引用本文： 刘碧翠, 李奎, 丁飞, 胡莉丽, 罗永霄, 刘春涛. 支气管扩张气道细菌微生物组学及与临床特征的相关性研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2023, 22(5): 311-318. doi: 10.7507/1671-6205.202209060 复制
支气管扩张（简称支扩）以不可逆转的一个或多个支气管扩张异常破坏和持续扩张为特征，导致气道黏液间歇或持久的分泌以及细菌的持续定植和反复感染，形成气道阻塞、炎症和组织破坏的恶性循环[1]。支扩患者急性加重的症状有发热、脓痰、呼吸困难[2]，频繁加重会导致肺功能和生活质量显著下降[3]。利用传统的细菌培养技术检测到支扩患者气道常见细菌为流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌 [4]。然而，相当比例的患者即使咯脓性痰，痰培养也未能分离出任何病原菌。基于非培养基础的16S rRNA基因检测可以有效绕开微生物的纯培养过程，具有快速、准确、高效的优点，也可以从相同的标本中检测出更多种类的微生物[5]。
在既往的支扩患者气道细菌微生物组学的变化特点的研究中，有结果不支持患者病情加重是由某一种细菌过度生长所导致[1]，有结果显示急性加重期和稳定期及治疗前后气道的细菌微生物组学变化不明显[5-6]，也有研究表明支扩气道细菌微生态构成比的改变与肺功能及病情严重程度有关[7]。总之支扩患者气道微生物的结构和动态改变影响患者的临床状态和疾病进程仍没有统一的定论，故本研究假设支扩患者气道微生态的构成特点与其临床特征有一定的相关性，应用16S rRNA基因高通量测序技术结合传统细菌培养对支扩患者的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）行检测及对比分析，比较了支扩患者与对照组气道细菌微生物组学的区别，以了解支扩患者气道微生物的构成比和动态变化及其与病情加重的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集2017年10月—2018年4月华西医院呼吸与危重症医学科门诊经胸部高分辨CT确诊的支扩患者，对照组为呼吸与危重症医学科门诊因胸部小结节行支气管镜检查的患者。支扩的诊断标准：（1）支气管内腔直径大于伴发肺动脉内腔直径；（2）外周支气管无逐渐变细的特点；（3）在胸膜表面1 cm内可见周围支气管[8]。
支扩组纳入标准：（1）年龄在18～70岁；（2）至少有咳嗽、咳痰、呼吸困难中的一种症状。排除标准：（1）4周内应用抗生素治疗者；（2）4周内应用糖皮质激素治疗者；（3）存在其他呼吸道疾病；（4）存在支气管镜检查的禁忌证；⑤ 支扩继发于肺间质纤维化。对照组纳入标准：（1）年龄在18～70岁；（2）胸部单一小结节（病变直径≤10 mm）行支气管镜检查且病理学检查结果阴性的患者。对照组排除标准：（1）4周内应用抗生素治疗者；（2）4周内应用糖皮质激素治疗者；（3）存在其他呼吸系统疾病。研究方案获得四川大学华西医院伦理委员会的审核并同意批准（批件号：2017年审299号）。在试验前向所有受试对象解释本试验的目的、意义、测试项目、可能获益及安全性，取得其同意并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 支扩患者急性加重期与稳定期的定义
目前尚无统一的支扩急性加重期定义，1994年Fuchs定义的支扩急性加重标准被普遍采用：（1）咳痰量增加；（2）新发生的咯血；（3）咳嗽增加；（4）呼吸困难加重；（5）萎靡、倦怠、嗜睡；（6）体温>38 ℃；（7）厌食、体重下降；（8）副鼻窦疼痛或压痛；（9）鼻腔分泌物增加；（10）胸部听诊啰音的发生改变；（11）肺功能中用力肺活量（forced vital capacity，FVC）或第1秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second，FEV1）下降10%；（12）胸部CT提示肺部感染。存在12个指标中的4项改变确定为急性加重，需要抗生素治疗[9]。将在4周内无加重或无抗生素治疗定义为支扩稳定期[6]。
1.2.2 收集受试者BALF
患者行支气管镜检查前常规禁食、禁水8 h。操作者在操作前使用2%利多卡因对患者鼻咽部进行喷雾麻醉，心电血压及脉搏血氧饱和度的监测，然后将支气管镜经鼻腔进入咽喉部，通过会厌及声门，为避免上呼吸道分泌物的污染对结果产生影响，在此过程中禁止进行负压吸引，动作轻柔、准确、快速，进入下呼吸道支气管扩张的病变部位，在支气管镜成功楔入经胸部高分辨CT证实的病变支气管后，注入室温无菌生理盐水（20 mL/次），灌洗液注入后，需立即负压吸引回收BALF，直到总回收灌洗液约 60 mL后停止灌注。回收的灌洗液保存于无菌痰液收集管内，分装一半立即送华西医院检验科细菌室行细菌培养及药敏检查，剩余部分立即–80 ℃冰箱保存。对照组受试者检查时，留取的标本为结节病变对侧的下叶基底段支气管BALF，留取方法同支扩患者。为了减少不同批次、不同检测试剂、不同检测深度带来基因检测的误差，所有标本于2018年4月统一外送欧易生物公司检测分析。
1.2.3 BALF细菌培养
BALF细菌选择性培养基主要包括血琼脂平板培养基和巧克力色血琼脂平板培养基（郑州安图生物工程有限公司）。使用SPUTASOL将BALF均质化，并使用标准接种胶环将有意义的菌液接种至培养基上，然后将培养基置于含5%二氧化碳的37 ℃恒温培养箱中隔夜培养，使得培养基中菌落数达到30～300 cfu。对培养阴性的培养基继续进行培养，其后每天观察细菌生长情况，观察上限为4 d。
1.2.4 BALF标本16S rRNA基因测序及分析
