引用本文： 贺彬婵, 徐小勇, 闵海燕, 苏欣. miR-22-3p对人肺微血管内皮细胞HMGB1/NLRP3信号通路的调控作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(12): 878-884. doi: 10.7507/1671-6205.202206057 复制
急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床危重症，一旦患病，病死率高达20%～50%[1]。最近研究认为肺血管内皮细胞是ARDS炎症风暴中心[2]。高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是一种非组蛋白，之前认为其仅起到增强转录的作用[2-3]，目前发现在ARDS中HMGB1可由活化的免疫细胞释放，在ARDS的发病机制中扮演着重要的角色[4]。在ARDS患者中外周血HMGB1水平升高[5-6]，血浆HMGB1水平被证明与疾病的严重程度、生存率和病死率相关[7-8]。动物实验发现小鼠气管滴注HMGB1会直接导致ARDS[9]。在脂多糖（lipopoly-saccharide，LPS）诱导的小鼠ARDS模型中，给与HMGB1中和抗体或通过抑制HMGB1可显著减轻ARDS的严重程度[10]。以上研究说明HMGB1可能作为一种关键促炎因子参与ARDS的病理过程。
Nod样受体蛋白3（nucleotide binding oligomerization segment like receptor family 3，NLRP3）炎症小体是由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）前体、胞浆PRRs蛋白质家族NOD样受体NLRP3蛋白和细胞质DNA传感器AIM2组成的多蛋白复合体。NLRP3炎症小体的活化会导致下游炎症因子的释放，在ARDS的发生发展中发挥着重要作用[11]，也是近年来研究的热点。NLRP3炎症小体的活化将无活性的Caspase-1的前体激活成为有活性的Caspase-1（cleaved-caspase-1），切割白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18的前体，使之成熟释放，从而发挥相应的生物学功能[12]。因此，cleaved-caspase-1是判断NLRP3炎症小体活化的标准之一。研究显示，特异性抑制NLRP3炎症小体的活化可显著抑制中性粒细胞的聚集和炎症因子的产生，从而减轻肺损伤[13]。
微RNA（microRNA，miRNA）是长约22个核苷酸的非编码小RNA，miRNA通过其种子序列（5′端第2～8位核苷酸）识别其靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）3′非翻译区（3′UTR）上的结合位点，起到抑制翻译、切割或降解mRNA的作用，是基因表达过程的负性调控因子[14]。在ARDS中，外周血中HMGB1显著升高[15]，NLRP3炎症小体显著活化[16-17]。本研究旨在探究在ARDS中能同时靶向HMGB1和NLRP3的miRNA，在人肺微血管内皮细胞（human pulmonary microvascular endothelial cell，HPMEC）中干预miRNA的表达，验证其对ARDS炎症反应的作用。
1 材料与方法
1.1 ARDS患者血浆收集
选择东部战区总医院2019年1月—6月重症医学科（intensive care unit，ICU）住院治疗的由于腹腔感染导致的ARDS患者，确诊后立即收集患者外周血。另外，在东部战区总医院体检中心选择年龄相匹配的健康志愿者作为对照组。通过体检结果及询问病史查体，所有健康志愿者都没有基础疾病史，没有肺部不适症状和体征，经胸部X线检查未发现肺部异常。ARDS患者入选标准：ARDS诊断符合2012年的柏林定义；在血浆收集前24 h内入住ICU的患者；ARDS由腹腔感染引起。腹腔感染的诊断标准：有腹腔感染相关的临床表现，如发热、转移性右下腹痛、麦氏点压痛、Murphy征阳性、停止排气排便、腹部压痛、反跳痛及肌紧张等；实验室检查结果：白细胞计数、中性粒细胞百分比、C反应蛋白及降钙素原增高等；超声和CT提示腹腔感染；腹腔积液培养提示细菌感染。排除标准：年龄<18岁；妊娠期；免疫功能缺陷患者，包括有干细胞移植史的患者和使用免疫抑制剂的患者；恶性肿瘤患者；预计住院时间<48 h。研究方案符合医学伦理学标准，经东部战区总医院伦理委员会同意实施。健康志愿者及患者家属均签署知情同意书。所有参与者留取外周静脉血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，3000 r/min离心15 min，留取上层血浆至EP管中，–80 ℃保存备用。
1.2 miRNA芯片分析
