数，铺板，细胞密度为5×103个/孔，继续培养48 h后进行检测；将待测的96孔板细胞换成每孔100 μL的相同培养基，加入CCK-8试剂，每孔10 μL，然后置于培养箱中孵育2 h；每孔的吸光度（optical density，OD）通过酶标仪在450 nm波长处检测，计算细胞活力，细胞活力=（OD处理组/OD对照组）×100% 。实验进行3次重复。
1.2.3 RUNX1基因转染干扰及过表达
NCBI数据库中查找RUNX1基因序列，引入酶切位点，生物合成目的基因片段并连接到pcDNA3.1（+）载体上。质粒转化大肠杆菌DH5α，菌液扩大培养后去内毒素提取质粒，进行质粒酶切分析和电泳检测验证。将构建好的过表达载体和干扰载体用脂质体转染提取的支气管上皮细胞。造模后的细胞分为5组：CSE处理组（模型组）、干扰RUNX1对照组、干扰RUNX1组（siRNA-1/siRNA-2/siRNA-3）、过表达RUNX1对照组以及过表达RUNX1组。细胞按照实验分组铺板，细胞状态良好后进行转染。载体转染：当细胞密度达70%时，将细胞的培养基更换为不含血清的培养基，体积为1 mL。取灭菌的EP管2个，每管加125 μL Opti-MEM，其中一管加入5 μL lipofectamine3000，另一管干扰RUNX1组EP管加入12.5 μL siRNA，而过表达RUNX1组EP管加入2.5 μg质粒、5 μL P3000，混匀后室温孵育5 min将上述两个EP管混匀，室温孵育15 min。将混合液滴到六孔板中对应的孔内，将细胞放回孵箱培养；干扰组转染4 h过表达组转染6 h后在六孔板中加入血清含量为20%的完全培养基1 mL；转染48 h后进行下游聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和免疫印迹（Western blot）验证。
1.2.4 定量聚合酶链反应（quantitative PCR，qPCR）验证
用移液枪吸掉培养皿中的细胞培养液，加入Trizon 裂解液，用移液枪吹打，使贴壁细胞悬浮与裂解液充分接触，收集全部细胞悬液以提取miRNA。利用紫外可见分光光度计测定RNA的浓度和纯度（OD260/OD280）。将miRNA通过miRNA逆转录试剂盒合成micDNA。利用荧光PCR仪进行荧光定量PCR。反应体系如下：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、RNase Free ddH2O 8.2 μL。反应步骤如下：预变性95 ℃，10 min；变性95 ℃，10 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；40个循环。引物序列由通用生物系统（安徽）有限公司合成，β-肌动蛋白（β-actin）作为内参，序列见表1。RUNX1的相对表达量根据2–△△Ct法计算。实验进行3次重复。
表1
RUNX1和β-actin引物序列
1.2.5 免疫细胞化学
在培养板中将已爬好的培养皿用PBS浸洗3次，每次3 min，用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培养皿3次，每次3 min；用0.5%TritonX-100（PBS配制）室温通透20 min，将切片移入湿盒中，加入新鲜配制的3%双氧水，以去除内源性过氧化酶封闭液，室温孵育10 min，PBS充分淋洗。用PBS浸洗玻片3次，每次5 min，吸收纸吸干组织周围的PBS，在玻片上滴加5% BSA，37 ℃封闭30 min。用移液枪吸干培养皿内的封闭液，不洗，每个培养皿中滴加足够量的稀释好的一抗RUNX1（AF6379，美国艾菲公司），放入湿盒中，4 °C孵育过夜，然后进行二抗孵育，滴加辣根酶标记的山羊抗兔IgG（H+L） （ZB-2305，北京中杉金桥生物技术有限公司），37 °C下孵育30 min。最后进行显色复染。实验进行3次重复。
1.2.6 Western blot检测