本研究基因组DNA 的提取、 PCR 扩增及生物信息分析由上海欧易生物医学科技有限公司开展完成。
1.2.4.1 16S rRNA基因测序
首先，应用Good’s Coverage指数（Good’s nonparametic Coverage Estimator）进行全部样本的检测深度检验。Good’s Coverage指数由Esty[10]提出，目的是反映测序深度，Good’s Coverage指数接近于 1，表明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种。随后，采用DNA抽提试剂盒（Life Technologies公司，Cat.No.Q328520）对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，留取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物，在进行样品总RNA提取过程中，运用KAPA公司的HiFi Hot Start Ready Mix高保真酶进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。细菌多样性鉴定对应区域：16S V3-V4区（前端引物343F序列：5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'和后端引物798R序列：5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）。PCR产物使用电泳检测后使用磁珠纯化，纯化后作为二轮PCR模板，并进行二轮PCR扩增、电泳检测及磁珠纯化，纯化后对PCR产物进行Qubit定量。根据PCR产物浓度进行等量混样，并上机测序。
1.2.4.2 生物信息分析
由Illumina Miseq测序得出原始数据。在微生物多样性测序分析中，原始双端测序数据经过一系列质控得到较优质的序列即有效序列（Valid tags）[11]，Valid tags进行操作分类单元（Operational Taxonomic Unit，OTU）分类，挑选丰度最大的序列作为代表序列，与Silva数据库（v123）进行比对后得到OTU分类表格。使用Trimmomatic软件，采用滑动窗口法，对原始数据序列扫描，使用Flash软件，将合格的双端原始数据序列拼接，序列拼接时最大重叠为200 bp，得到完整配对结尾序列（Paired end序列）。使用Split_libraries软件去除配对结尾序列中含有N碱基的序列，去除单碱基重复大于8的序列，去除长度小于200 bp的序列，得到高质量序列（Clean tags）。使用UCHIME软件去除高质量序列中的嵌合体，最终得到用于OTU划分的Valid tags。利用Shannon指数反映细菌的数量及分配的均匀性，以间接反映菌群的多样性。菌群的差异性分析基于加权Unifrac距离算法的Heatmap差异性分析法。Heatmap差异性分析法是利用样本两两交叉比较物种的多样性，生成Heatmap图，图形方格的颜色代表交叉样品两两之间的相异系数，相异系数越小表示物种多样性的差异越小，颜色也越红。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0统计软件。用Kolmogorov-Smirnov方法测试连续变量的分布，正态分布用均值±标准差（
±s）表示，非正态分布用中位数（四分位数）表示。对于正态分布，采用独立t检验或多因素方差分析，对于非正态分布采用非参数检验。分类数据以例数（百分比）表示，采用χ2检验。采用PAST（Paleontological statistics programme）V.2.16进行菌落相似性的Bray-Curtis定量指数分析，使用基于物种进化关系或数量距离矩阵的NMDS配合Anosim检验方法分析各组间微生物组Beta多样性，采用XLSTAT程序进行Mantel检验。进行两组数据的相关性分析时，若数据呈正态分布时按Pearson法进行直线相关性分析，若数据呈非正态分布时按Spearman法进行直线相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
收集了32例门诊支扩的患者，以下患者被排除：7例就诊前4周内接受过抗生素治疗的患者，1例患者就诊前4周内行全身糖皮质激素治疗，1例患者无支扩相关症状，2例患者因不能耐受行支气管镜检查， 3例患者拒绝行支气管镜检查，1例患者未签署本项研究的知情同意书。最终纳入17例支扩患者并完成临床试验，按照Fuchs标准，其中8例为稳定期，9例为急性加重期。
6例因肺部磨玻璃结节行支气管镜检查者作为对照组，留取其健侧BALF。支扩组患者与对照组患者相比较，肺功能参数差异均有统计学意义（均P<0.001），其余基本情况无显著差异。结果见表1。
表1
纳入支扩患者与对照组患者基本参数特征［例（%）/（
）］
2.2 支扩患者临床特点
在纳入的支扩患者中，男性占47.1%，平均年龄为53.4岁，平均体重指数为20.9 kg/m2。其中有吸烟史的患者占23.5%，有饮酒史的患者占5.9%。支扩的病程中位数为10年。圣乔治评分为39.3分，莱切斯特咳嗽评分为12.3分，支气管扩张严重指数为8.9分。FEV1%pred为58.2%±18.9%，FVC%pred为77.8%±16.5%，FEV1/FVC为62.6%±14.8%。7例（41.2%）患者BALF细菌培养呈阳性，其中5例为铜绿假单胞菌阳性，1例为流感嗜血杆菌，1例为肺炎克雷伯菌（表2）。影像学类型：囊状支扩10例（58.8%），柱状支扩6例（35.3%），静脉曲张型支扩1例（5.9%），Reiff评分8.1分。
表2
