引用本文： 徐锋, 范林林, 康霞, 刘洋洋, 韦海涛, 李丽. LINC00626通过JAK1/STAT3/KHSRP信号轴调控肺腺癌转移的恶性进展. 中国呼吸与危重监护杂志, 2023, 22(9): 646-656. doi: 10.7507/1671-6205.202306023 复制
肺癌是世界上病死率第一的恶性肿瘤[1]。肺腺癌是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中最常见的病理类型，发病率和病死率都很高。尽管手术、化疗和分子靶向使肺腺癌治疗取得较大进展，但肺癌预后仍不令人满意[2]。由于肺腺癌有不同的治疗结局和反应，故寻找诊断和治疗的分子标志物尤为重要[3-4]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）的失调是所有癌症中常见现象，已成为人类癌症中关键调节因子[5]。LncRNA在细胞周期、增殖、迁移、凋亡、侵袭和转移等进程中发挥重要作用[6-7]。LncRNA FAM83A-AS1可以促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭和肺腺癌细胞系中的糖酵解。敲降FAM83A-AS1可以抑制肿瘤生长，抑制缺氧诱导因子-1α和糖酵解相关基因在体内的表达[8]。LncRNA RP11-10A14.5主要分布在肺癌细胞质中，可以促进肺腺癌细胞生长和转移，并与临床分期和不良生存结局相关[9]。LncRNA DARS-AS1是一种促癌基因，在肺腺癌中高表达，可通过抑制miR-188-5p增强肺腺癌的增殖、侵袭和迁移[10]。李静等[4]通过对89例NSCLC患者肺癌组织和癌旁组织进行定量聚合酶链式反应（quantitative polymerasechain reaction，qPCR），发现LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC组织中高表达，且与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期及吸烟史密切相关。因此，lncRNA不仅是癌症早期诊断和精准预测的潜在生物标志物，也可能是新的分子治疗靶点[11]。本研究经过数据库及预实验筛选得到目的基因LINC00626，位于1q24,2位置。经文献检索发现LINC00626在胃癌中过表达，且不断升高与差预后相关。然而，LINC00626在肺腺癌发生发展过程中扮演的角色以及分子调控机制研究尚不清楚。JAK/STAT信号通路是许多细胞因子进行胞内、外信息传导的主要通路，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡和炎症等多种生理过程[12]，还参与癌症发病机制和进展[13]。KH型剪接调控蛋白（KH-type splicing regulatory protein，KHSRP）是一种多功能核酸结合蛋白，与多种细胞发展过程有关，包括细胞核中的剪接和细胞质中的mRNA定位和降解[14]。在结直肠癌中，KHSRP在原发性和转移性的上皮和基质区室中表达均上调[15]。KHSRP可通过参与不同细胞过程（如迁移和对细胞应激的反应）的致癌蛋白分泌来促进血管生成细胞外环境。本研究分析长链非编码RNA 626（long intergenic non-protein coding RNA 626，LINC00626）和KHSRP在肺腺癌组织和细胞中的表达水平，并深入研究LINC00626通过JAK1/STAT3/KHSRP信号轴，调控肺腺癌细胞转移的恶性进展的分子机制。
1 材料与方法
1.1 细胞实验
1.1.1 实验细胞、主要试剂及仪器
人肺癌细胞系A549、H1299、H1975、H1437购自武汉普诺赛生命科技有限公司。人正常支气管上皮细胞系16HBE购自宁波明舟生物科技有限公司。TRIzol试剂、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒、10%聚偏二氟乙烯膜购自美国Sigma Aldrich公司。HiScript®II逆转录酶试剂盒、通用型高特异性染料法定量PCR检测试剂盒、RIPA缓冲液购自北京索莱宝公司。BCA蛋白质定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。Transwell小室购自美国Corning Incorporated公司。慢病毒试剂购自上海吉玛制药有限公司。RNA-蛋白质下拉试剂盒、RNA核质分离试剂盒和RNA荧光原位杂交实验（RNA fluorescence in situ hybridization，FISH）试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司。流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。荧光显微镜购自日本Olympus公司。Nano Drop 2000c分光光度计购自美国赛默飞世尔科技公司。酶标仪购自北京普天新桥技术有限公司。