用移液枪吸掉培养皿中的细胞培养液，每孔加入100 μL的细胞裂解液，置于冰上20 min。用细胞刮将细胞刮至一侧，移液枪吸入已做好标记的EP管中。12000 r/min 高速离心机离心10 min，上清液即得总蛋白。根据二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳2 h，后用300 mA恒流转膜80 min。一抗RUNX1，NF-κB、Snail、VIM、E-cad和GAPDH溶液孵育，4 ℃过夜；二抗溶液中室温孵育2 h。在膜上滴加ECL发光液，在凝胶成像系统中曝光。实验进行3次重复。用ImageJ软件分析各条带灰度值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 24.0统计软件。定量数值结果采用均数±标准差（
±s）表示。多组之间的定量数值比较采用单因素的方差分析，两两比较采用最小显著性差异法。采用Graphpad5.0软件作图，采用Imagepro J软件进行灰度值分析。检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原代大鼠支气管上皮细胞分离及鉴定
原代分离的大鼠支气管上皮细胞呈多边形，形态呈铺路石样，从免疫荧光的结果上看，支气管上皮细胞中的角蛋白表达量比较高，提示分离的细胞是纯度较高的支气管上皮细胞。结果见图1。
图1
原代大鼠支气管上皮细胞分离及鉴定
a. 原代大鼠支气管上皮细胞鉴定（×100）；b. 免疫荧光鉴定：目标蛋白呈红色荧光细胞核呈蓝色荧光（×200）。
2.2 不同的卷烟浓度对细胞活力的影响
在体外构建的CSE对支气管上皮细胞暴露模型中，24 h和48 h后各卷烟浓度组细胞活力均比对照组显著降低（P<0.05），随着CSE浓度的升高，支气管上皮细胞活力下降，结果见图2。选择使用10% CSE的浓度，处理48 h进行后续实验。
图2
不同的卷烟浓度对细胞活力的影响（n=3）
a. CSE处理24 h CCK-8 结果；b. CSE处理48 h CCK-8 结果。与对照组比较，*
2.3 qPCR和Western blot验证转染效果
qPCR和Western blot结果显示，与对照组比较，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3干扰组RUNX1表达水平均显著降低，RUNX1过表达组RUNX1表达水平显著升高，差异有统计学意义（均P<0.05），提示RUNX1转染成功。结果见图3。
图3
qPCR和Western blot验证转染效果（n=3）
a. 干扰RUNX1组mRNA表达；b. 过表达RUNX1组mRNA表达；c. 干扰RUNX1组蛋白表达；d. 过表达RUNX1组蛋白表达。与对照组比较，*
2.4 CSE诱导的原代大鼠支气管上皮细胞RUNX1蛋白的表达
与正常对照组比较，模型组中RUNX1表达水平显著升高，与干扰对照组比较，干扰RUNX1组的RUNX1表达水平显著降低，差异有统计学意义（均P<0.05）。与过表达对照组比较，过表达RUNX1组的RUNX1表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图4。
图4
CSE诱导的原代大鼠支气管上皮细胞RUNX1蛋白的表达（n=3）
a. 免疫细胞化学（×400）；b. 免疫细胞化学结果图像分析半定量结果。与对照组比较，*
2.5 RUNX1 对CSE诱导的原代大鼠支气管上皮细胞EMT的影响
Western blot结果表明，与对照组相比，CSE处理细胞后E-cad的表达显著降低（P<0.05），RUNX1、NF-κB、Snail、VIM的表达水平显著上升（均P<0.05）。这些结果显示经过CSE处理细胞后，细胞由上皮向间充质发生转化，同时伴随发生炎症反应。同时在干扰或过表达RUNX1后，E-cad的表达分别上调和下调（P<0.05），NF-κB、Snail、VIM的表达分别下调和上调（P<0.05）。结果提示RUNX1在调控EMT起到重要作用，下调RUNX1后，尽管在CSE处理细胞后，细胞由间充质向上皮发生转化。结果见图5。
