引用本文： 徐标, 李文华, 吴威, 高锐, 胡洪琳, 王继武. 盐酸纳美芬缺血后处理抑制TLR2/MyD88/NF-κB p65炎症信号途径减轻大鼠肺缺血–再灌注损伤作用的研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2023, 22(6): 431-436. doi: 10.7507/1671-6205.202304066 复制
肺缺血–再灌注损伤与心肺复苏、肺栓塞等危重症患者预后不良有关。缺血–再灌注可产生大量活性氧物质和促炎细胞因子，破坏肺泡上皮细胞和内皮屏障，导致肺水肿和肺泡气体交换障碍[1-3]。目前对肺缺血–再灌注损伤的药物研究多集中于缺血期前给药，然而临床上时常需面对已经发生肺组织缺血或者再灌注损伤的病理状态，目前研究报道较少关注这一状态。TLR2/MyD88/NF-κB信号途径在肺缺血–再灌注损伤中发挥重要作用[4]，Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）、MyD88、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）表达与肺组织中炎症程度呈正相关性[5]。在急诊医学领域广泛应用的盐酸纳美芬（纳曲酮类似物）是一种特异性μ、κ、α阿片受体阻断剂，可逆转阿片药物导致的呼吸抑制，具有抗休克、治疗酒精中毒以及吗啡类药物中毒等作用，目前已广泛应用于急性呼吸衰竭等临床急重症的治疗[6]。研究发现纳美芬可通过抑制Toll样受体4表达减轻肺缺血–再灌注损伤[7]，但具体信号通路尚不清楚。TLR2和Toll样受体4结构上存在相似性。因此，本研究将纳美芬应用于肺缺血–再灌注损伤大鼠缺血后处理，探讨纳美芬通过抑制TLR2、MyD88和NF-κB p65相关靶点减轻肺缺血–再灌注损伤的作用和时间–效应性特点。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要药物、试剂
选取体质量为150～250 g的雄性清洁级Sprague Dawley大鼠60只，饲养于规范标准环境中，动物许可证号：SCXK（鄂）2010-0009。本研究关于动物的饲养、处置和操作符合本院伦理委员会关于实验动物福利与伦理要求。盐酸纳美芬注射液，规格1 mL∶0.1 mg，成都天台山制药有限公司提供。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。逆转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）试剂盒购自大连Takara公司。兔抗大鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65（即磷酸化NF-κB p65二聚体）、GAPDH单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。BCA试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试验试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 动物模型建立、分组与给药
将60只大鼠随机（采用随机数字表法）均分为6组，每组10只。（1）假手术组：只开胸游离左肺门，不行缺血再灌注处理。（2）模型组：参考项冰倩等[8]方法，用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，气管插管后使用啮齿动物呼吸机对大鼠进行通气，呼吸频率设置为120次/min，吸气/呼气比设置为1∶2，用无创钳夹断左肺门，造成肺缺血。缺血45 min后松开钳夹，左肺再灌注3 h。在实验结束时脊椎脱臼处死大鼠，收集左肺上叶组织标本待检。（3）纳美芬A组：根据本研究预实验结果确定给药时间以及参考本课题组既往研究[9]确定给药剂量，于肺循环再灌注前5 min时尾静脉注射纳美芬（15 μg/kg，剂量下同），余处理同模型组（方法下同）。（4）纳美芬B组：于肺循环再灌注后10 min时尾静脉注射纳美芬。（5）纳美芬C组：于肺循环再灌注后30 min时尾静脉注射纳美芬。（6）纳美芬D组：于肺循环再灌注后60 min时尾静脉注射纳美芬。
1.2.2 大鼠肺组织湿/干重比值测定
再灌注3 h后取出左肺组织并立即称重以确定湿重，然后置于 60 ℃ 烘箱中3 d并再次称重直至达到恒定质量以确定干重，计算湿/干重比值以评估肺水肿严重程度。
1.2.3 大鼠肺组织病理学观察及肺组织损伤评分
病理切片经苏木精–伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后观察肺组织形态改变。肺组织损伤分级评分标准[10]：0级（1分），外观正常；1级（2分），轻度的间质充血和中性粒细胞浸润；2级（3分），血管周围水肿形成，肺结构部分破坏，中性粒细胞中度浸润；3级（4分），肺结构完全破坏，肺泡内明显渗出或出血，中性粒细胞致密浸润。每组大鼠均检测10个样本切片。每个样本切片随机选取10个视野（×200）评分，取平均值为该样本肺组织损伤评分。