1.1.2 细胞培养及转染
将细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基，放置在5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养。取对数生长期的H1299细胞系，根据说明书，转入在载体LV3上构建的LV3-NC和三个短发卡RNA序列的LV3（H1/GFP&Puro）-LINC00626-homo-994敲降慢病毒，依次命名为sh-NC组、sh-LINC00626#1组、sh-LINC00626#2组、sh-LINC00626#3组，H1437细胞系操作如上。取对数生长期的A549细胞系，转入在克隆载体LV6上构建好的LV6-NC和LV6-LINC00626-homo过表达慢病毒，依次命名为Vector组、LINC00626组，H1975细胞系操作如上。取对数生长期的H1437细胞，转入在敲降LINC00626慢病毒基础上的KHSRP载体和在敲降LINC00626慢病毒基础上的空白载体，分别命名为sh-LINC00626+KHSRP组和sh-LINC00626+Vector组。
1.1.3 qRT-PCR
使用TRIzol试剂提取总RNA，Nano Drop 2000c分光光度计测RNA的浓度和纯度，然后进行反转录，使用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒检测各组中LINC00626、KHSRP mRNA的表达量。GAPDH和U6作为对照，2–ΔΔCt法进行分析，序列见表1。
表1
LINC00626的片段引物
1.1.4 CCK-8实验
将sh-NC组、sh-LINC00626#1组以1×104个细胞/孔接种到96孔板中，培养24、48和72 h。采用CCK-8试剂盒在每个孔中加入10 µL的CCK-8溶液，孵育2 h。最后用酶标仪在450 nm处测量吸光值。
1.1.5 Transwell小室实验
采用Transwell小室（含/不含Matrigel胶）检测细胞侵袭、迁移能力。将200 µL无血清培养基添加到上室，在下室中添加含有胎牛血清的培养基700 µL。孵育24 h（迁移）/48 h（侵袭）后，去除留在膜上细胞，并进行固定和染色。在倒置显微镜下以400倍率拍摄图像。对5个随机区域中的细胞进行计数，获得迁移或侵袭细胞平均数。
1.1.6 蛋白质印迹实验（Western blot）
采用RIPA缓冲液提取sh-NC组、sh-LINC00626#1组、sh-LINC00626+vector组、sh-LINC00626+KHSRP组中的总蛋白。BCA蛋白质定量试剂盒进行定量。通过SDS凝胶电泳将蛋白质分离，之后转移到PVDF模中，在5%脱脂牛奶中室温下封闭1 h，再与GAPDH抗体和一抗KHSRP 4°C下孵育过夜，使用TBST洗涤3遍，与二抗在室温下放置1.5 h。使用ECL试剂盒化学发光。
1.2 病例标本试验
收集河南大学淮河医院胸外科手术切除且病理检查确诊为肺腺癌的144例癌组织标本和其癌旁组织标本。本研究经河南大学淮河医院伦理委员会批准（HUSOM2020-250），所有参与者已签署知情同意书。
1.3 裸鼠实验
4～6周雄性裸鼠，购自北京维通利华实验动物科技有限公司。皮下荷瘤实验：将32只老鼠随机分为sh-NC组、sh-LINC00626组、Vector组、LINC00626组，每组8只。将sh-NC、sh-LINC00626转染到H1437细胞，将Vector、LINC00626转染到A549细胞。注射剂量均为5×106个细胞。每2 d测量1次肿瘤体积/体重。体积公式为：体积（mm3）=长×宽2×0.5。第21～30 d后处死小鼠。尾静脉注射肺转移模型实验：将20只老鼠随机分为sh-NC组、sh-LINC00626组、Vector组、LINC00626组，每组5只。注射浓度为1×106/mL，尾静脉接种0.1 mL/只。第22～33 d后以颈椎脱臼法处死裸鼠，称裸鼠体重，剖取肺，肉眼和解剖显微镜下同时计数各肺部的转移病灶数。
1.4 RNA核质分离及FISH实验检测LINC00626、KHSRP的细胞分布
使用RNA核质分离试剂分离细胞核、质RNA。将细胞核、质RNA和总RNA经过纯化和DNaseⅠ处理后进行反转录，用LINC00626引物进行qPCR检测。根据以下公式：所占比例（%）=2（总RNA的Ct值–组分RNA的Ct值）×100%，判断LINC00626在细胞核、质RNA内的分布比例。U6作为细胞核的内源性对照，GAPDH作为细胞质的内源性对照。另外，使用FISH试剂盒及荧光标记的LINC00626 FISH探针进行FISH实验，采用激光共聚焦显微镜观察KHSRP在细胞中的定位情况。
1.5 RNA下拉和质谱实验
