引用本文： 石宝玉, 李枍恒, 阮婷, 张芩, 徐莉, 李宁. 非实时超声支气管镜联合病原宏基因组二代测序在局灶性肺部感染性疾病诊断中的应用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(10): 725-730. doi: 10.7507/1671-6205.202206047 复制
肺部感染是由各类病原体引起的气管–支气管和肺实质的感染，是呼吸科最常见的疾病，病原体以细菌、真菌和病毒最为常见[1]。根据有效可靠的病原学检查结果指导抗生素应用，对肺部感染的治疗至关重要[2-3]。支气管镜可以直视下观察病变部位并提取分泌物，降低样本的外界干扰，提高病灶阳性检测结果[4]。通常，我们主要通过术前胸部CT定位，普通可曲支气管镜下进行肺泡灌洗、刷检、活检等方式获取下呼吸道病原学标本，标本的合格率及阳性率较低。因此一些辅助技术被推广应用，如细支气管镜[5]、支气管内超声（endobronchial ultrasound，EBUS）[6]、导航支气管镜[7]、计算机断层扫描透视[7]等技术的联合应用给支气管镜检查带来更好的前景。其中，EBUS通过超声成像技术，实现了对小气道周围病变位置的精确判断，可以通过支气管镜的活检通道送入肺周围无气体或少气体病灶部位，甚至可达胸膜下，直接到达病灶内部进行扫描，精准留取下呼吸道标本，增加了病原学检查的阳性率，有助于指导抗感染治疗。
传统的病原微生物检测方法存在敏感性低、周期长、病原谱窄、易出现假阴性和假阳性，尤其是无法快速检测罕见或新发病原体等局限性。病原宏基因组二代测序（Metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS）可直接从患者感染病灶部位标本中提取核酸，实现病原体种属鉴定的高通量测序技术[8]。与传统临床的实验室检测方法相比，它可以突破不同病原体类型的局限性，无偏向性的全面覆盖数千种以上的病原体，同时鉴定细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种类型病原微生物，甚至已经死亡的病原体[9] 。mNGS技术已逐渐成为临床微生物领域的重要工具，尤其可以快速应对新发病原体的感染病威胁，同时也有望增强我们检测和追踪感染性疾病病原体的能力[10]。
本研究通过联合非实时超声支气管镜与mNGS技术建立呼吸道感染的病原诊断新方法，以期达到如下目标：（1）应用非实时超声支气管镜更加准确地采集病灶样本，提高样本中病原体的阳性率；（2）应用mNGS技术提高病原体的检出率。希望通过本研究，探索非实时超声支气管镜和mNGS技术在呼吸系统感染性疾病中的应用前景，为它们成为未来常规技术奠定基础。
1 资料与方法
1.1 临床资料
本研究为单中心前瞻性随机对照研究，本研究通过我院伦理委员会批准（K-2020-077-K01），并获得患者知情同意。选取2019年9月—2021年9月于我科住院的局灶性肺部感染性疾病患者。纳入标准：① 年龄>18周岁；② 单一局灶性肺部感染实性病灶，经验性抗感染治疗效果不佳或怀疑特殊病原体感染，常规方法获得的呼吸道标本无法明确病原体；③ 抗感染治疗后病情无好转，需与其他疾病相鉴别。排除标准：① 弥漫性肺部感染；② 严重通气功能障碍；③ 近期发生急性冠脉综合征，未控制的高血压或恶性心律失常；④ 主动脉瘤和食管静脉曲张有破裂风险；⑤ 不能纠正的出血倾向，或出血高风险；⑥ 多发肺大泡有破裂风险；⑦ 病情危重或患者不能配合。所有患者首先完成一般资料采集，完善血常规、肝肾功能、红细胞沉降率、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原、凝血功能、血气分析等常规检查。将符合以上标准的患者根据随机数表法将患者按照1∶1的比例随机分为试验组和对照组。
1.2 方法
1.2.1 样本提取