1.2.4 大鼠肺组织TNF-α水平、MPO活性测定
左肺上叶组织经生理盐水清洗后以滤纸吸干，剪取50 mg，匀浆器制成肺组织匀浆，按照TNF-α、MPO检测试剂盒检测TNF-α水平、MPO活性。
1.2.5 RT-PCR检测大鼠肺组织TLR2 mRNA和MyD88 mRNA
用Trizol试剂提取总RNA。RNA浓度用紫外分光光度计检测，260～280 nm处适宜的OD值为1.8～2.0。逆转录反应的总体系为10 mL（1 mg RNA），根据产品说明合成cDNA。PCR引物由中国上海生工生物技术公司合成，序列如下：TLR2（扩增产物96 bp），正向5'-GACTCTGGAAGCAGGTGACA-3′，反向5′-CAGTCAACCAGGACATGGAC-3′。MyD88（扩增产物191 bp），正向5'-AGCCTTGTTAGACCGTGAG-3'，反向：5'-GCAGATAGTGATGAACCGTAG-3'，β-肌动蛋白（内参照，扩增产物281 bp），正向5'-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'，反向5'-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 30 s，65 °C 34 s，72 °C 1 min（40个循环）。终产物TLR2 mRNA和MyD88 mRNA相对表达水平的计算公式为2–ΔΔCt法。
1.2.6 免疫印迹（Western blot）检测大鼠肺组织TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达
从肺组织中提取蛋白质，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。用BCA试剂盒量化蛋白质含量。每份蛋白质样品提取50 μg在10%SDS-PAGE凝胶中进行电泳并转移到PVDF膜上。将印迹与TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH单克隆一抗在用5%脱脂奶粉封闭后在4℃下过夜。将印迹在TBST中洗涤并在室温下与二抗孵育2 h。条带由ECL试剂盒发光显影，并使用Image J 软件检查条带强度。
1.3 统计学方法
数据采用SPSS 19.0 软件进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（
±s）表示，单向方差分析比较组间差异后行LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠肺组织湿/干重比值
在湿/干重比值方面，模型组检测值显著高于假手术组（P<0.01）；纳美芬D组检测值与模型组比较，差异无统计学意义（P >0.05），纳美芬缺血后处理各组检测值呈现为纳美芬D组>纳美芬C组>纳美芬B组>纳美芬A组，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表1。
表1
各组大鼠动脉肺组织湿/干重比值、肺损伤评分、MPO活性、TNF-α表达（
，n=10）
2.2 大鼠肺组织病理变化及肺损伤评分
假手术肺组织未见明显组织损伤。模型组、纳美芬A、B、C、D组均可见不同程度的肺泡间隔破坏，肺间质水肿明显，间质内炎症细胞浸润和红细胞渗出，部分肺泡萎陷。在肺组织损伤评分方面，模型组评分显著高于假手术组（P<0.01）；纳美芬D组评分与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），纳美芬缺血后处理各组评分呈现纳美芬D组>纳美芬C组>纳美芬B组>纳美芬A组的特点，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图1和表1。
图1
各组大鼠肺组织病理检查像（HE×200）
a. 假手术组；b. 纳美芬A组；c. 纳美芬B组；d. 纳美芬C组；e. 纳美芬D组；f. 模型组。间质水肿、炎症细胞浸润（黑箭）。
2.3 大鼠肺组织MPO活性和TNF-α表达水平
在肺组织MPO活性和TNF-α表达水平方面，模型组各检测值显著高于假手术组（P<0.01）；纳美芬D组各检测值与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），纳美芬缺血后处理各组相应检测值呈现为纳美芬D组>纳美芬C组>纳美芬B组>纳美芬A组，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表1。
2.4 大鼠肺组织TLR2和 MyD88 mRNA表达水平