采用RNA-蛋白质下拉试剂盒拉下与LINC00626结合的所有蛋白。将bio-LINC00626和阴性对照（bio-NC）转染到肺腺癌细胞并孵育24 h，预洗链霉亲和素磁珠。将备好的细胞裂解液重悬收集磁珠，将上述反应体系在4℃条件下缓慢旋转2 h，充分保证磁珠与细胞裂解产物充分结合。之后洗涤与洗脱RNA-蛋白复合物，然后进行银染实验。一部分通过质谱分析存RNA-蛋白复合物，一部分用Westernblot实验检测目的蛋白，验证质谱分析的结果。
1.6 统计学方法
采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（
±s）表示，采用独立样本t检验或单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验进行组间比较。采用Kaplan-Meier法和对数秩检验进行生存分析。采用双侧检验，检验校准α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LINC00626在肺腺癌组织和细胞系中表达均显著上调
qRT-PCR结果显示，与正常组织相比，LINC00626在肺腺癌组织中表达显著上调（P<0.001，图1a）。与16HBE细胞相比，LINC00626在肺腺癌细胞系（A549、H1299、H1975和H1437）中表达显著上调（P<0.001，图1b），故选用表达相对较低的A549、H1975和表达量相对较高的H1299、H1437细胞系进行后续细胞功能实验，其中A549、H1975做过表达处理，H1299、H1437做敲降处理。
图1
qRT-PCR检测LINC00626在组织和细胞的表达
a. 在肺腺癌组织样本中高表达；b. 在NSCLC细胞系中高表达。*
根据LINC00626在144例肺腺癌和癌旁组织中的表达量2–△△Ct表达值，把144例肺腺癌标本分成两组，数值>中位数值1.484159视为显著高表达组（n=72），数值<中位数值1.484159视为显著低表达组（n=72），绘制受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线，显示在144例肺腺癌及癌旁组织总样本中LINC00626的ROC曲线下面积（area under ROC curve，AUC）=0.6629［95%置信区间（confidential interval，CI）0.616 8～0.7090，P<0.0001，截断值13.41，敏感性77.78%，特异性73.61%］；在72例显著高表达的肺腺癌及癌旁组织样本中LINC00626的AUC=0.7720（95%CI 0.6946～0.8494，P<0.0001，截断值13.41、敏感性77.78%，特异性73.61%）；在72例高表达Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ期肺腺癌和癌旁组织中LINC00626的AUC=0.8810（95%CI 0.7855～0.9764，P=0.0005，截断值22.31，敏感性68.57%，特异性100.00%）；在72例高表达有无淋巴结转移肺腺癌和癌旁组织中LINC00626的AUC=0.9198（95%CI 0.8568～0.9826，P<0.0001，截断值17.72，敏感性89.66%，特异性81.40%）。临床病理信息见表2。
表2
LINC00626表达与144例肺腺癌患者临床病理特征的相关性（例）
2.2 LINC00626促进体外肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力
qRT-PCR结果显示sh-LINC00626#1组、sh-LINC00626#2组和sh-LINC00626#3组中LINC00626表达水平较sh-NC组显著降低（P<0.001，图2a），sh-LINC00626#1组效果最明显，因此采用sh-LINC00626#1组进行后续实验。与Vector组相比，LINC00626组表达水平明显增加（P<0.001，图2b）。与sh-NC组相比，sh-LINC00626组细胞增殖迁移和侵袭能力明显降低，过表达则反之（P<0.001，图2c～d）。以上结果表明LINC00626可促进体外肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。
图2
LINC00626促进肺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力
a、b. qRT-PCR实验检测敲降组和过表达组转染效率；c. CCK-8实验检测敲降或过表达LINC00626对肺癌细胞增殖能力的影响；d. Transwell小室检测敲降或过表达LINC00626对肺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。*
2.3 LINC00626抑制裸鼠体内肺腺癌细胞生长、迁移和侵袭能力