试验组患者采用术前胸部CT联合非实时超声支气管镜定位技术采集肺泡灌洗液，对照组采用术前胸部CT定位技术采集肺泡灌洗液。生命体征平稳、一般情况良好的患者采用咪达唑仑静脉镇静，提高患者配合度，增加灌洗液回收率。术中全程进行血压、心率、脉氧监测。对所有肺段进行检查后，对照组根据术前CT定位行肺泡灌洗、刷检；试验组根据术前CT定位，进行超声支气管镜检查（图1），探及异常回声的肺段进行肺泡灌洗、刷检。在灌洗肺段经活检孔注入利多卡因1～2 mL进行局部麻醉，支气管镜嵌顿在目标支气管开口，经操作孔道快速注入生理盐水20～40 mL，以低于100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）负压吸引采集支气管肺泡灌洗液，根据支气管腔塌陷情况调整。标本送检普通培养、真菌半乳甘露聚糖抗原（galactomannan antigen，GM）试验、结核分枝杆菌检测及利福平耐药试验（Xpert MTB/RIF）及mNGS检测。
图1
左下叶背段局灶性实变及超声支气管镜图像
1.2.2 结果判读
肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF阳性诊断结核分枝杆菌感染，真菌GM试验阳性诊断侵袭性肺曲霉病，细菌真菌培养及mNGS检测结果，结合患者症状、体征、检验、影像学表现、免疫水平及治疗反应综合分析。
1.2.3 分析指标
分析指标包括肺泡灌洗液普通培养阳性率、真菌GM试验阳性率、Xpert MTB/RIF阳性率及mNGS检测的阳性率以及平均住院时间和平均住院费用。
1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件。正态分布计量资料以均数±标准差（
±s）表示，组间比较采用用t检验，计数资料的组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患者一般资料
本研究共纳入96例，男54例，女42例，平均年龄（60.04±15.43）岁。试验组与对照组均为48例。两组患者的性别、年龄、病灶大小、血白细胞计数、中性粒细胞百分比、CRP水平、抗生素使用情况均相似，差异无统计学意义，具有可比性（P>0.05）。结果见表1。
表1
两组患者一般情况［例/（
）］
2.2 两组患者灌洗部位
试验组于右上肺灌洗12例，右中肺灌洗6例，右下肺灌洗11例，左上肺灌洗10例，左下肺灌洗9例；对照组于右上肺灌洗9例，右中肺灌洗7例，右下肺灌洗15例，左上肺灌洗7例，左下肺灌洗10例，两组灌洗部位分布比较，差异无统计学意义（χ2=1.703，P=0.79）。结果见表2。综合分析，右肺肺炎（59例）发生率高于左肺（38例），各叶发生率依次为右下叶（26例）>右上叶（21例）>左下叶（19例）>左上叶（17例）>右中叶（13例）。
表2
两组患者灌洗部位对比（例）
2.3 不同定位技术下肺泡灌洗液病原体检测阳性率比较
与对照组相比，试验组肺泡灌洗液普通培养阳性率（39.58%比16.67%，P=0.013），mNGS检测阳性率（89.58%比72.92%，P=0.036）更高，差异有统计学意义。两组患者肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF阳性率相似（4.17%比2.08%，P=1），真菌GM试验阳性率相似（6.25%比4.17%，P=0.765），差异无统计学意义。结果见表3。试验组mNGS检测发现细菌31例，结核分枝杆菌5例，真菌4例，病毒2例，支原体3例；对照组mNGS检测发现细菌28例，结核分枝杆菌3例，真菌3例，病毒0例，支原体3例；两组患者mNGS检测的病原体分布相似，差异无统计学意义（χ2=2.034，P=0.729）。
表3
两组患者病原学检测对比（例）
2.4 不同的病原体检测方法阳性率比较
两组患者综合分析，与普通培养相比（27/96，28.13%），mNGS检测细菌的阳性率更高（59/96，61.46%），差异有统计学意义（P<0.001）；与Xpert MTB/RIF相比（3/96，3.13%），mNGS检测结核分枝杆菌的阳性率相似（8/96，8.33%），差异无统计学意义（P=0.21）；与真菌GM试验相比（5/96，5.21%），mNGS检出曲霉菌的阳性率相似（7/96，7.29%），差异无统计学意义（P=0.77）。综合两组患者普通培养、Xpert MTB/RIF、真菌GM试验的结果，总阳性率为36.46%，mNGS检测阳性率为81.25%，mNGS检测的阳性率更高，差异有统计学意义（P<0.001）。结果见表4。