支扩患者的BALF细菌培养结果与16S rRNA基因测序结果比较
2.3 全部样本的检测深度检验
所有样本的Good’s Coverage指数值均接近1，说明本次检测的深度已足够覆盖样本中的全部物种，可信度高，具体结果见图1。
图1
全部检测样本的Good’s Coverage指数
D：对照组。P：支扩组。其中，支扩组有2例患者进行了2次测试，1例患者进行了3次测试。
2.4 支扩组与对照组Valid tags和OTU数量比较
所有样本中共检测出1383273个Valid tags，鉴定出1893类OTU，在质控之后的Clean tags数据量分布在33922～41907之间，Clean tags经过去除嵌合体得到Valid tags数据量分布在29137～38620之间，Valid tags平均长度分布在424.21～439.7 bp，各样本OTU个数分布在282～792之间。
支扩患者的Valid tags数量为35542（31648～36495），对照组的Valid tags数量为35068（33959～35877），两组间比较，差异无统计学意义（P=0.606）。支扩患者的OTU数量为390（321～470），对照组的OTU数量为412（385～435），两组间比较，差异无统计学意义（P=0.840）。结果见图2a、b。
图2
支扩组与对照组生物信息分析
a. Valid tags数量对比；b. OTU数量对比；c. Shannon指数对比。
2.5 支扩组与对照组菌群的多样性
支扩组与对照组Shannon指数分别为5.2、6.2，支扩组Shannon指数较对照组低，但差异无统计学意义（P=0.234），见图2c。
2.6 支扩组细菌培养分类与对照组气道细菌微生物组学特点比较
为进一步明确支扩患者气道细菌微生物组学的特点，根据BALF细菌培养的结果，分为菌阳组（BALF细菌培养阳性）和菌阴组（BALF细菌培养阴性），并与对照组比较菌群构成比差别。
2.6.1 三组受试者的Valid tags和OTU数量对比分析
Valid tags、OTU数量差别可反映组间细菌的丰度和细菌的物种数。结果显示菌阳组的Valid tags较菌阴组稍高，差异有统计学意义（P<0.05），而菌阴组和菌阳组的Valid tags与对照组比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）；三组受试者之间两两对比，OTU数量差异均无统计学意义（均P>0.05）。结果见图3a、b。
图3
菌阳组、菌阴组与对照组生物信息分析
a. Valid tags数量比较；b. OTU数量比较；c. Shannon指数比较。
2.6.2 三组受试者的Shannon指数及与菌阳的相关性分析
结果显示菌阳组、菌阴组、对照组平均Shannon指数分别为3.7、6.1、6.2，菌阳组较其他两组显著降低，差异有统计学意义（均P<0.001），而菌阴组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），提示菌阳组的样本中细菌物种数相对较少，物种分布的均匀性相对较低，而菌阴组与对照组样本中细菌的种类相对较多，分布较均匀。结果见图3c。支扩患者Shannon指数与菌阳的相关性分析结果显示两者呈负相关（r=−0.659，P=0.004），有统计学意义，其散点图见图4a。支扩患者Shannon指数预测细菌培养阳性的受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析结果显示，ROC曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）=0.833，P=0.015， Yonden指数J=0.74，当样本Shannon指数≤4.5时对细菌培养阳性的预测敏感性为83.3%，特异性为90.9%，结果见图4b。
2.6.3 支扩患者的BALF细菌培养结果与16S rRNA基因测序结果比较
表2中列出了基因测序的每个样本中属水平排名第一和第二的菌属与细菌培养的结果，以便进行比对。细菌培养的结果提示5例铜绿假单胞菌，1例流感嗜血杆菌，1例肺炎克雷伯菌，以细菌培养的结果为基准，发现16S rRNA基因测序属水平相对丰度第一的菌属与细菌培养结果一致的有4例（57.1%），若结合相对丰度第二的菌属一起比较与细菌培养结果一致的共有6例（85.7%）。
2.6.4 三组受试者的菌群的差异性分析
支扩菌阳组、菌阴组与对照组三组受试者的菌群的差异性分析见图5，菌阴组的各个样本与对照组的的各样本交叉小方格总体颜色偏红、黄，对应差异系数相对较小，表明菌阴组与对照组样本物种多样性的差异较小；而菌阳组内各个样本间及与菌阴组、对照组各个样本交叉小方格总体颜色偏绿、蓝，对应差异系数相对较大，表明菌阳组内各样本间及与菌阴组、对照组各样本物种多样性的差异较大。
2.7 支扩患者稳定期与急性加重期对比
2.7.1 支扩患者发生急性加重与Shannon指数的相关性
支扩患者急性加重期的患者样本16S rRNA基因检测Shannon指数显著降低，提示支扩患者急性加重与Shannon指数之间存在一定的关联，两者呈负相关（r=−0.676，P=0.003），其散点图见图6a。Shannon指数预测支扩患者发生急性加重的ROC曲线分析结果显示，AUC=0.875（P<0.001），Yonden指数J=0.78。当Shannon指数<5.0时预测支扩患者发生急性加重的敏感性为77.8%，特异性为100.0%，结果有统计学意义，具体见图6b。
2.7.2 Shannon指数与炎症指标的相关性分析