皮下荷瘤实验中，与sh-NC组相比，sh-LINC00626组中肿瘤体积和重量显著减少（P<0.01，图3a、b）。与Vector组比，LINC00626组中肿瘤体积和重量显著增加（P<0.01，图3c、d）。与sh-NC和Vector组相比，敲降LINC00626组和过表达LINC00626组细胞增殖率和增殖指数明显下降或上升（P<0.01，图3e～f）。尾静脉注射肺转移模型实验中与sh-NC和Vector组相比，敲降LINC00626和过表达LINC00626均可显著抑制或促进肺部淋巴结转移数量（P<0.01，图3g～i）。以上结果表明LINC00626可促进裸鼠体内肺腺癌细胞生长、迁移和侵袭能力。
图3
LINC00626促进裸鼠体内肺腺癌细胞生长、迁移和侵袭能力
a. 第21 d时处死裸鼠和剖离瘤体；b. 统计肿瘤体积和重量的量化图；c. 第30 d时处死裸鼠和剖离瘤体；d. 统计瘤体积和体重的量化图；e、f. Ki-67染色结果和增殖指数；g. 裸鼠尾静脉注射肺转移模型肉眼下肺组织转移结节图；h、i. 裸鼠尾静脉注射显微镜下肺组织转移结节病理图和结节计数（HE×200）。*
2.4 LINC00626与KHSRP位于细胞核内，且LINC00626能够与KHSRP直接结合
将H1299和H1437细胞进行RNA核质分离后行qPCR检测，结果显示LINC00626主要定位于肺腺癌细胞核内（P<0.01，图4a、b）。FISH实验显示HKSRP同样主要定位于细胞核内（图4c）。采用RNA下拉实验拉下与LINC00626结合的所有蛋白，然后将这些的蛋白进行质谱分析，列举出排在前20的差异蛋白（表3）。RNA下拉银染实验显示，LINC00626所结合的蛋白在70 kDa处存在明显表达（图4d）。接着采用蛋白质印迹实验再次验证了LINC00626能够与KHSRP相互结合在一起（图4e）。根据上述机制研究结果，可以推测得出LINC00626与KHBSRP作用的分子机制图（图4f）。
图4
LINC00626直接与KHSRP蛋白互作用
a、b. 核质分离实验表明LINC00626主要位于细胞核内；c. FISH实验表明KHSRP主要位于细胞核内；d. 银染实验验证LINC00626能够与下拉的KHSRP结合；e. 蛋白质印迹实验验证KHSRP确实与LINC00626结合；f. LINC00626与KHSRP的分子作用机制图。
表3
质谱分析与LINC00626互作的蛋白（前20名）
2.5 KHSRP过表达逆转敲降LINC00626对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响
qRT-PCR结果显示，与正常组织相比，KHSRP在肺腺癌组织中表达上调（P<0.001，图5a）；与16HBE细胞相比，KHSRP在肺腺癌细胞系（A549、H1299、H1975和H1437）中均表达上调（P<0.001，图5b）。随后，将KHSRP加入sh-LINC00626中共转染（图5c、d），进行了细胞功能恢复试验。CCK-8、Transwell小室迁移/侵袭和划痕实验均表明，与sh-LINC00626+Vector组相比，sh-LINC00626组+KHSRP组中细胞增殖、迁移和侵袭能力显著增加（图5e～f）。KHSRP上调可消除敲降LINC00626对细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。以上结果表明LINC00626和KHSRP在肺腺癌中表达一致，且LINC00626对KHSRP具有正向调控作用。
图5
KHSRP过表达可逆转敲降LINC00626对肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响
a. KHSRP在144例肺腺癌组织中表达显著上调；b. HKSRP在肺癌细胞株中表达显著上调； c、d. qRT-PCR和蛋白质印迹实验KHSRP与sh-LINC00626共转染的效果；e. CCK-8实验检测敲降LINC00626与KHSRP共转染后对肺腺癌细胞增殖能力的影响；f. Transwell实验检测敲降LINC00626与KHSRP共转染后对肺腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。*
2.6 LINC00626在肺腺癌中对JAK/STAT信号通路的调控作用
PCR、qRT-PCR实验结果显示，与sh-NC组相比，sh-LINC00626组中JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA表达降低，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA表达降低不明显（图6a～c）；与Vector组相比，LINC00626组JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA表达水平升高，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA表达升高不明显（图6d～f）。以上结果表明在肺腺癌中LINC00626对JAK1/STAT3蛋白具有正向调控作用。