在肺组织TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表达水平方面，模型组各检测值高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.01）；纳美芬D组各检测值与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；纳美芬缺血后处理各组相应检测值呈现纳美芬D组>纳美芬C组>纳美芬B组>纳美芬A组的特点，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图2和表2。
图2
大鼠肺组织TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表达水平
a. TLR2 mRNA；b. MyD88 mRNA。M：标记；1：模型组；2：纳美芬D组；3：纳美芬C组；4：纳美芬B组；5：纳美芬A组；6：假手术组；7：模型组内参照；8：纳美芬D组内参照；9：纳美芬C组内参照；10：纳美芬B组内参照；11：纳美芬A组内参照；12：假手术组内参照。
表2
大鼠肺组织TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表达水平（
，n=10）
2.5 大鼠肺组织TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κBp65表达水平
在肺组织TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平等方面，模型组各检测值高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.01）；纳美芬D组各检测值与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；纳美芬缺血后处理各组相应检测值呈现为纳美芬D组>纳美芬C组>纳美芬B组>纳美芬A组的特点，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图3和表3。
图3
各组大鼠肺组织TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达（Western blot）
1：模型组；2：纳美芬D组；3：纳美芬C组；4：纳美芬B组；5：纳美芬A组；6：假手术组。
表3
各组大鼠肺组织TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平（
，n=10）
3 讨论
本研究将盐酸纳美芬应用于大鼠肺缺血–再灌注损伤模型的缺血后处理，发现应用纳美芬缺血后处理可能通过抑制TLR2/MyD88/NF-κB信号途径减轻肺缺血–再灌注损伤，在缺血后处理的全病程中存在最佳药物治疗时机和有效给药时间窗。作为Toll样受体众多家族成员，TLR2在肺组织中有丰富表达[11]。膜识别受体TLR2介导的信号通路可以通过MyD88依赖途径诱导NF-κB磷酸化[12]，NF-κB信号通路是主要的炎症信号转导通路之一[13]。在生理状况下NF-κB p65与抑制蛋白IκB结合处于被抑制状态。炎症反应时TLR2被激活后，通过一系列级联反应激活NF-κB p65并由细胞质移位至细胞核，与促炎基因的启动子结合，通过释放各种炎性因子来放大炎症反应[14-15]。
高肺液含量是急性肺损伤的特征[16]。MPO活性是组织中性粒细胞浸润的标志物[17]。活化的单核–巨噬细胞可产生关键的促炎因子TNF-α，使中性粒细胞活化、聚集，并诱导如白细胞介素-6等炎症因子瀑布式释放，造成组织严重损伤[18]。因此MPO活性和TNF-α表达水平可间接反映炎症反应严重程度[19]。本研究发现在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min给予纳美芬可显著抑制肺组织MPO活性和TNF-α表达，减轻肺组织损伤，因而推测纳美芬可能通过间接抑制与中性粒细胞、巨噬细胞的相关炎症反应来减轻肺组织缺血–再灌注损伤。
本研究还发现缺血–再灌注损伤后肺组织中的TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达显著升高，肺组织炎症及病理损伤程度也随之加重，提示TLR2、MyD88、NF-κB p65表达增加以及NF-κB p65磷酸化、活化与缺血–再灌注损伤后肺组织中炎症程度呈正相关性。在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min时给予纳美芬治疗均能显著降低TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平，减轻肺组织炎症及病理损伤程度，但由于三者治疗时机不同，肺组织中TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平显著不同，肺组织炎症程度也随之不同。既往研究显示纳美芬减轻肺缺血–再灌注损伤的机制存在多样性（如TLR4途径等），本研究提示纳美芬可能部分通过抑制TLR2、MyD88、NF-κB p65表达以及NF-κB p65磷酸化来减轻肺组织炎症反应。