支扩患者急性加重期的患者样本16S rRNA基因检测Shannon指数显著降低，提示支扩患者急性加重与Shannon指数之间呈负相关。进一步检测Shannon指数与炎症指标之间的相关性，发现Shannon指数与C反应蛋白呈负相关（r=−0.624，P=0.007），有统计学意义，详细结果见图7。Shannon指数与血白细胞计数进行相关性分析结果提示呈负相关，r=−0.434（P=0.082），无统计学意义。结果见图8。
图8
Shannon 指数与血白细胞计数相关性散点图
3 讨论
支扩的本质是气道结构的改变引起气道黏液的间歇或持久的分泌以及细菌的反复定植和感染，引起气道炎症、阻塞和组织破坏的恶性循环。目前关于支扩气道菌群的研究相对较少，国外开展的相关研究结果一致性较低[12-14]，且目前针对中国支扩患者的气道细菌微生物组学与其临床特点的相关性研究报道较少。本研究报道了支扩患者与对照组气道细菌微生物组学的差别，并分析了支扩患者急性加重期及稳定期气道菌群微生物组学特点，以及Shannon指数与支扩患者BALF细菌培养阳性、炎症指标、发生急性加重的相关性。
研究结果显示，对照组的细菌分布与支扩患者在细菌丰度、菌群种类及多样性方面无显著差异，与文献报道基本一致[12-13]。在其他慢性气道疾病中关于气道微生物组的研究结果不一，有研究表明慢性气道疾病患者与对照组下呼吸道微生物菌群多样性及菌群丰度存在一定的差异[14]，研究结果的差异可能与纳排标准不统一、研究的病例数、样本中细菌菌群多样性个体差异较大以及留取的标本不一样有关，不同研究用的标本分别有痰液、支气管灌洗液、支气管保护性毛刷等。之前的报道中尚未见支扩组与对照组的微生物组学特点对比研究，有待更多的研究数据来进一步证实我们的结果。
本研究还明确了对照组的菌群与支扩患者菌阴组和菌阳组的菌群差异。三组菌群特点对比分析结果显示，菌阳组样本中的细菌总量较菌阴组高，菌阴组与对照组细菌总量无显著差异。Shannon指数反映细菌的数量及分配的均匀性综合指标，间接反映菌群的多样性，对比分析了三组样本的Shannon指数，结果显示菌阳组较其他两组显著降低，说明菌阳组的样本中菌群分布的均匀性相对较低，多样性较差，而菌阴组与对照组样本中细菌的分布较均匀，且两组之间的多样性无显著性差异。进一步分析支扩患者Shannon指数与BALF细菌培养菌阳的相关性，结果显示两者呈负相关，当样本Shannon指数≤4.5时对菌阳的预测的敏感性为83.3%，特异性为90.9%，该结果可为临床上常常出现细菌培养结果与肺部感染特征不相符或出现假阴性的现象提供更多参考信息。
本研究中，Heatmap 分析的结果也表明菌阴组与对照组各个样本中物种多样性的差异较小，而菌阳组的各个样本间及与菌阴组、对照组物种多样性的差异较大，提示支扩患者虽然有长期咳嗽、咳痰，甚至咳脓性痰，但样本中细菌培养阴性的患者，其菌群特点与对照组无显著差异，而菌阳组的菌群特点与上述两组比较存在显著差异，主要体现在菌阳组中菌群的多样性较低、16S rRNA基因测序结果中属水平排名第一细菌的相对丰度较高。这也解释了本研究中对照组与支扩患者在细菌种类、菌群丰度、Shannon指数差异不大的原因，可能与对照组的微生物组学特征与菌阴组类似，而菌阴组在所有支扩患者中占了58.8%的比例，导致整体上出现阴性结果。
在本研究中对支扩患者的BALF细菌培养结果与16S rRNA基因测序结果进行了比较。细菌培养提示5例铜绿假单胞菌，1例流感嗜血杆菌，1例肺炎克雷伯菌，研究也证实支扩患者以铜绿假单胞菌感染为主[15]。我们以细菌培养的结果为对照标准，发现16S rRNA基因测序属水平相对丰度第一的菌属与细菌培养结果一致的有4例（57.1%），若结合排名第二的菌属一起分析则与细菌培养结果一致的有6例（85.7%），两者较为吻合，结果还表明BALF细菌培养的结果仅能代表有生长优势的生物菌落，但不一定是细菌菌属相对丰度第一的细菌，而且培养阳性的细菌不一定就是真正的致病菌，因为细菌在培养基中的生长繁殖速度及生长竞争能力存在一定的差异性，敏感度较低、生长缓慢、代谢不典型或需要特殊培养基的微生物、细菌本身某些生化反应不典型、菌体受到损伤、药品生产过程干扰微生物的代谢均可影响鉴定准确性。而16S rRNA基因测序的分子生物学鉴定分型方法可以有效绕开微生物的培养过程，提供了样本中的全部菌落的生物信息[16]，再结合细菌培养的结果一起分析，有可能为临床医生提供更多更准确的信息。
我们在研究中将支扩患者稳定期与急性加重期OTU数量、Valid tags数量、Shannon指数对比分析，结果显示急性加重期Valid tags数量较稳定期高，提示平均细菌丰度较高；急性加重期Shannon指数值较稳定期低，表明急性加重期的支扩患者细菌的平均丰度更高、平均样本分布均匀性较低，提示患者发生急性加重的主要原因可能是某一种细菌数量的增加引起整体菌群的分布不均匀引起，这与Whelan等[17]研究团队的结果一致，但与Cox等[18]研究团队的结果不一致。我们进一步分析Shannon指数与患者发生急性加重的相关性，结果显示二者呈负相关。当Shannon指数<5.0时预测支扩患者发生急性加重敏感性为77.8%，特异性为100.0%。对Shannon指数与炎症指标之间的相关性进行分析，结果提示Shannon指数与C反应蛋白呈负相关，说明Shannon指数可以作为炎症指标的补充来反映机体的炎症水平。
本研究特点尚存在以下不足：（1）由于筛选、入组患者困难，研究的对象数量偏少，可能影响统计效能；（2）研究对象纵向观察时间较短；（3）单中心研究可能存在选择性偏倚。但本研究首次将从对照组与支扩患者的微生物组特点进行对比，且采用BALF标本，较既往大多数研究采用口咽部标本更能反映下呼吸道的微生物组特征，此为本研究的优势所在。鉴于病例搜集困难，需要进一步增加研究对象的数量、纵向观察随访的时间及进行多中心同步研究。通过本研究发现16S rRNA基因测序结果中的Shannon指数对急性加重期有一定的预测价值，16S rRNA基因测序结合细菌培养结果，有助于指导临床医生提供更精准的治疗方案。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