图6
PCR、qRT-PCR 检验LINC00626在肺腺癌中与JAK1/STAT3呈正相关
a～c. PCR和qPCR检测LINC00626与敲降组JAK/STAT信号通路相关蛋白mRNA水平表达的关系：d～f. PCR和qPCR检测LINC00626与过表达组JAK/STAT信号通路相关蛋白mRNA水平表达的关系。*
2.7 KHSRP在肺腺癌中对JAK/STAT信号通路的调控作用
PCR和qRT-PCR实验结果显示，与sh-NC组相比，sh-LINC00626组中JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA水平表达降低，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA水平降低不明显（图7a～c）；与Vector 组相比，LINC00626 组JAK1、p-JAK1和STAT3表达水平升高，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT 5 mRNA升高不明显（图7d～g）。以上结果显示肺腺癌中KHSRP蛋白对JAK1/STAT3具有正向调控作用。
图7
PCR、qPCR检测KHSRP在肺腺癌中与JAK1/STAT3呈正相关
a～c. PCR和qPCR检测KHSRP与敲降组JAK/STAT相关蛋白在H1437细胞系中mRNA水平表达的关系；d～f. PCR和qPCR检测KHSRP与过表达组JAK/STAT相关蛋白在A549细胞系中mRNA水平表达的关系。*
3 讨论
肺腺癌细胞恶性增殖和迁移与患者不良预后有关[16]。LncRNA异常表达可通过调节细胞增殖、迁移和侵袭来发挥肿瘤癌基因或抑制因子的作用[17-18]，许多lncRNA已被证实在肺腺癌中充当竞争性内源性RNAs而发挥关键作用[19-20]。Song等[21]发现lncRNA LINC01535在宫颈癌中高表达，并通过结合微RNA-214，从而上调EZH2蛋白表达。本研究首次发现LINC00626在肺腺癌组织和细胞中高表达，并促进肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。首先利用在线网站发现LINC00626在NSCLC细胞中呈高表达，随后通过qRT-PCR实验发现LINC00626在收集的144例新鲜肺腺癌组织标本和NSCLC细胞系中表达均上调，体外细胞功能实验发现敲降LINC00626基因表达后可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，过表达LINC00626则有相反的效果。
JAK/STAT信号通路是由表皮生长因子受体JAK激活的细胞信号通路，主要包括JAK家族和STAT家族。JAK/STAT信号通路的激活/失活与多种肿瘤的发生有关。JAK/STAT信号通路广泛参与细胞增殖、分化、凋亡和炎症等多种生理过程[22]。JAK/STAT信号通路在多种疾病的中起重要调节作用，例如Zhao等[23]发现LncRNAFEZF1-AS1可以通过激活JAK/STAT3信号通路刺激卵巢癌的发生和发展联合抑制JAK1/STAT3/PD-L1信号通路，有望为去除抵抗性前列腺癌的免疫治疗提供新的思路和靶点[24]。宫颈癌细胞中Aloperine抗肿瘤活性与IL-6/JAK1/STAT3反馈回路的抑制有关[25]。本研究验证了在肺腺癌中LINC00626能够通过调节JAK/STAT信号通路中的关键基因，从而促进肺腺癌转移的恶性进程。
KHSRP在1996年由Levens和Black实验室独立发现，为远上游元件结合蛋白家族的新成员[26]。KHSRP 是一种多功能的单链核酸（DNA或RNA）结合蛋白，位于细胞核和细胞质中。KHSRP结构分三部分：氨基酸的末端结构域、含有4个KH基序的中心结构域以及羧基的末端结构域[27]。这3个高度保守的区域由可变连接区域连接，中心的KH区域是最具特征的区域。除了直接与核酸结合外，KH1和KH4结构域外还有一个β-折叠结构，可与其他蛋白相互作用，KH2和KH3的结构域有负调控结合位点[28]。KHSRP基因在调控RNA剪接、RNA转运、RNA编辑以及mRNA稳定和降解中发挥重要作用[29]。目前研究表明KHSRP在胰腺癌[14]、NSCLC[30]、大肠癌[15]等肿瘤中的蛋白表达都与肿瘤的发生发展进程密切相关。本研究确定了LINC00626能够与KHSRP互作且呈正相关，通过激活JAK1/STATA3促进肺腺癌细胞转移的恶性进程。
综上所述，LINC00626在肺腺癌中表达上调，并与肺腺癌患者转移的恶性进程密切相关。LINC00626通过调节JAK1/STAT3/HKSRP轴，促进肺腺癌细胞生长和运动、侵袭、转移能力。本研究为肺腺癌的临床诊疗提供了一种新的分子标志物和潜在的治疗靶点。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
