引用本文： 茆晓妍, 万宗仁, 杨丹, 马婷, 李瑶, 史鹏飞, 朱蓉. 宏基因组二代测序下慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者痰菌群研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2023, 22(3): 168-175. doi: 10.7507/1671-6205.202301011 复制
慢性阻塞性肺疾病全球倡议（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）2023指出，慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种由于气道和或肺泡异常导致的以慢性呼吸道症状和持续性（常为进展性）的气流限制为特征的异质性肺部状态[1]。慢阻肺目前是全球三大死亡原因之一，其中90%的死亡发生在中低收入国家[2]。在我国，慢阻肺是导致我国公民寿命损失年的五大原因之一[3]。慢阻肺与主动吸烟（香烟烟雾、其他类型的烟草和大麻等）及被动吸烟相关。随着发展中国家吸烟率上升和发达国家人口老龄化，预计慢阻肺患病率、发病率、病死率、经济及社会负担将在未来几十年内持续上升。慢阻肺急性加重指呼吸道症状的恶化，通常与局部及全身炎症增加有关，是慢阻肺患者住院的主要原因，并导致肺功能显著下降及病死率显著增加。慢阻肺急性加重的触发因素包括感染性(细菌和病毒)和环境（空气污染和气象效应）因素。Hilty等[4]首次通过16S核糖核苷酸测序技术使我们认识到健康人肺中含有一种传统培养方法无法检测到的复杂微生物群落。肺微生物群失调与慢阻肺的发生、气流受限程度、恶化次数及病死率有关[5-9]。痰是一种容易获得的样本，已成为微生物组研究的首选样本类型。尽管痰微生物组可能仅部分反映了呼吸道微生物组，但越来越多的证据表明慢阻肺患者痰微生物菌群结构及多样性改变与疾病严重程度、病情恶化、炎症程度和治疗方案（如吸入或全身糖皮质激素和抗生素）等因素相关[10-13]。目前，我国基于高通量测序的慢阻肺相关研究较少，本研究使用宏基因组二代测序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）分析慢阻肺患者稳定期及急性加重期痰菌群间的差异及与临床指标的关系，探究其在不明原因的慢阻肺恶化中的作用，从而指导个性化治疗。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取我院2021年12月—2022年6月间就诊或出院后随访的57例吸烟的慢阻肺患者作为研究对象，并签署知情同意书。本研究在开始前已经我院医学伦理委员会批准通过（编号YX-2021-098-01）。纳入标准：慢阻肺诊断符合最新GOLD指南诊断标准。慢阻肺稳定期患者：患者近3个月内咳嗽、咳痰或喘息症状稳定；近1个月内未使用全身糖皮质激素或抗生素。慢阻肺急性加重期患者：慢阻肺患者原有的呼吸道症状出现急性恶化，超出患者日常的变异，导致患者需要额外药物治疗。排除标准：重症肺炎、支气管扩张症、肺结核、囊性纤维化、间质性肺疾病、急性肺栓塞、急性肺水肿、急性心力衰竭、自身免疫性疾病及恶性肿瘤等；近1个月内使用抗生素及全身糖皮质激素的患者。共纳入慢阻肺稳定期患者25例（稳定组），慢阻肺急性加重期患者29例（急性加重组）。
1.2 方法
1.2.1 标本采集
稳定期患者于清晨采集痰标本，而急性加重期患者于入院后用药前采集痰标本。所有参与者咳痰前先用清水漱口，保持口腔清洁，再用0.9%生理盐水漱口3次，每次10 mL，充分冲洗口腔及咽后壁，从而减少口腔细菌污染，然后用力咳出气管深部的痰液3～5 mL。用无菌痰杯收集痰液，痰标本均经痰涂片镜检为合格痰标本后于2 h内迅速送至–80 ℃冰箱保存。由迪飞医学公司行mNGS测序。采集慢阻肺患者治疗前的血标本，检测外周血C反应蛋白水平。收集患者一般资料，包括年龄、性别、吸烟指数、体重指数（body mass index，BMI）、营养风险筛查（nutrition risk screening，NRS）2002量表评分、第1秒用力呼气容积与用力肺活量比值（forced expiratory volume in first second/forced vital capacity，FEV1/FVC）、GOLD分级、改良版英国医学研究委员会呼吸困难问卷（modified British medical research council，mMRC）、慢阻肺自我评分测试（COPD assessment test，CAT）、既往1年加重次数和既往1年住院次数。