利用TRIzol和miRNeasy mini kit（QIAGEN）提取血浆总RNA，NanoDrop-2000超微量分光光度计鉴定RNA的纯度和质量。根据标准流程进行样品标记（Flash Tag Biotin HSR RNA Labeling Kit，Affymetrix）、微阵列杂交（GeneChip2 Hybridization Oven 640，Affymetrix）、洗涤（GeneChip2 Fluidics Station 450）和扫描（GeneChip2 Scanner 3000 7G，Affymetrix）。信号强度值采用Affymetrix Expression Console™软件（版本1.3.1）进行评估，并将实验结果分析运算，将样本表达数据归一化。
1.3 主要实验材料
LPS（美国Sigma公司），脂质体转染试剂（美国Invitrogen公司），miRNA模拟物、miRNA抑制剂（广州锐博公司），Trizol（美国Ambion公司），实时荧光定量聚合酶链反应（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCT）试剂盒（日本TAKARA公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天公司），β-肌动蛋白（β-actin）一抗（南京巴傲得公司），HMGB1、NLRP3、Caspase-1一抗（美国Abcam公司）。
1.4 细胞培养
HPMEC原代细胞、ECM培养基、胎牛血清、内皮细胞生长因子、双抗（以上均购买自美国ScienCell公司）。用含5%胎牛血清，1%内皮细胞生长因子，1%双抗的ECM培养基培养，培养条件为37 ℃、5% CO2、常规湿度，选用第4～6代快速生长期细胞进行实验。
1.5 实验分组及细胞处理
（1）空白组：HPMEC用LPS刺激；（2）miR-22-3p模拟物阴性对照组：HPMEC转染miR-22-3p模拟物阴性对照后用LPS刺激；（3）miR-22-3p模拟物组：HPMEC转染miR-22-3p模拟物后用LPS刺激；（4）miR-22-3p抑制剂阴性对照组：HPMEC转染miR-22-3p抑制剂阴性对照后用LPS刺激；（5）miR-22-3p抑制剂组：转染miR-22-3p抑制剂后用LPS刺激。约1×106个HPMEC接种于6孔板中，至70%～80%左右的细胞密度。用125 μL Opti-MEM稀释Lipofectamin®3000，温和混匀并恒温孵育5 min，用125 μL Opti-MEM分别稀释10 μL miR-22-3p模拟物、miR-22-3p抑制剂及其阴性对照，温和混匀并恒温孵育5 min。将两者温和混匀，室温孵育20 min，后将混合液加入到各孔中，置于培养箱中培养24～48 h。在每孔中加入终浓度为10 μg/mL LPS进行刺激，放入恒温箱培养6 h。
1.6 RT-qPCR实验
收集细胞，Trizol提取总RNA，按照TAKARA逆转录试剂盒说明书合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），并以cDNA作为模板进行RT-qPCR。反应在viia7 PCR System上操作（美国ABI公司），反应体系：cDNA 1 μL，SYBR Green 5 μL，前后引物（10 μmol/L）各0.2 μL，Dnase-Free ddH2O 3.6 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，随后95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共40个循环。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，HMGB1、NLRP3、IL-6、IL-8、IL-1β的相对表达量以2–ΔΔCt方法计算。引物序列如下：HMGB1上游5′-GCTCCATAGAGACAGCGCCGGG-3′，下游5′-CCTCAGCGAGGCACAGAGTCGC-3′；NLRP3上游5′-GAGCTGGACCTCAGTGACAATGC-3′，下游5′-ACCAATGCGAGATCCTGACAACAC-3′；IL-6上游5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′，下游5′- CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′；IL-8上游5′-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3′，下游5′-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3′，IL-1β上游5′-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3′，下游5′-CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA-3′；GAPDH上游5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。实验重复4次。