图5
RUNX1对CSE诱导的原代大鼠支气管上皮细胞EMT的影响（n=3）
a. 与GAPDH归一化处理的E-cad、NF-κB、Snail、VIM、RUNX1蛋白水平；b. E-cad、NF-κB、Snail、VIM、RUNX1蛋白水平半定量结果（内参为GAPDH）。与对照组比较，*
3 讨论
RUNX1是一种重要的转录因子，参与机体肿瘤形成、炎症反应、免疫反应等[15-18]。Runx基因家族编码与DNA结合的α亚基，与核心结合因子β结合后形成异二聚体转录因子RUNX蛋白，在正常生长发育和疾病状态下RUNX蛋白既是靶基因的抑制子又是激活剂[7]。本研究在CSE诱导的大鼠支气管上皮细胞中进行观察，发现在CSE刺激下，过表达RUNX1对照组较对照组的RUNX1蛋白表达水平显著升高，干扰RUNX1组较对照组RUNX1蛋白表达水平显著降低。本实验结果在细胞水平说明CSE刺激促进了大鼠支气管上皮细胞RUNX1的表达，很可能在慢性气道炎症疾病中发挥重要作用。
我们在研究中发现，采用CSE处理原代大鼠支气管上皮细胞后，上皮细胞标志物E-cad的表达明显下降，间充质表现标志物VIM的表达明显上调，这一结果充分表明CSE会诱导细胞发生EMT。大量的调控因子及多种信号通路参与调控EMT。NF-κB是具有一种多向转录调节作用的转录因子，参与机体炎症、氧化应激、免疫等多种病理生理过程[9，19-20]。本研究组前期研究提示NF-κB是慢性气道炎症疾病如慢性阻塞性肺疾病等的发病中的重要转录因子[9]。而Snail是调控细胞EMT的关键转录因子之一[10]，能够降低上皮细胞标志E-钙黏蛋白等表达，促进间叶细胞标志物VIM等表达等，从而达到调控EMT的进程。研究显示NF-κB可以与Snail基因启动子的–194 bp及78 bp相结合，增加EMT相关转录因子Snail促进EMT的发生发展[21]。研究显示RUNX1调控炎症反应可以通过调节NF-κB来实现，在急性肺损伤中缺失RUNX1时NF-κB信号被活化，提示NF-κB的上游调控因子是RUNX1[11]。RUNX1能否调控NF-κB/Snail的表达，以及能否通过该作用调控影响EMT进程，我们进行了一系列实验研究。结果显示，CSE刺激后RUNX1、NF-κB、Snail的蛋白表达上调，在此基础上采用转染技术干扰降低RUNX1水平后，NF-κB、Snail蛋白表达水平下降，而过表达RUNX1水平后，NF-κB、Snail表达水平上升，表明RUNX1可以调控NF-κB/Snail表达。同时伴随E-cad表达升高或降低，VIM间充质表达降低或升高，从而调控EMT进程。
综上所述，CSE促进了大鼠气道上皮细胞中RUNX1的表达，RUNX1参与调控NF-κB/Snail的表达，并且可能通过该作用调节EMT进程。然而本研究仅通过细胞实验层面探索了RUNX1对CSE诱导的上皮间质转化的作用影响，下一步还需深入研究RUNX1在动物模型体内CSE诱导EMT发生过程的作用机制，以及可能的调控因素。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
上皮–间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞紧密连接和细胞极性等特性发生改变，转化为间质样细胞过程，EMT在器官纤维化、肿瘤发生、损伤修复等过程中起着至关重要的作用[1-3]。体外研究表明，正常人支气管上皮细胞接触卷烟烟雾提取物（cigarette smoking extract，CSE）会诱发EMT活性，并增加间质标记物的表达。上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）表达的丧失是EMT中的关键事件，它与细胞之间的连接相关，且涉及到与细胞极性相关的细胞骨架和细胞外基质的重塑。EMT可能是肺部多种疾病如支气管哮喘、肺纤维化以及慢性阻塞性肺疾病发生发展过程中核心病理生理因素[4-6]。