1.2.2 mNGS测序
采用Qiagen试剂盒进行痰液核酸提取，提取的DNA经超声破碎，得到150～300 bp长度的片段。使用Qubit（Thermo Fisher Scientific，美国）和NanoDrop（Thermo Fisher Scientific，美国）评估DNA浓度和质量，使用KAPA Hyper Prep试剂盒（KAPA Biosystems，美国）制备DNA文库。对文库进行质量控制并定量文库浓度，最后在Illumina NovaSeq 6000（Illumina，美国）上进行150 bp双端测序。
1.2.3 测序分析
使用Trimmomatic工具对原始fastq数据进行过滤，从而生成高质量测序数据。使用bowtie2去除宿主序列，使用Kraken2与微生物基因组数据库比对（
1.3 统计学方法
采用R软件4.0、SPSS 25.0进行统计分析。计数资料用例数和百分比表示，比较采用皮尔森χ2检验（不超过20%的格子理论频数或期望频数T<5）或Fisher精确概率检验（超过20%的格子理论频数或期望频数T<5，或者至少1个T<1）。对计量指标进行正态性检验及方差齐性检验，满足正态分布及方差齐性的计量资料采用均数±标准差（
±s）表示，组间比较用独立样本t检验；不满足正态分布或方差齐性的计量资料采用中位数（四分位数间距）［M（Q）］，组间比较使用非参数秩和检验。Mann-Whitney U检验用于比较两组间微生物菌群丰度的差异。通过置换多元方差分析即ADONIS检验评估两组间β多样性的统计学差异，并通过主成分分析及主坐标分析实现可视化。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
稳定期慢阻肺患者25例，平均年龄68.4岁，其中男21例（84.0%）。急性加重期慢阻肺患者29例，平均年龄71岁，其中男26例（89.7%）。两组在年龄、性别、吸烟指数、BMI、NRS2002评分、FEV1/FVC和GOLD分级方面差异无统计学意义（P>0.05）。在mMRC、CAT、既往1年加重次数、既往1年住院次数及外周血C反应蛋白方面差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。
表1
入组慢阻肺患者的一般临床特征
2.2 微生物分析
2.2.1 微生物组成
选取丰度前20的物种，计算百分比，绘制物种组成柱状图（图1）。在门水平，稳定组依次为厚壁菌门（35.3%）、放线菌门（30.6%）、变形菌门（19.5%）、拟杆菌门（11.1%）和梭杆菌门（3.3%）等。急性加重组依次为放线菌门（35.2%）、厚壁菌门（32.7%）、变形菌门（24.4%）、拟杆菌门（6.0%）和梭杆菌门（1.5%）等。在属水平，稳定组链球菌属（20.4%）、罗氏菌属（15.0%）、放线菌属（9.8%）、奈瑟菌属（6.7%）、嗜血杆菌属（6.5%）、普雷沃氏菌属（6.0%）、孪生球菌（3.7%）和韦荣氏球菌（3.6%）等。急性加重组依次为罗氏菌属（23.3%）、链球菌属（18.4%）、嗜血杆菌属（8.9%）、放线菌属（8.9%）、奈瑟菌属（7.3%）、普雷沃氏菌属（3.9%）、孪生球菌（3.9%）、莫拉氏菌属（3.5%）和韦荣氏球菌（2.3%）等。在种水平，稳定组黏液罗氏菌（11.9%）、婴儿链球菌（6.2%）、Actinomyces graevenitzii（4.8%）、龋齿放线菌（4.0%）、微黄奈瑟菌（4.0%）、轻型链球菌（3.1%）、副流感嗜血杆菌（3.1%）、肺炎链球菌（2.7%）、干燥奈瑟菌（2.1%）、流感嗜血杆菌（2.0%）和Rothia aeria（0.7%）等。急性加重组黏液罗氏菌（20.1%）、流感嗜血杆菌（6.0%）、婴儿链球菌（5.6%）、龋齿放线菌（4.7%）、卡他莫拉菌（3.5%）、干燥奈瑟菌（3.3%）、微黄奈瑟菌（3.2%）、Actinomyces graevenitzii（3.2%）、轻型链球菌（2.6%）、副流感嗜血杆菌（2.4%）和Rothia aeria（2.0%）等。
图1
两组慢阻肺患者痰微生物菌群组成柱状图
a. 门水平；b. 属水平；c. 种水平
2.2.2 微生物多样性