1.7 蛋白印迹法检测蛋白表达
细胞处理完成后，提取各组总蛋白测定蛋白浓度，各组取40 μg蛋白进行电泳，冰浴电转至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗孵育4 ℃过夜，TBST洗膜4次，室温下二抗孵育1.5 h，TBST洗膜4次，ECL发光系统曝光检测。实验重复3次。
1.8 酶联免疫吸附试验检测细胞上清的炎症因子
HPMEC按细胞处理完成后收集细胞上清液，按照酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒中的说明，测定炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8的含量。
1.9 统计学方法
采用SPSS 24.0统计软件。数值变量如果服从正态分布，采用方差分析进行组间比较，如果组间差异有统计学意义，且符合方差齐性，进一步采用LSD法进行两两比较，若不符合方差齐性，则采用Dunnett's T3法进行两两比较。如果不服从正态分布，组间比较采用非参数检验（Kruskal-Wallis秩和检验），当组间总的有统计学差异，进一步采用Dunn法进行多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-22-3p在腹腔感染的ARDS患者中表达下降
对3例因腹腔感染所致ARDS患者和3例健康受试者的血浆行Affymetrix miRNA 4.0 Array芯片分析。芯片分析结果显示，miR-22-3p在腹腔感染所致的ARDS患者中的表达下调显著，为健康受试者的0.062倍。
2.2 miR-22-3p对HMGB1表达的影响
用10 μg/mL的LPS刺激的HPMEC细胞，miR-22-3p模拟物组细胞内HMGB1 mRNA表达与空白组相比明显下调（0.70±0.15比1.00±0.00，P<0.01），蛋白水平与mRNA趋势相同；miR-22-3p抑制剂组HMBG1 mRNA（1.20±0.10比1.00±0.00，P<0.05）表达水平明显上调，蛋白呈现出与mRNA相同的趋势。 结果见图1。
图1
miR-22-3p对LPS刺激的HPMEC中HMGB1表达的影响
a. 蛋白印迹检测像；b. RT-qPCR定量分析柱状图。miR-22-3p的过表达使HMGB1蛋白和mRNA水平降低，miR-22-3p的低表达使HMGB1蛋白和mRNA水平升高。1. 空白组；2. miR-22-3p模拟物阴性对照组；3. miR-22-3p模拟物组；4. miR-22-3p抑制剂阴性对照组；5. miR-22-3p抑制剂组。与空白组比较，*
2.3 miR-22-3p对LPS刺激下NLRP3炎症小体形成的影响
与空白组相比，miR-22-3p模拟物组细胞内NLRP3的mRNA水平显著下调（0.52±0.06比1.00±0.00，P<0.001），miR-22-3p抑制剂组NLRP3的mRNA水平显著上调（1.46±0.06比1.00±0.00，P<0.001），蛋白也呈现出与mRNA相同的趋势。与空白组相比，miR-22-3p模拟物组细胞内活化的Caspase-1的表达显著降低，IL-1β mRNA（1.78±1.12比4.80±1.13，P<0.01）及细胞上清中的IL-1β［（26.26±1.46）pg/mL比（35.50±1.86）pg/mL，P<0.001］显著降低；miR-22-3p抑制剂组细胞内活化的Caspase-1的表达显著升高，IL-1β mRNA（7.77±0.66比4.80±1.13，P<0.01）及细胞上清中的IL-1β［（48.22±2.14）pg/mL比（35.50±1.86）pg/mL，P<0.001］显著升高。 结果见图2。
图2
miR-22-3p对LPS刺激的HPMEC中炎症小体的影响
a. NLRP3 RT-qPCR定量分析柱状图；b. IL-1β RT-qPCR定量分析柱状图；c. 上清IL-1β ELISA检测柱状图；d. 蛋白印迹检测像。miR-22-3p的过表达使 NLRP3、IL-1β、cleaved-caspase-1水平降低，miR-22-3p的低表达使NLRP3、IL-1β、cleaved-caspase-1水平升高。1. 空白组；2. miR-22-3p模拟物阴性对照组；3. miR-22-3p模拟物组；4. miR-22-3p抑制剂阴性对照组；5. miR-22-3p抑制剂组。与空白组比较，**
2.4 miR-22-3p对LPS刺激下HPMEC炎症的影响