支气管扩张（简称支扩）以不可逆转的一个或多个支气管扩张异常破坏和持续扩张为特征，导致气道黏液间歇或持久的分泌以及细菌的持续定植和反复感染，形成气道阻塞、炎症和组织破坏的恶性循环[1]。支扩患者急性加重的症状有发热、脓痰、呼吸困难[2]，频繁加重会导致肺功能和生活质量显著下降[3]。利用传统的细菌培养技术检测到支扩患者气道常见细菌为流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌 [4]。然而，相当比例的患者即使咯脓性痰，痰培养也未能分离出任何病原菌。基于非培养基础的16S rRNA基因检测可以有效绕开微生物的纯培养过程，具有快速、准确、高效的优点，也可以从相同的标本中检测出更多种类的微生物[5]。
在既往的支扩患者气道细菌微生物组学的变化特点的研究中，有结果不支持患者病情加重是由某一种细菌过度生长所导致[1]，有结果显示急性加重期和稳定期及治疗前后气道的细菌微生物组学变化不明显[5-6]，也有研究表明支扩气道细菌微生态构成比的改变与肺功能及病情严重程度有关[7]。总之支扩患者气道微生物的结构和动态改变影响患者的临床状态和疾病进程仍没有统一的定论，故本研究假设支扩患者气道微生态的构成特点与其临床特征有一定的相关性，应用16S rRNA基因高通量测序技术结合传统细菌培养对支扩患者的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）行检测及对比分析，比较了支扩患者与对照组气道细菌微生物组学的区别，以了解支扩患者气道微生物的构成比和动态变化及其与病情加重的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集2017年10月—2018年4月华西医院呼吸与危重症医学科门诊经胸部高分辨CT确诊的支扩患者，对照组为呼吸与危重症医学科门诊因胸部小结节行支气管镜检查的患者。支扩的诊断标准：（1）支气管内腔直径大于伴发肺动脉内腔直径；（2）外周支气管无逐渐变细的特点；（3）在胸膜表面1 cm内可见周围支气管[8]。
支扩组纳入标准：（1）年龄在18～70岁；（2）至少有咳嗽、咳痰、呼吸困难中的一种症状。排除标准：（1）4周内应用抗生素治疗者；（2）4周内应用糖皮质激素治疗者；（3）存在其他呼吸道疾病；（4）存在支气管镜检查的禁忌证；⑤ 支扩继发于肺间质纤维化。对照组纳入标准：（1）年龄在18～70岁；（2）胸部单一小结节（病变直径≤10 mm）行支气管镜检查且病理学检查结果阴性的患者。对照组排除标准：（1）4周内应用抗生素治疗者；（2）4周内应用糖皮质激素治疗者；（3）存在其他呼吸系统疾病。研究方案获得四川大学华西医院伦理委员会的审核并同意批准（批件号：2017年审299号）。在试验前向所有受试对象解释本试验的目的、意义、测试项目、可能获益及安全性，取得其同意并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 支扩患者急性加重期与稳定期的定义
目前尚无统一的支扩急性加重期定义，1994年Fuchs定义的支扩急性加重标准被普遍采用：（1）咳痰量增加；（2）新发生的咯血；（3）咳嗽增加；（4）呼吸困难加重；（5）萎靡、倦怠、嗜睡；（6）体温>38 ℃；（7）厌食、体重下降；（8）副鼻窦疼痛或压痛；（9）鼻腔分泌物增加；（10）胸部听诊啰音的发生改变；（11）肺功能中用力肺活量（forced vital capacity，FVC）或第1秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second，FEV1）下降10%；（12）胸部CT提示肺部感染。存在12个指标中的4项改变确定为急性加重，需要抗生素治疗[9]。将在4周内无加重或无抗生素治疗定义为支扩稳定期[6]。
1.2.2 收集受试者BALF
患者行支气管镜检查前常规禁食、禁水8 h。操作者在操作前使用2%利多卡因对患者鼻咽部进行喷雾麻醉，心电血压及脉搏血氧饱和度的监测，然后将支气管镜经鼻腔进入咽喉部，通过会厌及声门，为避免上呼吸道分泌物的污染对结果产生影响，在此过程中禁止进行负压吸引，动作轻柔、准确、快速，进入下呼吸道支气管扩张的病变部位，在支气管镜成功楔入经胸部高分辨CT证实的病变支气管后，注入室温无菌生理盐水（20 mL/次），灌洗液注入后，需立即负压吸引回收BALF，直到总回收灌洗液约 60 mL后停止灌注。回收的灌洗液保存于无菌痰液收集管内，分装一半立即送华西医院检验科细菌室行细菌培养及药敏检查，剩余部分立即–80 ℃冰箱保存。对照组受试者检查时，留取的标本为结节病变对侧的下叶基底段支气管BALF，留取方法同支扩患者。为了减少不同批次、不同检测试剂、不同检测深度带来基因检测的误差，所有标本于2018年4月统一外送欧易生物公司检测分析。
1.2.3 BALF细菌培养
BALF细菌选择性培养基主要包括血琼脂平板培养基和巧克力色血琼脂平板培养基（郑州安图生物工程有限公司）。使用SPUTASOL将BALF均质化，并使用标准接种胶环将有意义的菌液接种至培养基上，然后将培养基置于含5%二氧化碳的37 ℃恒温培养箱中隔夜培养，使得培养基中菌落数达到30～300 cfu。对培养阴性的培养基继续进行培养，其后每天观察细菌生长情况，观察上限为4 d。
1.2.4 BALF标本16S rRNA基因测序及分析
本研究基因组DNA 的提取、 PCR 扩增及生物信息分析由上海欧易生物医学科技有限公司开展完成。
1.2.4.1 16S rRNA基因测序