对微生物α多样性的各指数进行分析的结果见表 2。结果显示，与稳定组比较，急性加重组痰菌群均匀度即Shannon指数显著降低（P=0.019，Mann-Whitney U检验），痰菌群丰富度即Ace、Chao1指数间差异无统计学意义（P=0.050，P=0.050，Mann-Whitney U检验）。对微生物β多样性进行分析的结果见图2。结果显示，两组间痰菌群结构间差异无统计学意义（R2=0.028，P=0.091，P=0.106，Adonis检验），PC1贡献率为8.93%，PC2贡献率为8.08%，PCoA1贡献率为18.78%，PCoA2贡献率为12.56%。
表2
两组慢阻肺患者痰菌群α多样性的各指数比较［M（Q）］
图2
两组慢阻肺患者基于Weighted Unifrac距离的主成分分析及主坐标分析
a. 主成分分析；b. 主坐标分析
2.2.3 物种相对丰度分析
采用Mann-Whitney U检验分析两组之间物种差异。在门水平，急性加重组变形菌门相对丰度较稳定组升高，但差异无统计学意义（Z=–0.147，P=0.883），梭杆菌门相对丰度较稳定组显著下降（Z=–2.669，P=0.008）（图3a）。在属水平，与稳定组比较，急性加重组梭杆菌属、嗜血杆菌属相对丰度显著下降（Z=–3.062，P=0.002；Z=–2.143，P=0.032），颗粒链球菌属相对丰度显著升高（Z=–2.186，P=0.029）（图3b）。在种水平，急性加重组Rothia aeria较稳定组略升高（Z=–0.581，P=0.561），副流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌及流感嗜血杆菌相对丰度较稳定组显著下降（Z=–2.230，P=0.026；Z=–2.125，P=0.034；Z=–2.099，P=0.036）（图3c）。其他门、属、种水平菌群差异不显著。
图3
两组慢阻肺患者痰微生物菌群相对丰度比较
a. 门水平；b. 属水平；c. 种水平
2.3 慢阻肺急性加重患者痰微生物菌群与临床指标的关系
通过Spearman相关系数分析慢阻肺急性加重痰微生物菌群与临床指标的关系，结果见表3。在慢阻肺急性加重时，痰孪生球菌属相对丰度与FEV1/FVC以及BMI呈正相关，与NRS2002评分呈负相关，痰奈瑟菌属、微黄奈瑟菌相对丰度与GOLD分级呈显著负相关，Rothia aeria相对丰度与C反应蛋白水平呈显著正相关。
表3
慢阻肺急性加重患者痰微生物菌群相对丰度与临床指标相关性分析
3 讨论
本研究使用mNGS测序法分析慢阻肺患者急性加重期痰菌群及其与临床指标的相关性。结果发现无论是在稳定期还是急性加重期，慢阻肺患者痰中常见的菌门为厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和梭杆菌门，常见的菌属为链球菌属、罗氏菌属、放线菌属、奈瑟菌属、嗜血杆菌属、普雷沃氏菌属等，这与我国研究[14-15]及国外研究[16-18]结果相似；还发现在种水平，慢阻肺患者痰液常见的细菌有黏液罗氏菌、婴儿链球菌、龋齿放线菌、微黄奈瑟菌、干燥奈瑟菌、流感嗜血杆菌及卡他莫拉菌等。其他研究发现慢阻肺急性加重患者痰菌群α多样性较稳定期患者显著下降[9，19-22]。本研究结果也显示两组间痰菌群α多样性中的均匀度即Shannon指数差异有统计学意义，但β多样性差异无统计学意义。
在健康个体中，细菌主要通过口腔微吸入或直接黏膜扩散进入肺部，与上呼吸道、口腔和上消化道等部位相比较，下呼吸道微生物与口腔微生物最相似[23-24]。健康成人口腔中常见菌门有变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门及梭杆菌门等，常见的菌种有马氏棒状杆菌、副流感嗜血杆菌、产黑色素普雷沃菌、奇异劳特普罗菌及丙酸丙酸杆菌等[25]。研究表示，与从未吸烟的人比较，吸烟者口腔微生物α多样性下降[26]。因此，吸烟可能通过改变口腔微生物菌群的丰度影响菌群间联系及其代谢功能，创造出不同的环境，从而影响口腔或呼吸道健康。Liu等[27]研究发现慢阻肺急性加重患者口咽微生物与痰微生物的分类特征相似，但显示较高的多样性。我们也发现慢阻肺吸烟者痰微生物中存在一些来源于口腔的细菌。梭杆菌门属于革兰阴性细菌，其中梭杆菌属正常寄生于口腔、消化道及泌尿生殖道等。盛美玲等[28]发现稳定期慢阻肺急性加重风险高危患者支气管肺泡灌洗液中梭杆菌门丰度显著低于低危患者。本研究发现慢阻肺急性加重患者痰梭杆菌门、梭杆菌属相对丰度较慢阻肺稳定期患者显著下降，因此可推测痰梭杆菌门及梭杆菌属减少与慢阻肺恶化相关，可能是呼吸道有益菌。