Runt相关转录因子1（Runt-related transcription factor 1，RUNX1）是1991年染色体重排中被发现，其易位和点突变可导致急性白血病的发生，基因定位于染色体21q22.3，由12个外显子构成，全长超过260 kb[7]。2001年相关研究发现Runx1蛋白在小鼠胚胎中的多个部位如肝脏、胸腺、鼻腔、食管、胃、支气管以及气道上皮等广泛表达[7-8]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是机体重要的转录因子之一，研究显示NF-κB在气道炎症疾病如慢性阻塞性肺疾病中发挥了关键作用[9]。锌指转录因子Snail能够调节EMT，在促进EMT的进程中发挥重要作用[10]。研究发现RUNX1通过调节NF-κB调控炎症反应，在急性肺损伤中RUNX1的缺失导致NF-κB信号的活化[11]，提示RUNX1是NF-κB的上游调控因子。近期研究显示NF-κB是通过增加EMT关键转录因子Snail促进EMT的发生发展[12-13]。本研究采用转染RUNX1干扰和过表达载体进行基因干预，借助免疫组织化学、蛋白印迹法（Western blot）等方法进行研究，探讨在支气管上皮细胞在卷烟烟雾刺激下RUNX1的表达情况，并探讨其对上皮间质转化的调控作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和设备
CSE、RUNX1过表达载体、RUNX1干扰载体、SD大鼠均由中洪博元分子实验室提供；抗RUNX1（ab92336，英国Abcam公司），抗NF-κB（8242T，美国CST公司），抗Snail（13099-1-ap）、抗波形蛋白（vimentin，VIM。10366-1-ap）和抗E-cad（20874-1-ap，美国Proteintech公司），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH。TA-08，中国中杉金桥）；全自动酶标仪（北京六一生物科技），离心机（长沙英泰仪器有限公司），DMEM/F-12培养基（10565018，中国赛默飞世尔科技有限公司），CCK-8法细胞增殖检测试剂盒（KGA317）和磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS。KGB5001）均由江苏凯基生物技术股份有限公司提供，微型离心机（D1008E，美国赛洛捷克公司），干式电加热器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），旋涡混合器（常州越新仪器制造有限公司），倒置荧光显微镜（广州市明美光电有限公司），低温高速离心机（5424R，德国Eppendorf公司），紫外分光光度仪（NP80，德国茵普恩公司）。
1.2 方法
1.2.1 原代细胞分离及鉴定
大鼠全身消毒3 min，无菌条件下连着肺组织将气管–支气管剪下，放入预冷的PBS中，去除肺组织和气管表面残留的脂肪和筋膜，反复灌洗干净，剪碎组织至0.5～1 mm3的小块后转移至离心管中，静置，弃上清液，加入DMEM/F-12培养基重悬，调整密度后加入到准备好的培养皿中贴壁培养。培养条件为37 ℃，5% CO2。免疫荧光鉴定分离的细胞，鉴定目的蛋白-广谱细胞角蛋白（Pan cytokeratin）（bs-1712R，Bioss）[14]。将已贴壁生长的细胞用PBS浸洗3次后用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培养皿，用0.5% Triton X-100（PBS配制）室温通透20 min，PBS浸洗培养皿后移液枪吸干PBS，在培养皿内滴加5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），37 ℃封闭30 min。移液枪吸掉封闭液，培养皿内滴加足够量的稀释好的一抗anti- Pan cytokeratin（1∶200）；4 ℃孵育过夜。浸洗培养皿3次，移液枪吸干培养皿内多余液体后滴加稀释好的荧光二抗Cy3（1∶200），37 ℃孵育45 min，PBS浸洗，滴加6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）避光孵育5 min，对标本进行核染，用PBS冲洗多余的DAPI；用50%甘油封闭培养皿，然后在荧光显微镜下观察采集图像。从加荧光二抗起，后面的操作步骤都在暗室进行。实验进行3次重复。