除器官移植方面外，临床上器官缺血的发生常不可预知，心肺复苏等病理生理过程中再灌注的发生时间窗也很难把握，因而目前在防治器官缺血–再灌注损伤时缺血前处理在实践中应用受限，缺血后处理（如药物治疗）却具有简单方便、操作性好的特点。既往研究表明多种方式的缺血后处理均能表现出对再灌注器官的保护效应，但缺血后处理有特定的时间窗和保护条件[20-21]。缺血–再灌注损伤不仅发生在缺血的当时，更重要的是发生在血流恢复灌注后，只有抓住这个时间窗及时治疗才能更好地防治器官再灌注损伤。在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min时给予纳美芬治疗均能显著降低TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平，减轻肺组织炎症及病理损伤程度。肺组织炎症及病理损伤程度呈现为：再灌注前5 min<再灌注后10 min<再灌注后30 min，提示提示纳美芬抑制肺组织缺血再灌注损伤炎症反应可能存在给药时间-效应性特点，肺组织缺血–再灌注损伤后尽早给药可提高治疗效果。值得注意的是，在再灌注后60 min时给予同等剂量纳美芬治疗，肺组织中TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平及肺组织炎症程度与模型组并无显著差别，提示纳美芬可能在某一给药剂量下存在特定有效时间窗口。推测此现象的可能原因为随着再灌注后时间延长，肺组织炎症反应逐步加重，很可能在某一时间临界点触发“炎症因子风暴”等局部炎症过程，此时此剂量下的纳美芬治疗难以逆转炎症发展的进程。当然药物作用的动物种属不同（如作用于人类），药物作用的剂量不同是否会影响肺组织缺血–再灌注损伤时纳美芬治疗时间窗的数值尚不清楚。在临床上纳美芬治疗肺组织缺血–再灌注损伤有效给药时间窗的确定以及能否通过增大药物剂量来延长时间窗也尚待进一步深入研究。
综上所述，本研究在既往研究的基础上进一步丰富了纳美芬缺血后处理减轻肺组织缺血–再灌注损伤的作用机制和特点，为开发肺血栓栓塞症、心源性猝死后复苏等发生肺缺血再灌注损伤疾病的治疗提供了基础研究依据，为进一步拓展盐酸纳美芬在急诊医学领域的临床新用途奠定了研究基础。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
肺缺血–再灌注损伤与心肺复苏、肺栓塞等危重症患者预后不良有关。缺血–再灌注可产生大量活性氧物质和促炎细胞因子，破坏肺泡上皮细胞和内皮屏障，导致肺水肿和肺泡气体交换障碍[1-3]。目前对肺缺血–再灌注损伤的药物研究多集中于缺血期前给药，然而临床上时常需面对已经发生肺组织缺血或者再灌注损伤的病理状态，目前研究报道较少关注这一状态。TLR2/MyD88/NF-κB信号途径在肺缺血–再灌注损伤中发挥重要作用[4]，Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）、MyD88、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）表达与肺组织中炎症程度呈正相关性[5]。在急诊医学领域广泛应用的盐酸纳美芬（纳曲酮类似物）是一种特异性μ、κ、α阿片受体阻断剂，可逆转阿片药物导致的呼吸抑制，具有抗休克、治疗酒精中毒以及吗啡类药物中毒等作用，目前已广泛应用于急性呼吸衰竭等临床急重症的治疗[6]。研究发现纳美芬可通过抑制Toll样受体4表达减轻肺缺血–再灌注损伤[7]，但具体信号通路尚不清楚。TLR2和Toll样受体4结构上存在相似性。因此，本研究将纳美芬应用于肺缺血–再灌注损伤大鼠缺血后处理，探讨纳美芬通过抑制TLR2、MyD88和NF-κB p65相关靶点减轻肺缺血–再灌注损伤的作用和时间–效应性特点。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要药物、试剂
选取体质量为150～250 g的雄性清洁级Sprague Dawley大鼠60只，饲养于规范标准环境中，动物许可证号：SCXK（鄂）2010-0009。本研究关于动物的饲养、处置和操作符合本院伦理委员会关于实验动物福利与伦理要求。盐酸纳美芬注射液，规格1 mL∶0.1 mg，成都天台山制药有限公司提供。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。逆转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）试剂盒购自大连Takara公司。兔抗大鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65（即磷酸化NF-κB p65二聚体）、GAPDH单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。BCA试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试验试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 动物模型建立、分组与给药