肺癌是世界上病死率第一的恶性肿瘤[1]。肺腺癌是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中最常见的病理类型，发病率和病死率都很高。尽管手术、化疗和分子靶向使肺腺癌治疗取得较大进展，但肺癌预后仍不令人满意[2]。由于肺腺癌有不同的治疗结局和反应，故寻找诊断和治疗的分子标志物尤为重要[3-4]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）的失调是所有癌症中常见现象，已成为人类癌症中关键调节因子[5]。LncRNA在细胞周期、增殖、迁移、凋亡、侵袭和转移等进程中发挥重要作用[6-7]。LncRNA FAM83A-AS1可以促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭和肺腺癌细胞系中的糖酵解。敲降FAM83A-AS1可以抑制肿瘤生长，抑制缺氧诱导因子-1α和糖酵解相关基因在体内的表达[8]。LncRNA RP11-10A14.5主要分布在肺癌细胞质中，可以促进肺腺癌细胞生长和转移，并与临床分期和不良生存结局相关[9]。LncRNA DARS-AS1是一种促癌基因，在肺腺癌中高表达，可通过抑制miR-188-5p增强肺腺癌的增殖、侵袭和迁移[10]。李静等[4]通过对89例NSCLC患者肺癌组织和癌旁组织进行定量聚合酶链式反应（quantitative polymerasechain reaction，qPCR），发现LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC组织中高表达，且与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期及吸烟史密切相关。因此，lncRNA不仅是癌症早期诊断和精准预测的潜在生物标志物，也可能是新的分子治疗靶点[11]。本研究经过数据库及预实验筛选得到目的基因LINC00626，位于1q24,2位置。经文献检索发现LINC00626在胃癌中过表达，且不断升高与差预后相关。然而，LINC00626在肺腺癌发生发展过程中扮演的角色以及分子调控机制研究尚不清楚。JAK/STAT信号通路是许多细胞因子进行胞内、外信息传导的主要通路，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡和炎症等多种生理过程[12]，还参与癌症发病机制和进展[13]。KH型剪接调控蛋白（KH-type splicing regulatory protein，KHSRP）是一种多功能核酸结合蛋白，与多种细胞发展过程有关，包括细胞核中的剪接和细胞质中的mRNA定位和降解[14]。在结直肠癌中，KHSRP在原发性和转移性的上皮和基质区室中表达均上调[15]。KHSRP可通过参与不同细胞过程（如迁移和对细胞应激的反应）的致癌蛋白分泌来促进血管生成细胞外环境。本研究分析长链非编码RNA 626（long intergenic non-protein coding RNA 626，LINC00626）和KHSRP在肺腺癌组织和细胞中的表达水平，并深入研究LINC00626通过JAK1/STAT3/KHSRP信号轴，调控肺腺癌细胞转移的恶性进展的分子机制。
1 材料与方法
1.1 细胞实验
1.1.1 实验细胞、主要试剂及仪器
人肺癌细胞系A549、H1299、H1975、H1437购自武汉普诺赛生命科技有限公司。人正常支气管上皮细胞系16HBE购自宁波明舟生物科技有限公司。TRIzol试剂、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒、10%聚偏二氟乙烯膜购自美国Sigma Aldrich公司。HiScript®II逆转录酶试剂盒、通用型高特异性染料法定量PCR检测试剂盒、RIPA缓冲液购自北京索莱宝公司。BCA蛋白质定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。Transwell小室购自美国Corning Incorporated公司。慢病毒试剂购自上海吉玛制药有限公司。RNA-蛋白质下拉试剂盒、RNA核质分离试剂盒和RNA荧光原位杂交实验（RNA fluorescence in situ hybridization，FISH）试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司。流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。荧光显微镜购自日本Olympus公司。Nano Drop 2000c分光光度计购自美国赛默飞世尔科技公司。酶标仪购自北京普天新桥技术有限公司。