1.2.2 细胞处理及CCK-8检测
为了探讨在卷烟诱导下RUNX1对支气管上皮细胞EMT的影响，在体外构建CSE对支气管上皮细胞暴露模型，对照组不进行CSE处理。将细胞铺板，细胞状态良好后用1%、5%、10%、15%、20%浓度CSE处理细胞，24 h和48 h后细胞消化、重悬，计数，铺板，细胞密度为5×103个/孔，继续培养48 h后进行检测；将待测的96孔板细胞换成每孔100 μL的相同培养基，加入CCK-8试剂，每孔10 μL，然后置于培养箱中孵育2 h；每孔的吸光度（optical density，OD）通过酶标仪在450 nm波长处检测，计算细胞活力，细胞活力=（OD处理组/OD对照组）×100% 。实验进行3次重复。
1.2.3 RUNX1基因转染干扰及过表达
NCBI数据库中查找RUNX1基因序列，引入酶切位点，生物合成目的基因片段并连接到pcDNA3.1（+）载体上。质粒转化大肠杆菌DH5α，菌液扩大培养后去内毒素提取质粒，进行质粒酶切分析和电泳检测验证。将构建好的过表达载体和干扰载体用脂质体转染提取的支气管上皮细胞。造模后的细胞分为5组：CSE处理组（模型组）、干扰RUNX1对照组、干扰RUNX1组（siRNA-1/siRNA-2/siRNA-3）、过表达RUNX1对照组以及过表达RUNX1组。细胞按照实验分组铺板，细胞状态良好后进行转染。载体转染：当细胞密度达70%时，将细胞的培养基更换为不含血清的培养基，体积为1 mL。取灭菌的EP管2个，每管加125 μL Opti-MEM，其中一管加入5 μL lipofectamine3000，另一管干扰RUNX1组EP管加入12.5 μL siRNA，而过表达RUNX1组EP管加入2.5 μg质粒、5 μL P3000，混匀后室温孵育5 min将上述两个EP管混匀，室温孵育15 min。将混合液滴到六孔板中对应的孔内，将细胞放回孵箱培养；干扰组转染4 h过表达组转染6 h后在六孔板中加入血清含量为20%的完全培养基1 mL；转染48 h后进行下游聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和免疫印迹（Western blot）验证。
1.2.4 定量聚合酶链反应（quantitative PCR，qPCR）验证
用移液枪吸掉培养皿中的细胞培养液，加入Trizon 裂解液，用移液枪吹打，使贴壁细胞悬浮与裂解液充分接触，收集全部细胞悬液以提取miRNA。利用紫外可见分光光度计测定RNA的浓度和纯度（OD260/OD280）。将miRNA通过miRNA逆转录试剂盒合成micDNA。利用荧光PCR仪进行荧光定量PCR。反应体系如下：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、RNase Free ddH2O 8.2 μL。反应步骤如下：预变性95 ℃，10 min；变性95 ℃，10 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；40个循环。引物序列由通用生物系统（安徽）有限公司合成，β-肌动蛋白（β-actin）作为内参，序列见表1。RUNX1的相对表达量根据2–△△Ct法计算。实验进行3次重复。
表1
RUNX1和β-actin引物序列
1.2.5 免疫细胞化学