首先，应用Good’s Coverage指数（Good’s nonparametic Coverage Estimator）进行全部样本的检测深度检验。Good’s Coverage指数由Esty[10]提出，目的是反映测序深度，Good’s Coverage指数接近于 1，表明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种。随后，采用DNA抽提试剂盒（Life Technologies公司，Cat.No.Q328520）对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，留取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物，在进行样品总RNA提取过程中，运用KAPA公司的HiFi Hot Start Ready Mix高保真酶进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。细菌多样性鉴定对应区域：16S V3-V4区（前端引物343F序列：5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'和后端引物798R序列：5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）。PCR产物使用电泳检测后使用磁珠纯化，纯化后作为二轮PCR模板，并进行二轮PCR扩增、电泳检测及磁珠纯化，纯化后对PCR产物进行Qubit定量。根据PCR产物浓度进行等量混样，并上机测序。
1.2.4.2 生物信息分析
由Illumina Miseq测序得出原始数据。在微生物多样性测序分析中，原始双端测序数据经过一系列质控得到较优质的序列即有效序列（Valid tags）[11]，Valid tags进行操作分类单元（Operational Taxonomic Unit，OTU）分类，挑选丰度最大的序列作为代表序列，与Silva数据库（v123）进行比对后得到OTU分类表格。使用Trimmomatic软件，采用滑动窗口法，对原始数据序列扫描，使用Flash软件，将合格的双端原始数据序列拼接，序列拼接时最大重叠为200 bp，得到完整配对结尾序列（Paired end序列）。使用Split_libraries软件去除配对结尾序列中含有N碱基的序列，去除单碱基重复大于8的序列，去除长度小于200 bp的序列，得到高质量序列（Clean tags）。使用UCHIME软件去除高质量序列中的嵌合体，最终得到用于OTU划分的Valid tags。利用Shannon指数反映细菌的数量及分配的均匀性，以间接反映菌群的多样性。菌群的差异性分析基于加权Unifrac距离算法的Heatmap差异性分析法。Heatmap差异性分析法是利用样本两两交叉比较物种的多样性，生成Heatmap图，图形方格的颜色代表交叉样品两两之间的相异系数，相异系数越小表示物种多样性的差异越小，颜色也越红。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0统计软件。用Kolmogorov-Smirnov方法测试连续变量的分布，正态分布用均值±标准差（±s）表示，非正态分布用中位数（四分位数）表示。对于正态分布，采用独立t检验或多因素方差分析，对于非正态分布采用非参数检验。分类数据以例数（百分比）表示，采用χ2检验。采用PAST（Paleontological statistics programme）V.2.16进行菌落相似性的Bray-Curtis定量指数分析，使用基于物种进化关系或数量距离矩阵的NMDS配合Anosim检验方法分析各组间微生物组Beta多样性，采用XLSTAT程序进行Mantel检验。进行两组数据的相关性分析时，若数据呈正态分布时按Pearson法进行直线相关性分析，若数据呈非正态分布时按Spearman法进行直线相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
收集了32例门诊支扩的患者，以下患者被排除：7例就诊前4周内接受过抗生素治疗的患者，1例患者就诊前4周内行全身糖皮质激素治疗，1例患者无支扩相关症状，2例患者因不能耐受行支气管镜检查， 3例患者拒绝行支气管镜检查，1例患者未签署本项研究的知情同意书。最终纳入17例支扩患者并完成临床试验，按照Fuchs标准，其中8例为稳定期，9例为急性加重期。
6例因肺部磨玻璃结节行支气管镜检查者作为对照组，留取其健侧BALF。支扩组患者与对照组患者相比较，肺功能参数差异均有统计学意义（均P<0.001），其余基本情况无显著差异。结果见表1。
表1
纳入支扩患者与对照组患者基本参数特征［例（%）/（）］
2.2 支扩患者临床特点
在纳入的支扩患者中，男性占47.1%，平均年龄为53.4岁，平均体重指数为20.9 kg/m2。其中有吸烟史的患者占23.5%，有饮酒史的患者占5.9%。支扩的病程中位数为10年。圣乔治评分为39.3分，莱切斯特咳嗽评分为12.3分，支气管扩张严重指数为8.9分。FEV1%pred为58.2%±18.9%，FVC%pred为77.8%±16.5%，FEV1/FVC为62.6%±14.8%。7例（41.2%）患者BALF细菌培养呈阳性，其中5例为铜绿假单胞菌阳性，1例为流感嗜血杆菌，1例为肺炎克雷伯菌（表2）。影像学类型：囊状支扩10例（58.8%），柱状支扩6例（35.3%），静脉曲张型支扩1例（5.9%），Reiff评分8.1分。
表2
支扩患者的BALF细菌培养结果与16S rRNA基因测序结果比较
2.3 全部样本的检测深度检验
所有样本的Good’s Coverage指数值均接近1，说明本次检测的深度已足够覆盖样本中的全部物种，可信度高，具体结果见图1。