颗粒链球菌属是人类口腔优势菌，可引起机会性感染。Diao等[29]发现慢阻肺稳定期患者诱导痰中此菌相对丰度较健康人显著下降。本研究发现慢阻肺急性加重患者痰中颗粒链球菌相对丰度显著高于慢阻肺稳定期患者，考虑可能受口腔微生物影响，但较难解释痰颗粒链球菌相对丰度改变与慢阻肺急性加重之间的关系。孪生球菌为人的口腔、肠道和呼吸道的专性寄生菌。本研究发现在慢阻肺急性加重时，痰中孪生球菌属低于稳定期患者，且FEV1/FVC或BMI越低，患者痰孪生球菌越少，NRS2002量表评分越高，因此认为孪生球菌在慢阻肺中可能起保护作用，具体机制尚不明确。奈瑟菌属是β-变形菌类，属于革兰阴性双球菌，其中，淋病奈瑟菌与脑膜奈瑟菌为致病菌，而干燥奈瑟菌、微黄奈瑟菌等为呼吸道中正常的寄生菌。本研究发现GOLD分级越低，患者痰奈瑟菌属（微黄奈瑟菌）越多，且急性加重患者痰奈瑟菌属（微黄奈瑟菌）低于稳定期患者，提示其减少与重度慢阻肺患者疾病恶化有关，故认为痰奈瑟菌属（微黄奈瑟菌）可能在慢阻肺中发挥有益作用。另外，本研究中慢阻肺急性加重患者嗜血杆菌属与既往1年住院次数呈显著负相关，认为慢阻肺急性加重患者痰嗜血杆菌属（流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）及卡他莫拉菌相对丰度显著低于慢阻肺患者可能受既往1年住院及治疗用药次数影响。
细菌定植在慢阻肺发病机制中具有重要作用，宿主微生物相互作用可能是慢性炎症性肺疾病的基础。呼吸道菌群延长有害的免疫应答，证实慢性细菌定植在慢阻肺发病机制中的作用[30]。另一项对肺气肿小鼠的研究表明，肺微生物群可通过增强IL-17A和自身抗体促进慢性肺部炎症[31]。Wang等[10]发现中性粒细胞性慢阻肺以嗜血杆菌为主的亚组中，痰白细胞介素（interleukin，IL）-1β和肿瘤坏死因子α升高，且随着时间的推移相对稳定；而具有平衡微生物的亚组中痰液和血清IL-17A水平升高，具有时间动态性，在病情恶化期间易受最大微生物群变化的影响；还发现嗜血杆菌与嗜酸性粒细胞向中性粒细胞炎性状态转变相关，而弯曲杆菌、孪生球菌、二氧化碳嗜纤维菌和颗粒链球菌与中性粒细胞向嗜酸性粒细胞状态转变相关。因此，监测气道微生物组的时间变异性可以跟踪患者的炎症状态。C反应蛋白是一种非特异性炎症标志物，当感染等诱发慢阻肺急性加重时，全身炎症反应加剧，C反应蛋白往往会升高。本研究发现与慢阻肺稳定期患者比较，慢阻肺急性加重患者痰Rothia aeria相对丰度升高，且与C反应蛋白呈显著正相关，故推测痰Rothia aeria增多与疾病恶化及体内炎症水平升高有关，其机制有待进一步研究。
囊性纤维化患者呼吸道中黏液罗氏菌可能通过降低IκB-α的磷酸化来抑制核因子-κB通路的激活，从而抑制炎症，提示黏液罗氏菌在呼吸道可能起有益作用[32]。但本研究发现慢阻肺急性加重患者黏液罗氏菌高于慢阻肺稳定期患者，因此该菌在体内的耐受负荷及其在慢阻肺中的作用还需进一步研究。泛福舒作为一种细菌溶解产物胶囊，含流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷白菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、卡他奈瑟菌的冻干溶解物，可通过肠–肺轴激活免疫反应，提高呼吸道免疫力，被建议用于预防呼吸道感染、慢性支气管炎及哮喘的急性发作[33-34]。痰中部分微生物可能在慢阻肺中具有免疫调节特性，进而调控体内炎症水平。但目前还需要对呼吸道微生物进行更全面更深入的研究，进一步明确宿主微生物作用机制，以制定更精准的慢阻肺防治策略。
本研究还存在以下不足：（1）研究选择痰样本，难以避免口腔污染；（2）样本量相对较少；（3）采用横断面研究，未追踪患者疾病变化及结局。此外，微生物研究个体差异性较大，且容易受气候及环境因素干扰，故研究结果存在不一致性。未来需要更大规模的研究并结合代谢组学、蛋白质组学及转录组学进一步分析微生物–宿主相互作用机制，从而指导靶向治疗。
综上所述，慢阻肺稳定期和急性加重期患者痰菌群在门、属、种水平存在显著差异，急性加重期患者痰菌群均匀度显著低于稳定期患者。痰梭杆菌门、梭杆菌属、孪生球菌属和奈瑟菌属（微黄奈瑟菌）可能在慢阻肺中发挥有益作用，而Rothia aeria可能与慢阻肺恶化有关。目前，呼吸道微生物在慢阻肺中的作用及机制尚不明确，呼吸道菌群失衡是慢阻肺急性加重的原因还是结果，这种失衡是如何与宿主炎症途径相关，以及针对呼吸道特定细菌分类群的抑制治疗是否可以减慢慢阻肺进展仍需进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