与空白组相比，miR-22-3p模拟物组炎症因子IL-6 mRNA（4.06±1.60比7.10±0.82，P<0.01）和IL-8 mRNA水平（10.64±7.16比32.08±2.01，P<0.001），以及上清中的IL-6［（287.83±3.22）pg/mL比(322.51±3.99) pg/mL，P<0.01］和IL-8蛋白浓度［（2436.54±53.24）pg/mL比（2827.86±98.47）pg/mL，P<0.01］显著下调，miR-22-3p抑制剂组炎症因子IL-6 mRNA（10.98±1.55比7.10±0.82，P<0.01）和IL-8 mRNA水平（44.97±5.62比32.08±2.01，P<0.01），以及上清中的IL-6［（340.30±4.51）pg/mL比（322.51±3.99）pg/mL，P<0.01］和IL-8蛋白浓度［（3119.19±221.63）pg/mL比（2827.86±98.47）pg/mL，P<0.01］显著上调。 结果见图3。
图3
miR-22-3p对LPS刺激的HPMEC中炎症因子的影响
a. IL-6 RT-qPCR定量分析柱状图；b. 上清IL-6 ELISA检测柱状图；c. IL-8 RT-qPCR定量分析柱状图；d. 上清IL-8 ELISA检测柱状图。与空白组相比，miR-22-3p的过表达使IL-6、IL-8水平下调，miR-22-3p的低表达使IL-6、IL-8水平上调。1. 空白组；2. miR-22-3p模拟物阴性对照组；3. miR-22-3p模拟物组；4. miR-22-3p抑制剂阴性对照组；5. miR-22-3p抑制剂组。与空白组比较，**
3 讨论
ARDS以级联放大的“炎症风暴”为特征。尽管对ARDS的发病机制有了较深入的了解，但目前仍对基因水平的调控机制知之甚少。HMGB1与多种疾病均存在关联，包括脓毒症、自身免疫疾病、获得性免疫缺陷综合征、糖尿病、肿瘤等，且目前研究证实HMGB1在ARDS的发病机制中扮演着重要的角色[18]。NLRP3炎症小体是天然免疫系统中一种重要的细胞内多蛋白复合物，其活化可以在一定程度上帮助机体抵御病原体的入侵，但是在ARDS中其过度活化则会导致炎症相关的组织损伤[19-20]。一系列研究证明HMGB1与NLRP3炎症小体有密切的关联，两者可相互激活活化。HMGB1通过TLR2通路增加NLRP3和Caspase-1的表达，通过RAGE通路增加ASC和Caspase-1的表达，通过TLR4通路增加Caspase-1的表达[21]。另外，也有文献报道炎症小体的活化促进HMGB1的表达释放[22]。因此，HMGB1和NLRP3的相互活化可能在ARDS中起到重要的推动作用，若能同时减少两者表达，可能对ARDS的进展有减缓作用。
许多研究表明miRNA在细胞增殖、分化、凋亡、迁移、炎症、免疫应答、代谢、器官发生和肿瘤形成等基本生理和病理过程中起着重要的作用。与此同时，多种生理病理过程也会影响miRNA的生物合成。在ARDS中，机体多种miRNA的表达发生变化，变化的miRNA也起到重要的调控作用。本研究收集了3例因腹腔感染所致ARDS患者和3例健康受试者的血浆，行miRNA芯片分析，数种miRNA在ARDS患者中表达下调。查阅文献后发现，在口腔鳞癌细胞模型中，miR-22-3p可通过靶向NLRP3抑制肿瘤细胞的增殖和迁移[23]。在胃癌模型中，幽门螺杆菌的感染抑制了miR-22-3p的表达，减少其对NLRP3表达的抑制，导致胃上皮细胞不可控的持续增殖，最终导致胃癌的发生[24]。亦有报道miR-22-3p可通过靶向HMGB1减轻急性肾损伤[25]。在肝癌细胞中，miR-22-3p可通过靶向HMGB1影响肿瘤的迁移和增值[26]。不同疾病模型发病机制不同，在ARDS中，miR-22-3p能否靶向HMGB1和NLRP3从而发挥功能仍无相关研究，推测miR-22-3p可能通过同时靶向HMGB1和NLRP3减轻炎症反应。
有研究证实，在肺部感染导致的ARDS中，直接损伤主要影响肺泡上皮，并产生局部肺泡炎症反应，而在肺外因素导致的ARDS中，间接损伤通过血流中的炎症介质影响血管内皮[27]。腹腔感染导致的ARDS，人肺微血管内皮细胞起到“主控者”的重要作用，因此，本试验拟通过HPMEC作为细胞模型，通过过表达和低表达细胞内的miR-22-3p，研究miR-22-3p对人肺微血管内皮细胞炎症的影响及其作用靶点。研究发现，在HPMEC炎症模型中，miR-22-3p可同时抑制HMGB1及NLRP3 mRNA和蛋白表达。研究显示，miRNA沉默靶标主要通过使mRNA衰变或抑制翻译的方式发挥作用。本研究显示，miR-22-3p可能通过促进HMGB1和NLRP3 mRNA衰减，最终起到抑制HMGB1和NLRP3蛋白表达的作用。既往的研究表明，在炎症细胞中，HMGB1和NLRP3炎症小体可以互相激活从而增强炎症反应[28-29]，因此，降低HMGB1的水平和（或）减少NLRP3炎症小体的激活可以破坏这种相互激活产生的正反馈。笔者认为，在生理情况下，miR-22-3p部分抑制了HMGB1及NLRP3的表达，使其表达水平在正常范围内。而在ARDS等急性炎症时，miR-22-3p水平降低，对HMBG1和NLRP3的抑制作用大大减弱，使其表达升高，更易相互激活产生正反馈作用，从而进一步恶化炎症水平。