表4
mNGS与传统检测对不同病原体检出率比较（例）
2.5 不同感染部位病原体检测阳性率比较
试验组肺泡灌洗液mNGS检测阳性率为89.58%，不同部位依次为左上叶100.00%=左下叶100.00%>右中叶83.33%＝右上叶83.33%>右下叶81.82%，各部位肺泡灌洗液mNGS检测阳性率差异无统计学意义（P=0.435）。对照组肺泡灌洗液mNGS检测阳性率为72.92%，不同部位依次为左下叶90.00%>右下叶80.00%=右上叶80.00%>左上叶71.43%=右中叶71.43%，各部位肺泡灌洗液mNGS检测阳性率差异无统计学意义（P=0.260）。对比两组患者相同部位肺泡灌洗液mNGS检测阳性率，差异无统计学意义。结果见表5。
表5
两组患者不同感染部位肺泡灌洗液mNGS检测阳性率比较
2.6 病原体分析
对照组病原mNGS结果显示35例患者为阳性，13例为阴性。35例阳性患者中29例检测出1种病原体，6例检测出2种病原体；其中脓肿分枝杆菌7例，肺炎克雷伯菌6例，金黄色葡萄球菌5例，溶血葡萄球菌4例，军团菌、肺炎支原体、结核分枝杆菌各3例，白色念珠菌、嗜麦芽窄食单胞菌、副流感嗜血杆菌、无乳链球菌各2例，热带念珠菌、鸟分枝杆菌各1例。
试验组病原mNGS结果显示43例患者为阳性，5例为阴性。43例阳性患者中41例检测出1种病原体，2例检测出2种病原体；其中脓肿分枝杆菌9例，结核分枝杆菌5例，肺炎克雷伯菌4例，铜绿假单胞菌、肺炎支原体、白色念珠菌各3例，嗜麦芽窄食单胞菌、人类疱疹病毒、轻型链球菌、奇异变形杆菌、流感嗜血杆菌、化脓拟杆菌、奴卡氏菌各2例，洛氏普雷沃菌、副流感嗜血杆菌、烟曲霉菌、中间普雷沃菌各1例。结果见图2。
图2
两组患者病原体分布图
a. 对照组，检出病原体13种，共41株；b. 试验组，检出病原体17种，共45株。
2.7 平均住院时间及住院费用
与对照组相比，试验组的平均住院时间更短，平均住院费用更低，差异均有统计学意义（P<0.001）。结果见表1。
3 讨论
本研究采用非实时超声支气管镜联合mNGS检测，对局灶性肺部感染患者进行病灶样本采集，然后进行普通培养、Xpert MTB/RIF、真菌GM试验，mNGS检测等检查，结果发现：1）右肺肺炎发生率高于左肺，可能和支气管解剖结构有关；2）与对照组相比，试验组样本各检测方法的阳性率更高，mNGS检测出的病原体种类更多，可见非实时超声支气管镜可提高病灶样本的阳性率；3）与普通培养相比，mNGS检测的病原学检出率更高，可见mNGS检测可提高细菌的检出率；4）与Xpert MTB/RIF、真菌GM试验相比，mNGS检测的检出率更高，但差异无统计学意义，这可能是由于本研究样本量相对较少导致的；5）与对照组相比，试验组可以降低平均住院时间和住院费用，可见非实时超声支气管镜联合mNGS检测有助于局灶性肺部感染的诊治，值得推广。
难治性肺部感染，包括结核分枝杆菌在内的多种罕见或难以取样、培养的病原体，采用普通采样培养的方式，往往存在较高的漏诊率。其病变不仅仅局限于支气管黏膜层，治疗不及时，可扩散至黏膜下、肌层、软骨、黏膜外。因此，经支气管镜检是主要的诊断手段之一，但其漏诊率及误诊率仍较高[11]。EBUS技术可通过支气管工作通道将超声探头送入气管–支气管内，进行横断面环形360°扫描，从而获取清晰的黏膜层、黏膜下层、软骨层及气道外临近的组织图像，已广泛应用于肿瘤、感染等疾病的诊治中，有利于肺部病灶的定位及诊断[12]。Chen等[13]采用EBUS辅助周围型肺部疾病的活检诊断，发现EBUS可以发现大部分周围型肺部病灶，疾病涵盖肿瘤性疾病与非肿瘤性疾病，包括肺部脓肿及局灶性肺炎等疾病。Abdelghani等[14]证明采用EBUS定位选择肺组织活检部位，可以提高诊断率，其中包括肺部感染性疾病的诊断。Li等[15]采用EBUS技术对周围型肺部感染性病灶进行诊断，发现可以提高标本阳性率，病原体包括细菌、真菌、病毒、结核分枝杆菌、非典型病原体。而我们的研究也证实，与对照组相比，非实时超声支气管镜可提高局灶性肺部感染的标本阳性率。