1.1.2 细胞培养及转染
将细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基，放置在5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养。取对数生长期的H1299细胞系，根据说明书，转入在载体LV3上构建的LV3-NC和三个短发卡RNA序列的LV3（H1/GFP&Puro）-LINC00626-homo-994敲降慢病毒，依次命名为sh-NC组、sh-LINC00626#1组、sh-LINC00626#2组、sh-LINC00626#3组，H1437细胞系操作如上。取对数生长期的A549细胞系，转入在克隆载体LV6上构建好的LV6-NC和LV6-LINC00626-homo过表达慢病毒，依次命名为Vector组、LINC00626组，H1975细胞系操作如上。取对数生长期的H1437细胞，转入在敲降LINC00626慢病毒基础上的KHSRP载体和在敲降LINC00626慢病毒基础上的空白载体，分别命名为sh-LINC00626+KHSRP组和sh-LINC00626+Vector组。
1.1.3 qRT-PCR
使用TRIzol试剂提取总RNA，Nano Drop 2000c分光光度计测RNA的浓度和纯度，然后进行反转录，使用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒检测各组中LINC00626、KHSRP mRNA的表达量。GAPDH和U6作为对照，2–ΔΔCt法进行分析，序列见表1。
表1
LINC00626的片段引物
1.1.4 CCK-8实验
将sh-NC组、sh-LINC00626#1组以1×104个细胞/孔接种到96孔板中，培养24、48和72 h。采用CCK-8试剂盒在每个孔中加入10 µL的CCK-8溶液，孵育2 h。最后用酶标仪在450 nm处测量吸光值。
1.1.5 Transwell小室实验
采用Transwell小室（含/不含Matrigel胶）检测细胞侵袭、迁移能力。将200 µL无血清培养基添加到上室，在下室中添加含有胎牛血清的培养基700 µL。孵育24 h（迁移）/48 h（侵袭）后，去除留在膜上细胞，并进行固定和染色。在倒置显微镜下以400倍率拍摄图像。对5个随机区域中的细胞进行计数，获得迁移或侵袭细胞平均数。
1.1.6 蛋白质印迹实验（Western blot）
采用RIPA缓冲液提取sh-NC组、sh-LINC00626#1组、sh-LINC00626+vector组、sh-LINC00626+KHSRP组中的总蛋白。BCA蛋白质定量试剂盒进行定量。通过SDS凝胶电泳将蛋白质分离，之后转移到PVDF模中，在5%脱脂牛奶中室温下封闭1 h，再与GAPDH抗体和一抗KHSRP 4°C下孵育过夜，使用TBST洗涤3遍，与二抗在室温下放置1.5 h。使用ECL试剂盒化学发光。
1.2 病例标本试验
收集河南大学淮河医院胸外科手术切除且病理检查确诊为肺腺癌的144例癌组织标本和其癌旁组织标本。本研究经河南大学淮河医院伦理委员会批准（HUSOM2020-250），所有参与者已签署知情同意书。
1.3 裸鼠实验
4～6周雄性裸鼠，购自北京维通利华实验动物科技有限公司。皮下荷瘤实验：将32只老鼠随机分为sh-NC组、sh-LINC00626组、Vector组、LINC00626组，每组8只。将sh-NC、sh-LINC00626转染到H1437细胞，将Vector、LINC00626转染到A549细胞。注射剂量均为5×106个细胞。每2 d测量1次肿瘤体积/体重。体积公式为：体积（mm3）=长×宽2×0.5。第21～30 d后处死小鼠。尾静脉注射肺转移模型实验：将20只老鼠随机分为sh-NC组、sh-LINC00626组、Vector组、LINC00626组，每组5只。注射浓度为1×106/mL，尾静脉接种0.1 mL/只。第22～33 d后以颈椎脱臼法处死裸鼠，称裸鼠体重，剖取肺，肉眼和解剖显微镜下同时计数各肺部的转移病灶数。
1.4 RNA核质分离及FISH实验检测LINC00626、KHSRP的细胞分布
使用RNA核质分离试剂分离细胞核、质RNA。将细胞核、质RNA和总RNA经过纯化和DNaseⅠ处理后进行反转录，用LINC00626引物进行qPCR检测。根据以下公式：所占比例（%）=2（总RNA的Ct值–组分RNA的Ct值）×100%，判断LINC00626在细胞核、质RNA内的分布比例。U6作为细胞核的内源性对照，GAPDH作为细胞质的内源性对照。另外，使用FISH试剂盒及荧光标记的LINC00626 FISH探针进行FISH实验，采用激光共聚焦显微镜观察KHSRP在细胞中的定位情况。
1.5 RNA下拉和质谱实验