综上所述，本研究证实miR-22-3p 可下调HMGB1和NLRP3的蛋白表达，从而减缓LPS刺激HPMEC所致炎症反应，有望成为ARDS防治的新靶点。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床危重症，一旦患病，病死率高达20%～50%[1]。最近研究认为肺血管内皮细胞是ARDS炎症风暴中心[2]。高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是一种非组蛋白，之前认为其仅起到增强转录的作用[2-3]，目前发现在ARDS中HMGB1可由活化的免疫细胞释放，在ARDS的发病机制中扮演着重要的角色[4]。在ARDS患者中外周血HMGB1水平升高[5-6]，血浆HMGB1水平被证明与疾病的严重程度、生存率和病死率相关[7-8]。动物实验发现小鼠气管滴注HMGB1会直接导致ARDS[9]。在脂多糖（lipopoly-saccharide，LPS）诱导的小鼠ARDS模型中，给与HMGB1中和抗体或通过抑制HMGB1可显著减轻ARDS的严重程度[10]。以上研究说明HMGB1可能作为一种关键促炎因子参与ARDS的病理过程。
Nod样受体蛋白3（nucleotide binding oligomerization segment like receptor family 3，NLRP3）炎症小体是由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）前体、胞浆PRRs蛋白质家族NOD样受体NLRP3蛋白和细胞质DNA传感器AIM2组成的多蛋白复合体。NLRP3炎症小体的活化会导致下游炎症因子的释放，在ARDS的发生发展中发挥着重要作用[11]，也是近年来研究的热点。NLRP3炎症小体的活化将无活性的Caspase-1的前体激活成为有活性的Caspase-1（cleaved-caspase-1），切割白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18的前体，使之成熟释放，从而发挥相应的生物学功能[12]。因此，cleaved-caspase-1是判断NLRP3炎症小体活化的标准之一。研究显示，特异性抑制NLRP3炎症小体的活化可显著抑制中性粒细胞的聚集和炎症因子的产生，从而减轻肺损伤[13]。
微RNA（microRNA，miRNA）是长约22个核苷酸的非编码小RNA，miRNA通过其种子序列（5′端第2～8位核苷酸）识别其靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）3′非翻译区（3′UTR）上的结合位点，起到抑制翻译、切割或降解mRNA的作用，是基因表达过程的负性调控因子[14]。在ARDS中，外周血中HMGB1显著升高[15]，NLRP3炎症小体显著活化[16-17]。本研究旨在探究在ARDS中能同时靶向HMGB1和NLRP3的miRNA，在人肺微血管内皮细胞（human pulmonary microvascular endothelial cell，HPMEC）中干预miRNA的表达，验证其对ARDS炎症反应的作用。
1 材料与方法
1.1 ARDS患者血浆收集
选择东部战区总医院2019年1月—6月重症医学科（intensive care unit，ICU）住院治疗的由于腹腔感染导致的ARDS患者，确诊后立即收集患者外周血。另外，在东部战区总医院体检中心选择年龄相匹配的健康志愿者作为对照组。通过体检结果及询问病史查体，所有健康志愿者都没有基础疾病史，没有肺部不适症状和体征，经胸部X线检查未发现肺部异常。ARDS患者入选标准：ARDS诊断符合2012年的柏林定义；在血浆收集前24 h内入住ICU的患者；ARDS由腹腔感染引起。腹腔感染的诊断标准：有腹腔感染相关的临床表现，如发热、转移性右下腹痛、麦氏点压痛、Murphy征阳性、停止排气排便、腹部压痛、反跳痛及肌紧张等；实验室检查结果：白细胞计数、中性粒细胞百分比、C反应蛋白及降钙素原增高等；超声和CT提示腹腔感染；腹腔积液培养提示细菌感染。排除标准：年龄<18岁；妊娠期；免疫功能缺陷患者，包括有干细胞移植史的患者和使用免疫抑制剂的患者；恶性肿瘤患者；预计住院时间<48 h。研究方案符合医学伦理学标准，经东部战区总医院伦理委员会同意实施。健康志愿者及患者家属均签署知情同意书。所有参与者留取外周静脉血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，3000 r/min离心15 min，留取上层血浆至EP管中，–80 ℃保存备用。
1.2 miRNA芯片分析