将60只大鼠随机（采用随机数字表法）均分为6组，每组10只。（1）假手术组：只开胸游离左肺门，不行缺血再灌注处理。（2）模型组：参考项冰倩等[8]方法，用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，气管插管后使用啮齿动物呼吸机对大鼠进行通气，呼吸频率设置为120次/min，吸气/呼气比设置为1∶2，用无创钳夹断左肺门，造成肺缺血。缺血45 min后松开钳夹，左肺再灌注3 h。在实验结束时脊椎脱臼处死大鼠，收集左肺上叶组织标本待检。（3）纳美芬A组：根据本研究预实验结果确定给药时间以及参考本课题组既往研究[9]确定给药剂量，于肺循环再灌注前5 min时尾静脉注射纳美芬（15 μg/kg，剂量下同），余处理同模型组（方法下同）。（4）纳美芬B组：于肺循环再灌注后10 min时尾静脉注射纳美芬。（5）纳美芬C组：于肺循环再灌注后30 min时尾静脉注射纳美芬。（6）纳美芬D组：于肺循环再灌注后60 min时尾静脉注射纳美芬。
1.2.2 大鼠肺组织湿/干重比值测定
再灌注3 h后取出左肺组织并立即称重以确定湿重，然后置于 60 ℃ 烘箱中3 d并再次称重直至达到恒定质量以确定干重，计算湿/干重比值以评估肺水肿严重程度。
1.2.3 大鼠肺组织病理学观察及肺组织损伤评分
病理切片经苏木精–伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后观察肺组织形态改变。肺组织损伤分级评分标准[10]：0级（1分），外观正常；1级（2分），轻度的间质充血和中性粒细胞浸润；2级（3分），血管周围水肿形成，肺结构部分破坏，中性粒细胞中度浸润；3级（4分），肺结构完全破坏，肺泡内明显渗出或出血，中性粒细胞致密浸润。每组大鼠均检测10个样本切片。每个样本切片随机选取10个视野（×200）评分，取平均值为该样本肺组织损伤评分。
1.2.4 大鼠肺组织TNF-α水平、MPO活性测定
左肺上叶组织经生理盐水清洗后以滤纸吸干，剪取50 mg，匀浆器制成肺组织匀浆，按照TNF-α、MPO检测试剂盒检测TNF-α水平、MPO活性。
1.2.5 RT-PCR检测大鼠肺组织TLR2 mRNA和MyD88 mRNA
用Trizol试剂提取总RNA。RNA浓度用紫外分光光度计检测，260～280 nm处适宜的OD值为1.8～2.0。逆转录反应的总体系为10 mL（1 mg RNA），根据产品说明合成cDNA。PCR引物由中国上海生工生物技术公司合成，序列如下：TLR2（扩增产物96 bp），正向5'-GACTCTGGAAGCAGGTGACA-3′，反向5′-CAGTCAACCAGGACATGGAC-3′。MyD88（扩增产物191 bp），正向5'-AGCCTTGTTAGACCGTGAG-3'，反向：5'-GCAGATAGTGATGAACCGTAG-3'，β-肌动蛋白（内参照，扩增产物281 bp），正向5'-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'，反向5'-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 30 s，65 °C 34 s，72 °C 1 min（40个循环）。终产物TLR2 mRNA和MyD88 mRNA相对表达水平的计算公式为2–ΔΔCt法。
1.2.6 免疫印迹（Western blot）检测大鼠肺组织TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达
从肺组织中提取蛋白质，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。用BCA试剂盒量化蛋白质含量。每份蛋白质样品提取50 μg在10%SDS-PAGE凝胶中进行电泳并转移到PVDF膜上。将印迹与TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH单克隆一抗在用5%脱脂奶粉封闭后在4℃下过夜。将印迹在TBST中洗涤并在室温下与二抗孵育2 h。条带由ECL试剂盒发光显影，并使用Image J 软件检查条带强度。
1.3 统计学方法