慢性阻塞性肺疾病全球倡议（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）2023指出，慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种由于气道和或肺泡异常导致的以慢性呼吸道症状和持续性（常为进展性）的气流限制为特征的异质性肺部状态[1]。慢阻肺目前是全球三大死亡原因之一，其中90%的死亡发生在中低收入国家[2]。在我国，慢阻肺是导致我国公民寿命损失年的五大原因之一[3]。慢阻肺与主动吸烟（香烟烟雾、其他类型的烟草和大麻等）及被动吸烟相关。随着发展中国家吸烟率上升和发达国家人口老龄化，预计慢阻肺患病率、发病率、病死率、经济及社会负担将在未来几十年内持续上升。慢阻肺急性加重指呼吸道症状的恶化，通常与局部及全身炎症增加有关，是慢阻肺患者住院的主要原因，并导致肺功能显著下降及病死率显著增加。慢阻肺急性加重的触发因素包括感染性(细菌和病毒)和环境（空气污染和气象效应）因素。Hilty等[4]首次通过16S核糖核苷酸测序技术使我们认识到健康人肺中含有一种传统培养方法无法检测到的复杂微生物群落。肺微生物群失调与慢阻肺的发生、气流受限程度、恶化次数及病死率有关[5-9]。痰是一种容易获得的样本，已成为微生物组研究的首选样本类型。尽管痰微生物组可能仅部分反映了呼吸道微生物组，但越来越多的证据表明慢阻肺患者痰微生物菌群结构及多样性改变与疾病严重程度、病情恶化、炎症程度和治疗方案（如吸入或全身糖皮质激素和抗生素）等因素相关[10-13]。目前，我国基于高通量测序的慢阻肺相关研究较少，本研究使用宏基因组二代测序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）分析慢阻肺患者稳定期及急性加重期痰菌群间的差异及与临床指标的关系，探究其在不明原因的慢阻肺恶化中的作用，从而指导个性化治疗。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取我院2021年12月—2022年6月间就诊或出院后随访的57例吸烟的慢阻肺患者作为研究对象，并签署知情同意书。本研究在开始前已经我院医学伦理委员会批准通过（编号YX-2021-098-01）。纳入标准：慢阻肺诊断符合最新GOLD指南诊断标准。慢阻肺稳定期患者：患者近3个月内咳嗽、咳痰或喘息症状稳定；近1个月内未使用全身糖皮质激素或抗生素。慢阻肺急性加重期患者：慢阻肺患者原有的呼吸道症状出现急性恶化，超出患者日常的变异，导致患者需要额外药物治疗。排除标准：重症肺炎、支气管扩张症、肺结核、囊性纤维化、间质性肺疾病、急性肺栓塞、急性肺水肿、急性心力衰竭、自身免疫性疾病及恶性肿瘤等；近1个月内使用抗生素及全身糖皮质激素的患者。共纳入慢阻肺稳定期患者25例（稳定组），慢阻肺急性加重期患者29例（急性加重组）。
1.2 方法
1.2.1 标本采集
稳定期患者于清晨采集痰标本，而急性加重期患者于入院后用药前采集痰标本。所有参与者咳痰前先用清水漱口，保持口腔清洁，再用0.9%生理盐水漱口3次，每次10 mL，充分冲洗口腔及咽后壁，从而减少口腔细菌污染，然后用力咳出气管深部的痰液3～5 mL。用无菌痰杯收集痰液，痰标本均经痰涂片镜检为合格痰标本后于2 h内迅速送至–80 ℃冰箱保存。由迪飞医学公司行mNGS测序。采集慢阻肺患者治疗前的血标本，检测外周血C反应蛋白水平。收集患者一般资料，包括年龄、性别、吸烟指数、体重指数（body mass index，BMI）、营养风险筛查（nutrition risk screening，NRS）2002量表评分、第1秒用力呼气容积与用力肺活量比值（forced expiratory volume in first second/forced vital capacity，FEV1/FVC）、GOLD分级、改良版英国医学研究委员会呼吸困难问卷（modified British medical research council，mMRC）、慢阻肺自我评分测试（COPD assessment test，CAT）、既往1年加重次数和既往1年住院次数。
1.2.2 mNGS测序