利用TRIzol和miRNeasy mini kit（QIAGEN）提取血浆总RNA，NanoDrop-2000超微量分光光度计鉴定RNA的纯度和质量。根据标准流程进行样品标记（Flash Tag Biotin HSR RNA Labeling Kit，Affymetrix）、微阵列杂交（GeneChip2 Hybridization Oven 640，Affymetrix）、洗涤（GeneChip2 Fluidics Station 450）和扫描（GeneChip2 Scanner 3000 7G，Affymetrix）。信号强度值采用Affymetrix Expression Console™软件（版本1.3.1）进行评估，并将实验结果分析运算，将样本表达数据归一化。
1.3 主要实验材料
LPS（美国Sigma公司），脂质体转染试剂（美国Invitrogen公司），miRNA模拟物、miRNA抑制剂（广州锐博公司），Trizol（美国Ambion公司），实时荧光定量聚合酶链反应（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCT）试剂盒（日本TAKARA公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天公司），β-肌动蛋白（β-actin）一抗（南京巴傲得公司），HMGB1、NLRP3、Caspase-1一抗（美国Abcam公司）。
1.4 细胞培养
HPMEC原代细胞、ECM培养基、胎牛血清、内皮细胞生长因子、双抗（以上均购买自美国ScienCell公司）。用含5%胎牛血清，1%内皮细胞生长因子，1%双抗的ECM培养基培养，培养条件为37 ℃、5% CO2、常规湿度，选用第4～6代快速生长期细胞进行实验。
1.5 实验分组及细胞处理
（1）空白组：HPMEC用LPS刺激；（2）miR-22-3p模拟物阴性对照组：HPMEC转染miR-22-3p模拟物阴性对照后用LPS刺激；（3）miR-22-3p模拟物组：HPMEC转染miR-22-3p模拟物后用LPS刺激；（4）miR-22-3p抑制剂阴性对照组：HPMEC转染miR-22-3p抑制剂阴性对照后用LPS刺激；（5）miR-22-3p抑制剂组：转染miR-22-3p抑制剂后用LPS刺激。约1×106个HPMEC接种于6孔板中，至70%～80%左右的细胞密度。用125 μL Opti-MEM稀释Lipofectamin®3000，温和混匀并恒温孵育5 min，用125 μL Opti-MEM分别稀释10 μL miR-22-3p模拟物、miR-22-3p抑制剂及其阴性对照，温和混匀并恒温孵育5 min。将两者温和混匀，室温孵育20 min，后将混合液加入到各孔中，置于培养箱中培养24～48 h。在每孔中加入终浓度为10 μg/mL LPS进行刺激，放入恒温箱培养6 h。
1.6 RT-qPCR实验
收集细胞，Trizol提取总RNA，按照TAKARA逆转录试剂盒说明书合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），并以cDNA作为模板进行RT-qPCR。反应在viia7 PCR System上操作（美国ABI公司），反应体系：cDNA 1 μL，SYBR Green 5 μL，前后引物（10 μmol/L）各0.2 μL，Dnase-Free ddH2O 3.6 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，随后95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共40个循环。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，HMGB1、NLRP3、IL-6、IL-8、IL-1β的相对表达量以2–ΔΔCt方法计算。引物序列如下：HMGB1上游5′-GCTCCATAGAGACAGCGCCGGG-3′，下游5′-CCTCAGCGAGGCACAGAGTCGC-3′；NLRP3上游5′-GAGCTGGACCTCAGTGACAATGC-3′，下游5′-ACCAATGCGAGATCCTGACAACAC-3′；IL-6上游5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′，下游5′- CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′；IL-8上游5′-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3′，下游5′-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3′，IL-1β上游5′-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3′，下游5′-CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA-3′；GAPDH上游5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。实验重复4次。
1.7 蛋白印迹法检测蛋白表达