由于难治性肺部感染的病原体十分复杂，包括细菌、病毒、真菌及寄生虫等，然而目前的临床工作中，对病原体的诊断主要还是依赖自19世纪开展的培养、染色镜检等传统检测方法，以及后续发展的核酸扩增检测分子免疫学检查等手段，存在着样本处理过程复杂、花费时间长、可检测病原体种类少等缺点，不利于病原学诊断、病情评估及治疗方案制定[16]。包括肺部感染在内，目前仍有约60%的感染性疾病的病原体是诊断不明的[17]。mNGS主要是通过以二代测序为代表的高通量测序技术，对临床来源的标本进行宏基因组学分析，以获取病原体的物种分类、血清型、耐药性及毒力等一系列生物信息[18]，具有无偏移、全覆盖、高效率等优势。《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南（2018年版）》[19]也指出mNGS能明显提高病原体诊断的敏感性，部分病原体检测花费的时间更短，尤其对罕见病原体的诊断具有优势，可审慎地应用于临床实践之中。正是得益于测序技术的不断进步与发展，mNGS已广泛应用于临床病原体的诊断，且其正变得更加全面、廉价、高效及准确[20, 21]。Li等[15]采用病原mNGS技术对周围型肺部感染性病灶进行诊断，发现其可提高病原体的检出率。Chao等[22]采用病原mNGS技术对急性下呼吸道感染性疾病进行诊断，发现其具有准确率高、敏感性强、病原体覆盖广的优点。Wang等[23]采用病原mNGS技术提高了肺部放线菌感染的诊断。Chen等[24]采用病原mNGS技术提高了肺部荚膜组织胞浆菌的诊断。我们的研究也得出与传统病原学检测方法相比，病原mNGS的病原学检出率更高，病原体种类更多，可见病原mNGS可提高病原体的检出率，对于一些特殊病原体，尤其有效。
综上所述，在术前 CT 定位的基础上，联合非实时超声支气管镜定位，可提高肺泡灌洗液的阳性率。与普通培养、Xpert MTB/RIF、真菌 GM 试验相比，病原mNGS的病原体检出率更高，种类更多。因此非实时超声支气管镜联合病原mNGS可提高局灶性肺部感染性疾病的诊断率，减少住院时间和住院费用，值得在临床中推广应用。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
肺部感染是由各类病原体引起的气管–支气管和肺实质的感染，是呼吸科最常见的疾病，病原体以细菌、真菌和病毒最为常见[1]。根据有效可靠的病原学检查结果指导抗生素应用，对肺部感染的治疗至关重要[2-3]。支气管镜可以直视下观察病变部位并提取分泌物，降低样本的外界干扰，提高病灶阳性检测结果[4]。通常，我们主要通过术前胸部CT定位，普通可曲支气管镜下进行肺泡灌洗、刷检、活检等方式获取下呼吸道病原学标本，标本的合格率及阳性率较低。因此一些辅助技术被推广应用，如细支气管镜[5]、支气管内超声（endobronchial ultrasound，EBUS）[6]、导航支气管镜[7]、计算机断层扫描透视[7]等技术的联合应用给支气管镜检查带来更好的前景。其中，EBUS通过超声成像技术，实现了对小气道周围病变位置的精确判断，可以通过支气管镜的活检通道送入肺周围无气体或少气体病灶部位，甚至可达胸膜下，直接到达病灶内部进行扫描，精准留取下呼吸道标本，增加了病原学检查的阳性率，有助于指导抗感染治疗。
传统的病原微生物检测方法存在敏感性低、周期长、病原谱窄、易出现假阴性和假阳性，尤其是无法快速检测罕见或新发病原体等局限性。病原宏基因组二代测序（Metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS）可直接从患者感染病灶部位标本中提取核酸，实现病原体种属鉴定的高通量测序技术[8]。与传统临床的实验室检测方法相比，它可以突破不同病原体类型的局限性，无偏向性的全面覆盖数千种以上的病原体，同时鉴定细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种类型病原微生物，甚至已经死亡的病原体[9] 。mNGS技术已逐渐成为临床微生物领域的重要工具，尤其可以快速应对新发病原体的感染病威胁，同时也有望增强我们检测和追踪感染性疾病病原体的能力[10]。