采用Qiagen试剂盒进行痰液核酸提取，提取的DNA经超声破碎，得到150～300 bp长度的片段。使用Qubit（Thermo Fisher Scientific，美国）和NanoDrop（Thermo Fisher Scientific，美国）评估DNA浓度和质量，使用KAPA Hyper Prep试剂盒（KAPA Biosystems，美国）制备DNA文库。对文库进行质量控制并定量文库浓度，最后在Illumina NovaSeq 6000（Illumina，美国）上进行150 bp双端测序。
1.2.3 测序分析
使用Trimmomatic工具对原始fastq数据进行过滤，从而生成高质量测序数据。使用bowtie2去除宿主序列，使用Kraken2与微生物基因组数据库比对（
1.3 统计学方法
采用R软件4.0、SPSS 25.0进行统计分析。计数资料用例数和百分比表示，比较采用皮尔森χ2检验（不超过20%的格子理论频数或期望频数T<5）或Fisher精确概率检验（超过20%的格子理论频数或期望频数T<5，或者至少1个T<1）。对计量指标进行正态性检验及方差齐性检验，满足正态分布及方差齐性的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较用独立样本t检验；不满足正态分布或方差齐性的计量资料采用中位数（四分位数间距）［M（Q）］，组间比较使用非参数秩和检验。Mann-Whitney U检验用于比较两组间微生物菌群丰度的差异。通过置换多元方差分析即ADONIS检验评估两组间β多样性的统计学差异，并通过主成分分析及主坐标分析实现可视化。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
稳定期慢阻肺患者25例，平均年龄68.4岁，其中男21例（84.0%）。急性加重期慢阻肺患者29例，平均年龄71岁，其中男26例（89.7%）。两组在年龄、性别、吸烟指数、BMI、NRS2002评分、FEV1/FVC和GOLD分级方面差异无统计学意义（P>0.05）。在mMRC、CAT、既往1年加重次数、既往1年住院次数及外周血C反应蛋白方面差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。
表1
入组慢阻肺患者的一般临床特征
2.2 微生物分析
2.2.1 微生物组成
选取丰度前20的物种，计算百分比，绘制物种组成柱状图（图1）。在门水平，稳定组依次为厚壁菌门（35.3%）、放线菌门（30.6%）、变形菌门（19.5%）、拟杆菌门（11.1%）和梭杆菌门（3.3%）等。急性加重组依次为放线菌门（35.2%）、厚壁菌门（32.7%）、变形菌门（24.4%）、拟杆菌门（6.0%）和梭杆菌门（1.5%）等。在属水平，稳定组链球菌属（20.4%）、罗氏菌属（15.0%）、放线菌属（9.8%）、奈瑟菌属（6.7%）、嗜血杆菌属（6.5%）、普雷沃氏菌属（6.0%）、孪生球菌（3.7%）和韦荣氏球菌（3.6%）等。急性加重组依次为罗氏菌属（23.3%）、链球菌属（18.4%）、嗜血杆菌属（8.9%）、放线菌属（8.9%）、奈瑟菌属（7.3%）、普雷沃氏菌属（3.9%）、孪生球菌（3.9%）、莫拉氏菌属（3.5%）和韦荣氏球菌（2.3%）等。在种水平，稳定组黏液罗氏菌（11.9%）、婴儿链球菌（6.2%）、Actinomyces graevenitzii（4.8%）、龋齿放线菌（4.0%）、微黄奈瑟菌（4.0%）、轻型链球菌（3.1%）、副流感嗜血杆菌（3.1%）、肺炎链球菌（2.7%）、干燥奈瑟菌（2.1%）、流感嗜血杆菌（2.0%）和Rothia aeria（0.7%）等。急性加重组黏液罗氏菌（20.1%）、流感嗜血杆菌（6.0%）、婴儿链球菌（5.6%）、龋齿放线菌（4.7%）、卡他莫拉菌（3.5%）、干燥奈瑟菌（3.3%）、微黄奈瑟菌（3.2%）、Actinomyces graevenitzii（3.2%）、轻型链球菌（2.6%）、副流感嗜血杆菌（2.4%）和Rothia aeria（2.0%）等。
图1
两组慢阻肺患者痰微生物菌群组成柱状图
a. 门水平；b. 属水平；c. 种水平
2.2.2 微生物多样性