图1
全部检测样本的Good’s Coverage指数
D：对照组。P：支扩组。其中，支扩组有2例患者进行了2次测试，1例患者进行了3次测试。
2.4 支扩组与对照组Valid tags和OTU数量比较
所有样本中共检测出1383273个Valid tags，鉴定出1893类OTU，在质控之后的Clean tags数据量分布在33922～41907之间，Clean tags经过去除嵌合体得到Valid tags数据量分布在29137～38620之间，Valid tags平均长度分布在424.21～439.7 bp，各样本OTU个数分布在282～792之间。
支扩患者的Valid tags数量为35542（31648～36495），对照组的Valid tags数量为35068（33959～35877），两组间比较，差异无统计学意义（P=0.606）。支扩患者的OTU数量为390（321～470），对照组的OTU数量为412（385～435），两组间比较，差异无统计学意义（P=0.840）。结果见图2a、b。
图2
支扩组与对照组生物信息分析
a. Valid tags数量对比；b. OTU数量对比；c. Shannon指数对比。
2.5 支扩组与对照组菌群的多样性
支扩组与对照组Shannon指数分别为5.2、6.2，支扩组Shannon指数较对照组低，但差异无统计学意义（P=0.234），见图2c。
2.6 支扩组细菌培养分类与对照组气道细菌微生物组学特点比较
为进一步明确支扩患者气道细菌微生物组学的特点，根据BALF细菌培养的结果，分为菌阳组（BALF细菌培养阳性）和菌阴组（BALF细菌培养阴性），并与对照组比较菌群构成比差别。
2.6.1 三组受试者的Valid tags和OTU数量对比分析
Valid tags、OTU数量差别可反映组间细菌的丰度和细菌的物种数。结果显示菌阳组的Valid tags较菌阴组稍高，差异有统计学意义（P<0.05），而菌阴组和菌阳组的Valid tags与对照组比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）；三组受试者之间两两对比，OTU数量差异均无统计学意义（均P>0.05）。结果见图3a、b。
图3
菌阳组、菌阴组与对照组生物信息分析
a. Valid tags数量比较；b. OTU数量比较；c. Shannon指数比较。
2.6.2 三组受试者的Shannon指数及与菌阳的相关性分析
结果显示菌阳组、菌阴组、对照组平均Shannon指数分别为3.7、6.1、6.2，菌阳组较其他两组显著降低，差异有统计学意义（均P<0.001），而菌阴组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），提示菌阳组的样本中细菌物种数相对较少，物种分布的均匀性相对较低，而菌阴组与对照组样本中细菌的种类相对较多，分布较均匀。结果见图3c。支扩患者Shannon指数与菌阳的相关性分析结果显示两者呈负相关（r=−0.659，P=0.004），有统计学意义，其散点图见图4a。支扩患者Shannon指数预测细菌培养阳性的受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析结果显示，ROC曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）=0.833，P=0.015， Yonden指数J=0.74，当样本Shannon指数≤4.5时对细菌培养阳性的预测敏感性为83.3%，特异性为90.9%，结果见图4b。
2.6.3 支扩患者的BALF细菌培养结果与16S rRNA基因测序结果比较
表2中列出了基因测序的每个样本中属水平排名第一和第二的菌属与细菌培养的结果，以便进行比对。细菌培养的结果提示5例铜绿假单胞菌，1例流感嗜血杆菌，1例肺炎克雷伯菌，以细菌培养的结果为基准，发现16S rRNA基因测序属水平相对丰度第一的菌属与细菌培养结果一致的有4例（57.1%），若结合相对丰度第二的菌属一起比较与细菌培养结果一致的共有6例（85.7%）。
2.6.4 三组受试者的菌群的差异性分析
支扩菌阳组、菌阴组与对照组三组受试者的菌群的差异性分析见图5，菌阴组的各个样本与对照组的的各样本交叉小方格总体颜色偏红、黄，对应差异系数相对较小，表明菌阴组与对照组样本物种多样性的差异较小；而菌阳组内各个样本间及与菌阴组、对照组各个样本交叉小方格总体颜色偏绿、蓝，对应差异系数相对较大，表明菌阳组内各样本间及与菌阴组、对照组各样本物种多样性的差异较大。
2.7 支扩患者稳定期与急性加重期对比
2.7.1 支扩患者发生急性加重与Shannon指数的相关性
支扩患者急性加重期的患者样本16S rRNA基因检测Shannon指数显著降低，提示支扩患者急性加重与Shannon指数之间存在一定的关联，两者呈负相关（r=−0.676，P=0.003），其散点图见图6a。Shannon指数预测支扩患者发生急性加重的ROC曲线分析结果显示，AUC=0.875（P<0.001），Yonden指数J=0.78。当Shannon指数<5.0时预测支扩患者发生急性加重的敏感性为77.8%，特异性为100.0%，结果有统计学意义，具体见图6b。
2.7.2 Shannon指数与炎症指标的相关性分析
支扩患者急性加重期的患者样本16S rRNA基因检测Shannon指数显著降低，提示支扩患者急性加重与Shannon指数之间呈负相关。进一步检测Shannon指数与炎症指标之间的相关性，发现Shannon指数与C反应蛋白呈负相关（r=−0.624，P=0.007），有统计学意义，详细结果见图7。Shannon指数与血白细胞计数进行相关性分析结果提示呈负相关，r=−0.434（P=0.082），无统计学意义。结果见图8。