本研究通过联合非实时超声支气管镜与mNGS技术建立呼吸道感染的病原诊断新方法，以期达到如下目标：（1）应用非实时超声支气管镜更加准确地采集病灶样本，提高样本中病原体的阳性率；（2）应用mNGS技术提高病原体的检出率。希望通过本研究，探索非实时超声支气管镜和mNGS技术在呼吸系统感染性疾病中的应用前景，为它们成为未来常规技术奠定基础。
1 资料与方法
1.1 临床资料
本研究为单中心前瞻性随机对照研究，本研究通过我院伦理委员会批准（K-2020-077-K01），并获得患者知情同意。选取2019年9月—2021年9月于我科住院的局灶性肺部感染性疾病患者。纳入标准：① 年龄>18周岁；② 单一局灶性肺部感染实性病灶，经验性抗感染治疗效果不佳或怀疑特殊病原体感染，常规方法获得的呼吸道标本无法明确病原体；③ 抗感染治疗后病情无好转，需与其他疾病相鉴别。排除标准：① 弥漫性肺部感染；② 严重通气功能障碍；③ 近期发生急性冠脉综合征，未控制的高血压或恶性心律失常；④ 主动脉瘤和食管静脉曲张有破裂风险；⑤ 不能纠正的出血倾向，或出血高风险；⑥ 多发肺大泡有破裂风险；⑦ 病情危重或患者不能配合。所有患者首先完成一般资料采集，完善血常规、肝肾功能、红细胞沉降率、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原、凝血功能、血气分析等常规检查。将符合以上标准的患者根据随机数表法将患者按照1∶1的比例随机分为试验组和对照组。
1.2 方法
1.2.1 样本提取
试验组患者采用术前胸部CT联合非实时超声支气管镜定位技术采集肺泡灌洗液，对照组采用术前胸部CT定位技术采集肺泡灌洗液。生命体征平稳、一般情况良好的患者采用咪达唑仑静脉镇静，提高患者配合度，增加灌洗液回收率。术中全程进行血压、心率、脉氧监测。对所有肺段进行检查后，对照组根据术前CT定位行肺泡灌洗、刷检；试验组根据术前CT定位，进行超声支气管镜检查（图1），探及异常回声的肺段进行肺泡灌洗、刷检。在灌洗肺段经活检孔注入利多卡因1～2 mL进行局部麻醉，支气管镜嵌顿在目标支气管开口，经操作孔道快速注入生理盐水20～40 mL，以低于100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）负压吸引采集支气管肺泡灌洗液，根据支气管腔塌陷情况调整。标本送检普通培养、真菌半乳甘露聚糖抗原（galactomannan antigen，GM）试验、结核分枝杆菌检测及利福平耐药试验（Xpert MTB/RIF）及mNGS检测。
图1
左下叶背段局灶性实变及超声支气管镜图像
1.2.2 结果判读
肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF阳性诊断结核分枝杆菌感染，真菌GM试验阳性诊断侵袭性肺曲霉病，细菌真菌培养及mNGS检测结果，结合患者症状、体征、检验、影像学表现、免疫水平及治疗反应综合分析。
1.2.3 分析指标
分析指标包括肺泡灌洗液普通培养阳性率、真菌GM试验阳性率、Xpert MTB/RIF阳性率及mNGS检测的阳性率以及平均住院时间和平均住院费用。
1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件。正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用用t检验，计数资料的组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患者一般资料
本研究共纳入96例，男54例，女42例，平均年龄（60.04±15.43）岁。试验组与对照组均为48例。两组患者的性别、年龄、病灶大小、血白细胞计数、中性粒细胞百分比、CRP水平、抗生素使用情况均相似，差异无统计学意义，具有可比性（P>0.05）。结果见表1。
表1
两组患者一般情况［例/（）］
2.2 两组患者灌洗部位