数据采用SPSS 19.0 软件进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，单向方差分析比较组间差异后行LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠肺组织湿/干重比值
在湿/干重比值方面，模型组检测值显著高于假手术组（P<0.01）；纳美芬D组检测值与模型组比较，差异无统计学意义（P >0.05），纳美芬缺血后处理各组检测值呈现为纳美芬D组>纳美芬C组>纳美芬B组>纳美芬A组，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表1。
表1
各组大鼠动脉肺组织湿/干重比值、肺损伤评分、MPO活性、TNF-α表达（，n=10）
2.2 大鼠肺组织病理变化及肺损伤评分
假手术肺组织未见明显组织损伤。模型组、纳美芬A、B、C、D组均可见不同程度的肺泡间隔破坏，肺间质水肿明显，间质内炎症细胞浸润和红细胞渗出，部分肺泡萎陷。在肺组织损伤评分方面，模型组评分显著高于假手术组（P<0.01）；纳美芬D组评分与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），纳美芬缺血后处理各组评分呈现纳美芬D组>纳美芬C组>纳美芬B组>纳美芬A组的特点，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图1和表1。
图1
各组大鼠肺组织病理检查像（HE×200）
a. 假手术组；b. 纳美芬A组；c. 纳美芬B组；d. 纳美芬C组；e. 纳美芬D组；f. 模型组。间质水肿、炎症细胞浸润（黑箭）。
2.3 大鼠肺组织MPO活性和TNF-α表达水平
在肺组织MPO活性和TNF-α表达水平方面，模型组各检测值显著高于假手术组（P<0.01）；纳美芬D组各检测值与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），纳美芬缺血后处理各组相应检测值呈现为纳美芬D组>纳美芬C组>纳美芬B组>纳美芬A组，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表1。
2.4 大鼠肺组织TLR2和 MyD88 mRNA表达水平
在肺组织TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表达水平方面，模型组各检测值高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.01）；纳美芬D组各检测值与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；纳美芬缺血后处理各组相应检测值呈现纳美芬D组>纳美芬C组>纳美芬B组>纳美芬A组的特点，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图2和表2。
图2
大鼠肺组织TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表达水平
a. TLR2 mRNA；b. MyD88 mRNA。M：标记；1：模型组；2：纳美芬D组；3：纳美芬C组；4：纳美芬B组；5：纳美芬A组；6：假手术组；7：模型组内参照；8：纳美芬D组内参照；9：纳美芬C组内参照；10：纳美芬B组内参照；11：纳美芬A组内参照；12：假手术组内参照。
表2
大鼠肺组织TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表达水平（，n=10）
2.5 大鼠肺组织TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κBp65表达水平
在肺组织TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平等方面，模型组各检测值高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.01）；纳美芬D组各检测值与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；纳美芬缺血后处理各组相应检测值呈现为纳美芬D组>纳美芬C组>纳美芬B组>纳美芬A组的特点，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图3和表3。
图3
各组大鼠肺组织TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达（Western blot）
1：模型组；2：纳美芬D组；3：纳美芬C组；4：纳美芬B组；5：纳美芬A组；6：假手术组。
表3
各组大鼠肺组织TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平（，n=10）
3 讨论