在培养板中将已爬好的培养皿用PBS浸洗3次，每次3 min，用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培养皿3次，每次3 min；用0.5%TritonX-100（PBS配制）室温通透20 min，将切片移入湿盒中，加入新鲜配制的3%双氧水，以去除内源性过氧化酶封闭液，室温孵育10 min，PBS充分淋洗。用PBS浸洗玻片3次，每次5 min，吸收纸吸干组织周围的PBS，在玻片上滴加5% BSA，37 ℃封闭30 min。用移液枪吸干培养皿内的封闭液，不洗，每个培养皿中滴加足够量的稀释好的一抗RUNX1（AF6379，美国艾菲公司），放入湿盒中，4 °C孵育过夜，然后进行二抗孵育，滴加辣根酶标记的山羊抗兔IgG（H+L） （ZB-2305，北京中杉金桥生物技术有限公司），37 °C下孵育30 min。最后进行显色复染。实验进行3次重复。
1.2.6 Western blot检测
用移液枪吸掉培养皿中的细胞培养液，每孔加入100 μL的细胞裂解液，置于冰上20 min。用细胞刮将细胞刮至一侧，移液枪吸入已做好标记的EP管中。12000 r/min 高速离心机离心10 min，上清液即得总蛋白。根据二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳2 h，后用300 mA恒流转膜80 min。一抗RUNX1，NF-κB、Snail、VIM、E-cad和GAPDH溶液孵育，4 ℃过夜；二抗溶液中室温孵育2 h。在膜上滴加ECL发光液，在凝胶成像系统中曝光。实验进行3次重复。用ImageJ软件分析各条带灰度值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 24.0统计软件。定量数值结果采用均数±标准差（±s）表示。多组之间的定量数值比较采用单因素的方差分析，两两比较采用最小显著性差异法。采用Graphpad5.0软件作图，采用Imagepro J软件进行灰度值分析。检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原代大鼠支气管上皮细胞分离及鉴定
原代分离的大鼠支气管上皮细胞呈多边形，形态呈铺路石样，从免疫荧光的结果上看，支气管上皮细胞中的角蛋白表达量比较高，提示分离的细胞是纯度较高的支气管上皮细胞。结果见图1。
图1
原代大鼠支气管上皮细胞分离及鉴定
a. 原代大鼠支气管上皮细胞鉴定（×100）；b. 免疫荧光鉴定：目标蛋白呈红色荧光细胞核呈蓝色荧光（×200）。
2.2 不同的卷烟浓度对细胞活力的影响
在体外构建的CSE对支气管上皮细胞暴露模型中，24 h和48 h后各卷烟浓度组细胞活力均比对照组显著降低（P<0.05），随着CSE浓度的升高，支气管上皮细胞活力下降，结果见图2。选择使用10% CSE的浓度，处理48 h进行后续实验。
图2
不同的卷烟浓度对细胞活力的影响（n=3）
a. CSE处理24 h CCK-8 结果；b. CSE处理48 h CCK-8 结果。与对照组比较，*
2.3 qPCR和Western blot验证转染效果
qPCR和Western blot结果显示，与对照组比较，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3干扰组RUNX1表达水平均显著降低，RUNX1过表达组RUNX1表达水平显著升高，差异有统计学意义（均P<0.05），提示RUNX1转染成功。结果见图3。
图3
qPCR和Western blot验证转染效果（n=3）
a. 干扰RUNX1组mRNA表达；b. 过表达RUNX1组mRNA表达；c. 干扰RUNX1组蛋白表达；d. 过表达RUNX1组蛋白表达。与对照组比较，*
2.4 CSE诱导的原代大鼠支气管上皮细胞RUNX1蛋白的表达
与正常对照组比较，模型组中RUNX1表达水平显著升高，与干扰对照组比较，干扰RUNX1组的RUNX1表达水平显著降低，差异有统计学意义（均P<0.05）。与过表达对照组比较，过表达RUNX1组的RUNX1表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图4。