细胞处理完成后，提取各组总蛋白测定蛋白浓度，各组取40 μg蛋白进行电泳，冰浴电转至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗孵育4 ℃过夜，TBST洗膜4次，室温下二抗孵育1.5 h，TBST洗膜4次，ECL发光系统曝光检测。实验重复3次。
1.8 酶联免疫吸附试验检测细胞上清的炎症因子
HPMEC按细胞处理完成后收集细胞上清液，按照酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒中的说明，测定炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8的含量。
1.9 统计学方法
采用SPSS 24.0统计软件。数值变量如果服从正态分布，采用方差分析进行组间比较，如果组间差异有统计学意义，且符合方差齐性，进一步采用LSD法进行两两比较，若不符合方差齐性，则采用Dunnett's T3法进行两两比较。如果不服从正态分布，组间比较采用非参数检验（Kruskal-Wallis秩和检验），当组间总的有统计学差异，进一步采用Dunn法进行多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-22-3p在腹腔感染的ARDS患者中表达下降
对3例因腹腔感染所致ARDS患者和3例健康受试者的血浆行Affymetrix miRNA 4.0 Array芯片分析。芯片分析结果显示，miR-22-3p在腹腔感染所致的ARDS患者中的表达下调显著，为健康受试者的0.062倍。
2.2 miR-22-3p对HMGB1表达的影响
用10 μg/mL的LPS刺激的HPMEC细胞，miR-22-3p模拟物组细胞内HMGB1 mRNA表达与空白组相比明显下调（0.70±0.15比1.00±0.00，P<0.01），蛋白水平与mRNA趋势相同；miR-22-3p抑制剂组HMBG1 mRNA（1.20±0.10比1.00±0.00，P<0.05）表达水平明显上调，蛋白呈现出与mRNA相同的趋势。 结果见图1。
图1
miR-22-3p对LPS刺激的HPMEC中HMGB1表达的影响
a. 蛋白印迹检测像；b. RT-qPCR定量分析柱状图。miR-22-3p的过表达使HMGB1蛋白和mRNA水平降低，miR-22-3p的低表达使HMGB1蛋白和mRNA水平升高。1. 空白组；2. miR-22-3p模拟物阴性对照组；3. miR-22-3p模拟物组；4. miR-22-3p抑制剂阴性对照组；5. miR-22-3p抑制剂组。与空白组比较，*
2.3 miR-22-3p对LPS刺激下NLRP3炎症小体形成的影响
与空白组相比，miR-22-3p模拟物组细胞内NLRP3的mRNA水平显著下调（0.52±0.06比1.00±0.00，P<0.001），miR-22-3p抑制剂组NLRP3的mRNA水平显著上调（1.46±0.06比1.00±0.00，P<0.001），蛋白也呈现出与mRNA相同的趋势。与空白组相比，miR-22-3p模拟物组细胞内活化的Caspase-1的表达显著降低，IL-1β mRNA（1.78±1.12比4.80±1.13，P<0.01）及细胞上清中的IL-1β［（26.26±1.46）pg/mL比（35.50±1.86）pg/mL，P<0.001］显著降低；miR-22-3p抑制剂组细胞内活化的Caspase-1的表达显著升高，IL-1β mRNA（7.77±0.66比4.80±1.13，P<0.01）及细胞上清中的IL-1β［（48.22±2.14）pg/mL比（35.50±1.86）pg/mL，P<0.001］显著升高。 结果见图2。
图2
miR-22-3p对LPS刺激的HPMEC中炎症小体的影响
a. NLRP3 RT-qPCR定量分析柱状图；b. IL-1β RT-qPCR定量分析柱状图；c. 上清IL-1β ELISA检测柱状图；d. 蛋白印迹检测像。miR-22-3p的过表达使 NLRP3、IL-1β、cleaved-caspase-1水平降低，miR-22-3p的低表达使NLRP3、IL-1β、cleaved-caspase-1水平升高。1. 空白组；2. miR-22-3p模拟物阴性对照组；3. miR-22-3p模拟物组；4. miR-22-3p抑制剂阴性对照组；5. miR-22-3p抑制剂组。与空白组比较，**
2.4 miR-22-3p对LPS刺激下HPMEC炎症的影响
与空白组相比，miR-22-3p模拟物组炎症因子IL-6 mRNA（4.06±1.60比7.10±0.82，P<0.01）和IL-8 mRNA水平（10.64±7.16比32.08±2.01，P<0.001），以及上清中的IL-6［（287.83±3.22）pg/mL比(322.51±3.99) pg/mL，P<0.01］和IL-8蛋白浓度［（2436.54±53.24）pg/mL比（2827.86±98.47）pg/mL，P<0.01］显著下调，miR-22-3p抑制剂组炎症因子IL-6 mRNA（10.98±1.55比7.10±0.82，P<0.01）和IL-8 mRNA水平（44.97±5.62比32.08±2.01，P<0.01），以及上清中的IL-6［（340.30±4.51）pg/mL比（322.51±3.99）pg/mL，P<0.01］和IL-8蛋白浓度［（3119.19±221.63）pg/mL比（2827.86±98.47）pg/mL，P<0.01］显著上调。 结果见图3。