本研究将盐酸纳美芬应用于大鼠肺缺血–再灌注损伤模型的缺血后处理，发现应用纳美芬缺血后处理可能通过抑制TLR2/MyD88/NF-κB信号途径减轻肺缺血–再灌注损伤，在缺血后处理的全病程中存在最佳药物治疗时机和有效给药时间窗。作为Toll样受体众多家族成员，TLR2在肺组织中有丰富表达[11]。膜识别受体TLR2介导的信号通路可以通过MyD88依赖途径诱导NF-κB磷酸化[12]，NF-κB信号通路是主要的炎症信号转导通路之一[13]。在生理状况下NF-κB p65与抑制蛋白IκB结合处于被抑制状态。炎症反应时TLR2被激活后，通过一系列级联反应激活NF-κB p65并由细胞质移位至细胞核，与促炎基因的启动子结合，通过释放各种炎性因子来放大炎症反应[14-15]。
高肺液含量是急性肺损伤的特征[16]。MPO活性是组织中性粒细胞浸润的标志物[17]。活化的单核–巨噬细胞可产生关键的促炎因子TNF-α，使中性粒细胞活化、聚集，并诱导如白细胞介素-6等炎症因子瀑布式释放，造成组织严重损伤[18]。因此MPO活性和TNF-α表达水平可间接反映炎症反应严重程度[19]。本研究发现在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min给予纳美芬可显著抑制肺组织MPO活性和TNF-α表达，减轻肺组织损伤，因而推测纳美芬可能通过间接抑制与中性粒细胞、巨噬细胞的相关炎症反应来减轻肺组织缺血–再灌注损伤。
本研究还发现缺血–再灌注损伤后肺组织中的TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达显著升高，肺组织炎症及病理损伤程度也随之加重，提示TLR2、MyD88、NF-κB p65表达增加以及NF-κB p65磷酸化、活化与缺血–再灌注损伤后肺组织中炎症程度呈正相关性。在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min时给予纳美芬治疗均能显著降低TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平，减轻肺组织炎症及病理损伤程度，但由于三者治疗时机不同，肺组织中TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平显著不同，肺组织炎症程度也随之不同。既往研究显示纳美芬减轻肺缺血–再灌注损伤的机制存在多样性（如TLR4途径等），本研究提示纳美芬可能部分通过抑制TLR2、MyD88、NF-κB p65表达以及NF-κB p65磷酸化来减轻肺组织炎症反应。
除器官移植方面外，临床上器官缺血的发生常不可预知，心肺复苏等病理生理过程中再灌注的发生时间窗也很难把握，因而目前在防治器官缺血–再灌注损伤时缺血前处理在实践中应用受限，缺血后处理（如药物治疗）却具有简单方便、操作性好的特点。既往研究表明多种方式的缺血后处理均能表现出对再灌注器官的保护效应，但缺血后处理有特定的时间窗和保护条件[20-21]。缺血–再灌注损伤不仅发生在缺血的当时，更重要的是发生在血流恢复灌注后，只有抓住这个时间窗及时治疗才能更好地防治器官再灌注损伤。在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min时给予纳美芬治疗均能显著降低TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平，减轻肺组织炎症及病理损伤程度。肺组织炎症及病理损伤程度呈现为：再灌注前5 min<再灌注后10 min<再灌注后30 min，提示提示纳美芬抑制肺组织缺血再灌注损伤炎症反应可能存在给药时间-效应性特点，肺组织缺血–再灌注损伤后尽早给药可提高治疗效果。值得注意的是，在再灌注后60 min时给予同等剂量纳美芬治疗，肺组织中TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平及肺组织炎症程度与模型组并无显著差别，提示纳美芬可能在某一给药剂量下存在特定有效时间窗口。推测此现象的可能原因为随着再灌注后时间延长，肺组织炎症反应逐步加重，很可能在某一时间临界点触发“炎症因子风暴”等局部炎症过程，此时此剂量下的纳美芬治疗难以逆转炎症发展的进程。当然药物作用的动物种属不同（如作用于人类），药物作用的剂量不同是否会影响肺组织缺血–再灌注损伤时纳美芬治疗时间窗的数值尚不清楚。在临床上纳美芬治疗肺组织缺血–再灌注损伤有效给药时间窗的确定以及能否通过增大药物剂量来延长时间窗也尚待进一步深入研究。
综上所述，本研究在既往研究的基础上进一步丰富了纳美芬缺血后处理减轻肺组织缺血–再灌注损伤的作用机制和特点，为开发肺血栓栓塞症、心源性猝死后复苏等发生肺缺血再灌注损伤疾病的治疗提供了基础研究依据，为进一步拓展盐酸纳美芬在急诊医学领域的临床新用途奠定了研究基础。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