对微生物α多样性的各指数进行分析的结果见表 2。结果显示，与稳定组比较，急性加重组痰菌群均匀度即Shannon指数显著降低（P=0.019，Mann-Whitney U检验），痰菌群丰富度即Ace、Chao1指数间差异无统计学意义（P=0.050，P=0.050，Mann-Whitney U检验）。对微生物β多样性进行分析的结果见图2。结果显示，两组间痰菌群结构间差异无统计学意义（R2=0.028，P=0.091，P=0.106，Adonis检验），PC1贡献率为8.93%，PC2贡献率为8.08%，PCoA1贡献率为18.78%，PCoA2贡献率为12.56%。
表2
两组慢阻肺患者痰菌群α多样性的各指数比较［M（Q）］
图2
两组慢阻肺患者基于Weighted Unifrac距离的主成分分析及主坐标分析
a. 主成分分析；b. 主坐标分析
2.2.3 物种相对丰度分析
采用Mann-Whitney U检验分析两组之间物种差异。在门水平，急性加重组变形菌门相对丰度较稳定组升高，但差异无统计学意义（Z=–0.147，P=0.883），梭杆菌门相对丰度较稳定组显著下降（Z=–2.669，P=0.008）（图3a）。在属水平，与稳定组比较，急性加重组梭杆菌属、嗜血杆菌属相对丰度显著下降（Z=–3.062，P=0.002；Z=–2.143，P=0.032），颗粒链球菌属相对丰度显著升高（Z=–2.186，P=0.029）（图3b）。在种水平，急性加重组Rothia aeria较稳定组略升高（Z=–0.581，P=0.561），副流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌及流感嗜血杆菌相对丰度较稳定组显著下降（Z=–2.230，P=0.026；Z=–2.125，P=0.034；Z=–2.099，P=0.036）（图3c）。其他门、属、种水平菌群差异不显著。
图3
两组慢阻肺患者痰微生物菌群相对丰度比较
a. 门水平；b. 属水平；c. 种水平
2.3 慢阻肺急性加重患者痰微生物菌群与临床指标的关系
通过Spearman相关系数分析慢阻肺急性加重痰微生物菌群与临床指标的关系，结果见表3。在慢阻肺急性加重时，痰孪生球菌属相对丰度与FEV1/FVC以及BMI呈正相关，与NRS2002评分呈负相关，痰奈瑟菌属、微黄奈瑟菌相对丰度与GOLD分级呈显著负相关，Rothia aeria相对丰度与C反应蛋白水平呈显著正相关。
表3
慢阻肺急性加重患者痰微生物菌群相对丰度与临床指标相关性分析
3 讨论
本研究使用mNGS测序法分析慢阻肺患者急性加重期痰菌群及其与临床指标的相关性。结果发现无论是在稳定期还是急性加重期，慢阻肺患者痰中常见的菌门为厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和梭杆菌门，常见的菌属为链球菌属、罗氏菌属、放线菌属、奈瑟菌属、嗜血杆菌属、普雷沃氏菌属等，这与我国研究[14-15]及国外研究[16-18]结果相似；还发现在种水平，慢阻肺患者痰液常见的细菌有黏液罗氏菌、婴儿链球菌、龋齿放线菌、微黄奈瑟菌、干燥奈瑟菌、流感嗜血杆菌及卡他莫拉菌等。其他研究发现慢阻肺急性加重患者痰菌群α多样性较稳定期患者显著下降[9，19-22]。本研究结果也显示两组间痰菌群α多样性中的均匀度即Shannon指数差异有统计学意义，但β多样性差异无统计学意义。
在健康个体中，细菌主要通过口腔微吸入或直接黏膜扩散进入肺部，与上呼吸道、口腔和上消化道等部位相比较，下呼吸道微生物与口腔微生物最相似[23-24]。健康成人口腔中常见菌门有变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门及梭杆菌门等，常见的菌种有马氏棒状杆菌、副流感嗜血杆菌、产黑色素普雷沃菌、奇异劳特普罗菌及丙酸丙酸杆菌等[25]。研究表示，与从未吸烟的人比较，吸烟者口腔微生物α多样性下降[26]。因此，吸烟可能通过改变口腔微生物菌群的丰度影响菌群间联系及其代谢功能，创造出不同的环境，从而影响口腔或呼吸道健康。Liu等[27]研究发现慢阻肺急性加重患者口咽微生物与痰微生物的分类特征相似，但显示较高的多样性。我们也发现慢阻肺吸烟者痰微生物中存在一些来源于口腔的细菌。梭杆菌门属于革兰阴性细菌，其中梭杆菌属正常寄生于口腔、消化道及泌尿生殖道等。盛美玲等[28]发现稳定期慢阻肺急性加重风险高危患者支气管肺泡灌洗液中梭杆菌门丰度显著低于低危患者。本研究发现慢阻肺急性加重患者痰梭杆菌门、梭杆菌属相对丰度较慢阻肺稳定期患者显著下降，因此可推测痰梭杆菌门及梭杆菌属减少与慢阻肺恶化相关，可能是呼吸道有益菌。颗粒链球菌属是人类口腔优势菌，可引起机会性感染。Diao等[29]发现慢阻肺稳定期患者诱导痰中此菌相对丰度较健康人显著下降。