试验组于右上肺灌洗12例，右中肺灌洗6例，右下肺灌洗11例，左上肺灌洗10例，左下肺灌洗9例；对照组于右上肺灌洗9例，右中肺灌洗7例，右下肺灌洗15例，左上肺灌洗7例，左下肺灌洗10例，两组灌洗部位分布比较，差异无统计学意义（χ2=1.703，P=0.79）。结果见表2。综合分析，右肺肺炎（59例）发生率高于左肺（38例），各叶发生率依次为右下叶（26例）>右上叶（21例）>左下叶（19例）>左上叶（17例）>右中叶（13例）。
表2
两组患者灌洗部位对比（例）
2.3 不同定位技术下肺泡灌洗液病原体检测阳性率比较
与对照组相比，试验组肺泡灌洗液普通培养阳性率（39.58%比16.67%，P=0.013），mNGS检测阳性率（89.58%比72.92%，P=0.036）更高，差异有统计学意义。两组患者肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF阳性率相似（4.17%比2.08%，P=1），真菌GM试验阳性率相似（6.25%比4.17%，P=0.765），差异无统计学意义。结果见表3。试验组mNGS检测发现细菌31例，结核分枝杆菌5例，真菌4例，病毒2例，支原体3例；对照组mNGS检测发现细菌28例，结核分枝杆菌3例，真菌3例，病毒0例，支原体3例；两组患者mNGS检测的病原体分布相似，差异无统计学意义（χ2=2.034，P=0.729）。
表3
两组患者病原学检测对比（例）
2.4 不同的病原体检测方法阳性率比较
两组患者综合分析，与普通培养相比（27/96，28.13%），mNGS检测细菌的阳性率更高（59/96，61.46%），差异有统计学意义（P<0.001）；与Xpert MTB/RIF相比（3/96，3.13%），mNGS检测结核分枝杆菌的阳性率相似（8/96，8.33%），差异无统计学意义（P=0.21）；与真菌GM试验相比（5/96，5.21%），mNGS检出曲霉菌的阳性率相似（7/96，7.29%），差异无统计学意义（P=0.77）。综合两组患者普通培养、Xpert MTB/RIF、真菌GM试验的结果，总阳性率为36.46%，mNGS检测阳性率为81.25%，mNGS检测的阳性率更高，差异有统计学意义（P<0.001）。结果见表4。
表4
mNGS与传统检测对不同病原体检出率比较（例）
2.5 不同感染部位病原体检测阳性率比较
试验组肺泡灌洗液mNGS检测阳性率为89.58%，不同部位依次为左上叶100.00%=左下叶100.00%>右中叶83.33%＝右上叶83.33%>右下叶81.82%，各部位肺泡灌洗液mNGS检测阳性率差异无统计学意义（P=0.435）。对照组肺泡灌洗液mNGS检测阳性率为72.92%，不同部位依次为左下叶90.00%>右下叶80.00%=右上叶80.00%>左上叶71.43%=右中叶71.43%，各部位肺泡灌洗液mNGS检测阳性率差异无统计学意义（P=0.260）。对比两组患者相同部位肺泡灌洗液mNGS检测阳性率，差异无统计学意义。结果见表5。
表5
两组患者不同感染部位肺泡灌洗液mNGS检测阳性率比较
2.6 病原体分析
对照组病原mNGS结果显示35例患者为阳性，13例为阴性。35例阳性患者中29例检测出1种病原体，6例检测出2种病原体；其中脓肿分枝杆菌7例，肺炎克雷伯菌6例，金黄色葡萄球菌5例，溶血葡萄球菌4例，军团菌、肺炎支原体、结核分枝杆菌各3例，白色念珠菌、嗜麦芽窄食单胞菌、副流感嗜血杆菌、无乳链球菌各2例，热带念珠菌、鸟分枝杆菌各1例。
试验组病原mNGS结果显示43例患者为阳性，5例为阴性。43例阳性患者中41例检测出1种病原体，2例检测出2种病原体；其中脓肿分枝杆菌9例，结核分枝杆菌5例，肺炎克雷伯菌4例，铜绿假单胞菌、肺炎支原体、白色念珠菌各3例，嗜麦芽窄食单胞菌、人类疱疹病毒、轻型链球菌、奇异变形杆菌、流感嗜血杆菌、化脓拟杆菌、奴卡氏菌各2例，洛氏普雷沃菌、副流感嗜血杆菌、烟曲霉菌、中间普雷沃菌各1例。结果见图2。
图2
两组患者病原体分布图
a. 对照组，检出病原体13种，共41株；b. 试验组，检出病原体17种，共45株。
2.7 平均住院时间及住院费用
与对照组相比，试验组的平均住院时间更短，平均住院费用更低，差异均有统计学意义（P<0.001）。结果见表1。
3 讨论