图8
Shannon 指数与血白细胞计数相关性散点图
3 讨论
支扩的本质是气道结构的改变引起气道黏液的间歇或持久的分泌以及细菌的反复定植和感染，引起气道炎症、阻塞和组织破坏的恶性循环。目前关于支扩气道菌群的研究相对较少，国外开展的相关研究结果一致性较低[12-14]，且目前针对中国支扩患者的气道细菌微生物组学与其临床特点的相关性研究报道较少。本研究报道了支扩患者与对照组气道细菌微生物组学的差别，并分析了支扩患者急性加重期及稳定期气道菌群微生物组学特点，以及Shannon指数与支扩患者BALF细菌培养阳性、炎症指标、发生急性加重的相关性。
研究结果显示，对照组的细菌分布与支扩患者在细菌丰度、菌群种类及多样性方面无显著差异，与文献报道基本一致[12-13]。在其他慢性气道疾病中关于气道微生物组的研究结果不一，有研究表明慢性气道疾病患者与对照组下呼吸道微生物菌群多样性及菌群丰度存在一定的差异[14]，研究结果的差异可能与纳排标准不统一、研究的病例数、样本中细菌菌群多样性个体差异较大以及留取的标本不一样有关，不同研究用的标本分别有痰液、支气管灌洗液、支气管保护性毛刷等。之前的报道中尚未见支扩组与对照组的微生物组学特点对比研究，有待更多的研究数据来进一步证实我们的结果。
本研究还明确了对照组的菌群与支扩患者菌阴组和菌阳组的菌群差异。三组菌群特点对比分析结果显示，菌阳组样本中的细菌总量较菌阴组高，菌阴组与对照组细菌总量无显著差异。Shannon指数反映细菌的数量及分配的均匀性综合指标，间接反映菌群的多样性，对比分析了三组样本的Shannon指数，结果显示菌阳组较其他两组显著降低，说明菌阳组的样本中菌群分布的均匀性相对较低，多样性较差，而菌阴组与对照组样本中细菌的分布较均匀，且两组之间的多样性无显著性差异。进一步分析支扩患者Shannon指数与BALF细菌培养菌阳的相关性，结果显示两者呈负相关，当样本Shannon指数≤4.5时对菌阳的预测的敏感性为83.3%，特异性为90.9%，该结果可为临床上常常出现细菌培养结果与肺部感染特征不相符或出现假阴性的现象提供更多参考信息。
本研究中，Heatmap 分析的结果也表明菌阴组与对照组各个样本中物种多样性的差异较小，而菌阳组的各个样本间及与菌阴组、对照组物种多样性的差异较大，提示支扩患者虽然有长期咳嗽、咳痰，甚至咳脓性痰，但样本中细菌培养阴性的患者，其菌群特点与对照组无显著差异，而菌阳组的菌群特点与上述两组比较存在显著差异，主要体现在菌阳组中菌群的多样性较低、16S rRNA基因测序结果中属水平排名第一细菌的相对丰度较高。这也解释了本研究中对照组与支扩患者在细菌种类、菌群丰度、Shannon指数差异不大的原因，可能与对照组的微生物组学特征与菌阴组类似，而菌阴组在所有支扩患者中占了58.8%的比例，导致整体上出现阴性结果。
在本研究中对支扩患者的BALF细菌培养结果与16S rRNA基因测序结果进行了比较。细菌培养提示5例铜绿假单胞菌，1例流感嗜血杆菌，1例肺炎克雷伯菌，研究也证实支扩患者以铜绿假单胞菌感染为主[15]。我们以细菌培养的结果为对照标准，发现16S rRNA基因测序属水平相对丰度第一的菌属与细菌培养结果一致的有4例（57.1%），若结合排名第二的菌属一起分析则与细菌培养结果一致的有6例（85.7%），两者较为吻合，结果还表明BALF细菌培养的结果仅能代表有生长优势的生物菌落，但不一定是细菌菌属相对丰度第一的细菌，而且培养阳性的细菌不一定就是真正的致病菌，因为细菌在培养基中的生长繁殖速度及生长竞争能力存在一定的差异性，敏感度较低、生长缓慢、代谢不典型或需要特殊培养基的微生物、细菌本身某些生化反应不典型、菌体受到损伤、药品生产过程干扰微生物的代谢均可影响鉴定准确性。而16S rRNA基因测序的分子生物学鉴定分型方法可以有效绕开微生物的培养过程，提供了样本中的全部菌落的生物信息[16]，再结合细菌培养的结果一起分析，有可能为临床医生提供更多更准确的信息。
我们在研究中将支扩患者稳定期与急性加重期OTU数量、Valid tags数量、Shannon指数对比分析，结果显示急性加重期Valid tags数量较稳定期高，提示平均细菌丰度较高；急性加重期Shannon指数值较稳定期低，表明急性加重期的支扩患者细菌的平均丰度更高、平均样本分布均匀性较低，提示患者发生急性加重的主要原因可能是某一种细菌数量的增加引起整体菌群的分布不均匀引起，这与Whelan等[17]研究团队的结果一致，但与Cox等[18]研究团队的结果不一致。我们进一步分析Shannon指数与患者发生急性加重的相关性，结果显示二者呈负相关。当Shannon指数<5.0时预测支扩患者发生急性加重敏感性为77.8%，特异性为100.0%。对Shannon指数与炎症指标之间的相关性进行分析，结果提示Shannon指数与C反应蛋白呈负相关，说明Shannon指数可以作为炎症指标的补充来反映机体的炎症水平。
本研究特点尚存在以下不足：（1）由于筛选、入组患者困难，研究的对象数量偏少，可能影响统计效能；（2）研究对象纵向观察时间较短；（3）单中心研究可能存在选择性偏倚。但本研究首次将从对照组与支扩患者的微生物组特点进行对比，且采用BALF标本，较既往大多数研究采用口咽部标本更能反映下呼吸道的微生物组特征，此为本研究的优势所在。鉴于病例搜集困难，需要进一步增加研究对象的数量、纵向观察随访的时间及进行多中心同步研究。通过本研究发现16S rRNA基因测序结果中的Shannon指数对急性加重期有一定的预测价值，16S rRNA基因测序结合细菌培养结果，有助于指导临床医生提供更精准的治疗方案。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