本研究发现慢阻肺急性加重患者痰中颗粒链球菌相对丰度显著高于慢阻肺稳定期患者，考虑可能受口腔微生物影响，但较难解释痰颗粒链球菌相对丰度改变与慢阻肺急性加重之间的关系。孪生球菌为人的口腔、肠道和呼吸道的专性寄生菌。本研究发现在慢阻肺急性加重时，痰中孪生球菌属低于稳定期患者，且FEV1/FVC或BMI越低，患者痰孪生球菌越少，NRS2002量表评分越高，因此认为孪生球菌在慢阻肺中可能起保护作用，具体机制尚不明确。奈瑟菌属是β-变形菌类，属于革兰阴性双球菌，其中，淋病奈瑟菌与脑膜奈瑟菌为致病菌，而干燥奈瑟菌、微黄奈瑟菌等为呼吸道中正常的寄生菌。本研究发现GOLD分级越低，患者痰奈瑟菌属（微黄奈瑟菌）越多，且急性加重患者痰奈瑟菌属（微黄奈瑟菌）低于稳定期患者，提示其减少与重度慢阻肺患者疾病恶化有关，故认为痰奈瑟菌属（微黄奈瑟菌）可能在慢阻肺中发挥有益作用。另外，本研究中慢阻肺急性加重患者嗜血杆菌属与既往1年住院次数呈显著负相关，认为慢阻肺急性加重患者痰嗜血杆菌属（流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）及卡他莫拉菌相对丰度显著低于慢阻肺患者可能受既往1年住院及治疗用药次数影响。
细菌定植在慢阻肺发病机制中具有重要作用，宿主微生物相互作用可能是慢性炎症性肺疾病的基础。呼吸道菌群延长有害的免疫应答，证实慢性细菌定植在慢阻肺发病机制中的作用[30]。另一项对肺气肿小鼠的研究表明，肺微生物群可通过增强IL-17A和自身抗体促进慢性肺部炎症[31]。Wang等[10]发现中性粒细胞性慢阻肺以嗜血杆菌为主的亚组中，痰白细胞介素（interleukin，IL）-1β和肿瘤坏死因子α升高，且随着时间的推移相对稳定；而具有平衡微生物的亚组中痰液和血清IL-17A水平升高，具有时间动态性，在病情恶化期间易受最大微生物群变化的影响；还发现嗜血杆菌与嗜酸性粒细胞向中性粒细胞炎性状态转变相关，而弯曲杆菌、孪生球菌、二氧化碳嗜纤维菌和颗粒链球菌与中性粒细胞向嗜酸性粒细胞状态转变相关。因此，监测气道微生物组的时间变异性可以跟踪患者的炎症状态。C反应蛋白是一种非特异性炎症标志物，当感染等诱发慢阻肺急性加重时，全身炎症反应加剧，C反应蛋白往往会升高。本研究发现与慢阻肺稳定期患者比较，慢阻肺急性加重患者痰Rothia aeria相对丰度升高，且与C反应蛋白呈显著正相关，故推测痰Rothia aeria增多与疾病恶化及体内炎症水平升高有关，其机制有待进一步研究。
囊性纤维化患者呼吸道中黏液罗氏菌可能通过降低IκB-α的磷酸化来抑制核因子-κB通路的激活，从而抑制炎症，提示黏液罗氏菌在呼吸道可能起有益作用[32]。但本研究发现慢阻肺急性加重患者黏液罗氏菌高于慢阻肺稳定期患者，因此该菌在体内的耐受负荷及其在慢阻肺中的作用还需进一步研究。泛福舒作为一种细菌溶解产物胶囊，含流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷白菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、卡他奈瑟菌的冻干溶解物，可通过肠–肺轴激活免疫反应，提高呼吸道免疫力，被建议用于预防呼吸道感染、慢性支气管炎及哮喘的急性发作[33-34]。痰中部分微生物可能在慢阻肺中具有免疫调节特性，进而调控体内炎症水平。但目前还需要对呼吸道微生物进行更全面更深入的研究，进一步明确宿主微生物作用机制，以制定更精准的慢阻肺防治策略。
本研究还存在以下不足：（1）研究选择痰样本，难以避免口腔污染；（2）样本量相对较少；（3）采用横断面研究，未追踪患者疾病变化及结局。此外，微生物研究个体差异性较大，且容易受气候及环境因素干扰，故研究结果存在不一致性。未来需要更大规模的研究并结合代谢组学、蛋白质组学及转录组学进一步分析微生物–宿主相互作用机制，从而指导靶向治疗。
综上所述，慢阻肺稳定期和急性加重期患者痰菌群在门、属、种水平存在显著差异，急性加重期患者痰菌群均匀度显著低于稳定期患者。痰梭杆菌门、梭杆菌属、孪生球菌属和奈瑟菌属（微黄奈瑟菌）可能在慢阻肺中发挥有益作用，而Rothia aeria可能与慢阻肺恶化有关。目前，呼吸道微生物在慢阻肺中的作用及机制尚不明确，呼吸道菌群失衡是慢阻肺急性加重的原因还是结果，这种失衡是如何与宿主炎症途径相关，以及针对呼吸道特定细菌分类群的抑制治疗是否可以减慢慢阻肺进展仍需进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