本研究采用非实时超声支气管镜联合mNGS检测，对局灶性肺部感染患者进行病灶样本采集，然后进行普通培养、Xpert MTB/RIF、真菌GM试验，mNGS检测等检查，结果发现：1）右肺肺炎发生率高于左肺，可能和支气管解剖结构有关；2）与对照组相比，试验组样本各检测方法的阳性率更高，mNGS检测出的病原体种类更多，可见非实时超声支气管镜可提高病灶样本的阳性率；3）与普通培养相比，mNGS检测的病原学检出率更高，可见mNGS检测可提高细菌的检出率；4）与Xpert MTB/RIF、真菌GM试验相比，mNGS检测的检出率更高，但差异无统计学意义，这可能是由于本研究样本量相对较少导致的；5）与对照组相比，试验组可以降低平均住院时间和住院费用，可见非实时超声支气管镜联合mNGS检测有助于局灶性肺部感染的诊治，值得推广。
难治性肺部感染，包括结核分枝杆菌在内的多种罕见或难以取样、培养的病原体，采用普通采样培养的方式，往往存在较高的漏诊率。其病变不仅仅局限于支气管黏膜层，治疗不及时，可扩散至黏膜下、肌层、软骨、黏膜外。因此，经支气管镜检是主要的诊断手段之一，但其漏诊率及误诊率仍较高[11]。EBUS技术可通过支气管工作通道将超声探头送入气管–支气管内，进行横断面环形360°扫描，从而获取清晰的黏膜层、黏膜下层、软骨层及气道外临近的组织图像，已广泛应用于肿瘤、感染等疾病的诊治中，有利于肺部病灶的定位及诊断[12]。Chen等[13]采用EBUS辅助周围型肺部疾病的活检诊断，发现EBUS可以发现大部分周围型肺部病灶，疾病涵盖肿瘤性疾病与非肿瘤性疾病，包括肺部脓肿及局灶性肺炎等疾病。Abdelghani等[14]证明采用EBUS定位选择肺组织活检部位，可以提高诊断率，其中包括肺部感染性疾病的诊断。Li等[15]采用EBUS技术对周围型肺部感染性病灶进行诊断，发现可以提高标本阳性率，病原体包括细菌、真菌、病毒、结核分枝杆菌、非典型病原体。而我们的研究也证实，与对照组相比，非实时超声支气管镜可提高局灶性肺部感染的标本阳性率。
由于难治性肺部感染的病原体十分复杂，包括细菌、病毒、真菌及寄生虫等，然而目前的临床工作中，对病原体的诊断主要还是依赖自19世纪开展的培养、染色镜检等传统检测方法，以及后续发展的核酸扩增检测分子免疫学检查等手段，存在着样本处理过程复杂、花费时间长、可检测病原体种类少等缺点，不利于病原学诊断、病情评估及治疗方案制定[16]。包括肺部感染在内，目前仍有约60%的感染性疾病的病原体是诊断不明的[17]。mNGS主要是通过以二代测序为代表的高通量测序技术，对临床来源的标本进行宏基因组学分析，以获取病原体的物种分类、血清型、耐药性及毒力等一系列生物信息[18]，具有无偏移、全覆盖、高效率等优势。《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南（2018年版）》[19]也指出mNGS能明显提高病原体诊断的敏感性，部分病原体检测花费的时间更短，尤其对罕见病原体的诊断具有优势，可审慎地应用于临床实践之中。正是得益于测序技术的不断进步与发展，mNGS已广泛应用于临床病原体的诊断，且其正变得更加全面、廉价、高效及准确[20, 21]。Li等[15]采用病原mNGS技术对周围型肺部感染性病灶进行诊断，发现其可提高病原体的检出率。Chao等[22]采用病原mNGS技术对急性下呼吸道感染性疾病进行诊断，发现其具有准确率高、敏感性强、病原体覆盖广的优点。Wang等[23]采用病原mNGS技术提高了肺部放线菌感染的诊断。Chen等[24]采用病原mNGS技术提高了肺部荚膜组织胞浆菌的诊断。我们的研究也得出与传统病原学检测方法相比，病原mNGS的病原学检出率更高，病原体种类更多，可见病原mNGS可提高病原体的检出率，对于一些特殊病原体，尤其有效。
综上所述，在术前 CT 定位的基础上，联合非实时超声支气管镜定位，可提高肺泡灌洗液的阳性率。与普通培养、Xpert MTB/RIF、真菌 GM 试验相比，病原mNGS的病原体检出率更高，种类更多。因此非实时超声支气管镜联合病原mNGS可提高局灶性肺部感染性疾病的诊断率，减少住院时间和住院费用，值得在临床中推广应用。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