图3
miR-22-3p对LPS刺激的HPMEC中炎症因子的影响
a. IL-6 RT-qPCR定量分析柱状图；b. 上清IL-6 ELISA检测柱状图；c. IL-8 RT-qPCR定量分析柱状图；d. 上清IL-8 ELISA检测柱状图。与空白组相比，miR-22-3p的过表达使IL-6、IL-8水平下调，miR-22-3p的低表达使IL-6、IL-8水平上调。1. 空白组；2. miR-22-3p模拟物阴性对照组；3. miR-22-3p模拟物组；4. miR-22-3p抑制剂阴性对照组；5. miR-22-3p抑制剂组。与空白组比较，**
3 讨论
ARDS以级联放大的“炎症风暴”为特征。尽管对ARDS的发病机制有了较深入的了解，但目前仍对基因水平的调控机制知之甚少。HMGB1与多种疾病均存在关联，包括脓毒症、自身免疫疾病、获得性免疫缺陷综合征、糖尿病、肿瘤等，且目前研究证实HMGB1在ARDS的发病机制中扮演着重要的角色[18]。NLRP3炎症小体是天然免疫系统中一种重要的细胞内多蛋白复合物，其活化可以在一定程度上帮助机体抵御病原体的入侵，但是在ARDS中其过度活化则会导致炎症相关的组织损伤[19-20]。一系列研究证明HMGB1与NLRP3炎症小体有密切的关联，两者可相互激活活化。HMGB1通过TLR2通路增加NLRP3和Caspase-1的表达，通过RAGE通路增加ASC和Caspase-1的表达，通过TLR4通路增加Caspase-1的表达[21]。另外，也有文献报道炎症小体的活化促进HMGB1的表达释放[22]。因此，HMGB1和NLRP3的相互活化可能在ARDS中起到重要的推动作用，若能同时减少两者表达，可能对ARDS的进展有减缓作用。
许多研究表明miRNA在细胞增殖、分化、凋亡、迁移、炎症、免疫应答、代谢、器官发生和肿瘤形成等基本生理和病理过程中起着重要的作用。与此同时，多种生理病理过程也会影响miRNA的生物合成。在ARDS中，机体多种miRNA的表达发生变化，变化的miRNA也起到重要的调控作用。本研究收集了3例因腹腔感染所致ARDS患者和3例健康受试者的血浆，行miRNA芯片分析，数种miRNA在ARDS患者中表达下调。查阅文献后发现，在口腔鳞癌细胞模型中，miR-22-3p可通过靶向NLRP3抑制肿瘤细胞的增殖和迁移[23]。在胃癌模型中，幽门螺杆菌的感染抑制了miR-22-3p的表达，减少其对NLRP3表达的抑制，导致胃上皮细胞不可控的持续增殖，最终导致胃癌的发生[24]。亦有报道miR-22-3p可通过靶向HMGB1减轻急性肾损伤[25]。在肝癌细胞中，miR-22-3p可通过靶向HMGB1影响肿瘤的迁移和增值[26]。不同疾病模型发病机制不同，在ARDS中，miR-22-3p能否靶向HMGB1和NLRP3从而发挥功能仍无相关研究，推测miR-22-3p可能通过同时靶向HMGB1和NLRP3减轻炎症反应。
有研究证实，在肺部感染导致的ARDS中，直接损伤主要影响肺泡上皮，并产生局部肺泡炎症反应，而在肺外因素导致的ARDS中，间接损伤通过血流中的炎症介质影响血管内皮[27]。腹腔感染导致的ARDS，人肺微血管内皮细胞起到“主控者”的重要作用，因此，本试验拟通过HPMEC作为细胞模型，通过过表达和低表达细胞内的miR-22-3p，研究miR-22-3p对人肺微血管内皮细胞炎症的影响及其作用靶点。研究发现，在HPMEC炎症模型中，miR-22-3p可同时抑制HMGB1及NLRP3 mRNA和蛋白表达。研究显示，miRNA沉默靶标主要通过使mRNA衰变或抑制翻译的方式发挥作用。本研究显示，miR-22-3p可能通过促进HMGB1和NLRP3 mRNA衰减，最终起到抑制HMGB1和NLRP3蛋白表达的作用。既往的研究表明，在炎症细胞中，HMGB1和NLRP3炎症小体可以互相激活从而增强炎症反应[28-29]，因此，降低HMGB1的水平和（或）减少NLRP3炎症小体的激活可以破坏这种相互激活产生的正反馈。笔者认为，在生理情况下，miR-22-3p部分抑制了HMGB1及NLRP3的表达，使其表达水平在正常范围内。而在ARDS等急性炎症时，miR-22-3p水平降低，对HMBG1和NLRP3的抑制作用大大减弱，使其表达升高，更易相互激活产生正反馈作用，从而进一步恶化炎症水平。
综上所述，本研究证实miR-22-3p 可下调HMGB1和NLRP3的蛋白表达，从而减缓LPS刺激HPMEC所致炎症反应，有望成为ARDS防治的新靶点。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