图4
CSE诱导的原代大鼠支气管上皮细胞RUNX1蛋白的表达（n=3）
a. 免疫细胞化学（×400）；b. 免疫细胞化学结果图像分析半定量结果。与对照组比较，*
2.5 RUNX1 对CSE诱导的原代大鼠支气管上皮细胞EMT的影响
Western blot结果表明，与对照组相比，CSE处理细胞后E-cad的表达显著降低（P<0.05），RUNX1、NF-κB、Snail、VIM的表达水平显著上升（均P<0.05）。这些结果显示经过CSE处理细胞后，细胞由上皮向间充质发生转化，同时伴随发生炎症反应。同时在干扰或过表达RUNX1后，E-cad的表达分别上调和下调（P<0.05），NF-κB、Snail、VIM的表达分别下调和上调（P<0.05）。结果提示RUNX1在调控EMT起到重要作用，下调RUNX1后，尽管在CSE处理细胞后，细胞由间充质向上皮发生转化。结果见图5。
图5
RUNX1对CSE诱导的原代大鼠支气管上皮细胞EMT的影响（n=3）
a. 与GAPDH归一化处理的E-cad、NF-κB、Snail、VIM、RUNX1蛋白水平；b. E-cad、NF-κB、Snail、VIM、RUNX1蛋白水平半定量结果（内参为GAPDH）。与对照组比较，*
3 讨论
RUNX1是一种重要的转录因子，参与机体肿瘤形成、炎症反应、免疫反应等[15-18]。Runx基因家族编码与DNA结合的α亚基，与核心结合因子β结合后形成异二聚体转录因子RUNX蛋白，在正常生长发育和疾病状态下RUNX蛋白既是靶基因的抑制子又是激活剂[7]。本研究在CSE诱导的大鼠支气管上皮细胞中进行观察，发现在CSE刺激下，过表达RUNX1对照组较对照组的RUNX1蛋白表达水平显著升高，干扰RUNX1组较对照组RUNX1蛋白表达水平显著降低。本实验结果在细胞水平说明CSE刺激促进了大鼠支气管上皮细胞RUNX1的表达，很可能在慢性气道炎症疾病中发挥重要作用。
我们在研究中发现，采用CSE处理原代大鼠支气管上皮细胞后，上皮细胞标志物E-cad的表达明显下降，间充质表现标志物VIM的表达明显上调，这一结果充分表明CSE会诱导细胞发生EMT。大量的调控因子及多种信号通路参与调控EMT。NF-κB是具有一种多向转录调节作用的转录因子，参与机体炎症、氧化应激、免疫等多种病理生理过程[9，19-20]。本研究组前期研究提示NF-κB是慢性气道炎症疾病如慢性阻塞性肺疾病等的发病中的重要转录因子[9]。而Snail是调控细胞EMT的关键转录因子之一[10]，能够降低上皮细胞标志E-钙黏蛋白等表达，促进间叶细胞标志物VIM等表达等，从而达到调控EMT的进程。研究显示NF-κB可以与Snail基因启动子的–194 bp及78 bp相结合，增加EMT相关转录因子Snail促进EMT的发生发展[21]。研究显示RUNX1调控炎症反应可以通过调节NF-κB来实现，在急性肺损伤中缺失RUNX1时NF-κB信号被活化，提示NF-κB的上游调控因子是RUNX1[11]。RUNX1能否调控NF-κB/Snail的表达，以及能否通过该作用调控影响EMT进程，我们进行了一系列实验研究。结果显示，CSE刺激后RUNX1、NF-κB、Snail的蛋白表达上调，在此基础上采用转染技术干扰降低RUNX1水平后，NF-κB、Snail蛋白表达水平下降，而过表达RUNX1水平后，NF-κB、Snail表达水平上升，表明RUNX1可以调控NF-κB/Snail表达。同时伴随E-cad表达升高或降低，VIM间充质表达降低或升高，从而调控EMT进程。
综上所述，CSE促进了大鼠气道上皮细胞中RUNX1的表达，RUNX1参与调控NF-κB/Snail的表达，并且可能通过该作用调节EMT进程。然而本研究仅通过细胞实验层面探索了RUNX1对CSE诱导的上皮间质转化的作用影响，下一步还需深入研究RUNX1在动物模型体内CSE诱导EMT发生过程的作用机制，以及可能的调控因素。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