采用RNA-蛋白质下拉试剂盒拉下与LINC00626结合的所有蛋白。将bio-LINC00626和阴性对照（bio-NC）转染到肺腺癌细胞并孵育24 h，预洗链霉亲和素磁珠。将备好的细胞裂解液重悬收集磁珠，将上述反应体系在4℃条件下缓慢旋转2 h，充分保证磁珠与细胞裂解产物充分结合。之后洗涤与洗脱RNA-蛋白复合物，然后进行银染实验。一部分通过质谱分析存RNA-蛋白复合物，一部分用Westernblot实验检测目的蛋白，验证质谱分析的结果。
1.6 统计学方法
采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验或单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验进行组间比较。采用Kaplan-Meier法和对数秩检验进行生存分析。采用双侧检验，检验校准α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LINC00626在肺腺癌组织和细胞系中表达均显著上调
qRT-PCR结果显示，与正常组织相比，LINC00626在肺腺癌组织中表达显著上调（P<0.001，图1a）。与16HBE细胞相比，LINC00626在肺腺癌细胞系（A549、H1299、H1975和H1437）中表达显著上调（P<0.001，图1b），故选用表达相对较低的A549、H1975和表达量相对较高的H1299、H1437细胞系进行后续细胞功能实验，其中A549、H1975做过表达处理，H1299、H1437做敲降处理。
图1
qRT-PCR检测LINC00626在组织和细胞的表达
a. 在肺腺癌组织样本中高表达；b. 在NSCLC细胞系中高表达。*
根据LINC00626在144例肺腺癌和癌旁组织中的表达量2–△△Ct表达值，把144例肺腺癌标本分成两组，数值>中位数值1.484159视为显著高表达组（n=72），数值<中位数值1.484159视为显著低表达组（n=72），绘制受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线，显示在144例肺腺癌及癌旁组织总样本中LINC00626的ROC曲线下面积（area under ROC curve，AUC）=0.6629［95%置信区间（confidential interval，CI）0.616 8～0.7090，P<0.0001，截断值13.41，敏感性77.78%，特异性73.61%］；在72例显著高表达的肺腺癌及癌旁组织样本中LINC00626的AUC=0.7720（95%CI 0.6946～0.8494，P<0.0001，截断值13.41、敏感性77.78%，特异性73.61%）；在72例高表达Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ期肺腺癌和癌旁组织中LINC00626的AUC=0.8810（95%CI 0.7855～0.9764，P=0.0005，截断值22.31，敏感性68.57%，特异性100.00%）；在72例高表达有无淋巴结转移肺腺癌和癌旁组织中LINC00626的AUC=0.9198（95%CI 0.8568～0.9826，P<0.0001，截断值17.72，敏感性89.66%，特异性81.40%）。临床病理信息见表2。
表2
LINC00626表达与144例肺腺癌患者临床病理特征的相关性（例）
2.2 LINC00626促进体外肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力
qRT-PCR结果显示sh-LINC00626#1组、sh-LINC00626#2组和sh-LINC00626#3组中LINC00626表达水平较sh-NC组显著降低（P<0.001，图2a），sh-LINC00626#1组效果最明显，因此采用sh-LINC00626#1组进行后续实验。与Vector组相比，LINC00626组表达水平明显增加（P<0.001，图2b）。与sh-NC组相比，sh-LINC00626组细胞增殖迁移和侵袭能力明显降低，过表达则反之（P<0.001，图2c～d）。以上结果表明LINC00626可促进体外肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。
图2
LINC00626促进肺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力
a、b. qRT-PCR实验检测敲降组和过表达组转染效率；c. CCK-8实验检测敲降或过表达LINC00626对肺癌细胞增殖能力的影响；d. Transwell小室检测敲降或过表达LINC00626对肺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。*
2.3 LINC00626抑制裸鼠体内肺腺癌细胞生长、迁移和侵袭能力
皮下荷瘤实验中，与sh-NC组相比，sh-LINC00626组中肿瘤体积和重量显著减少（P<0.01，图3a、b）。与Vector组比，LINC00626组中肿瘤体积和重量显著增加（P<0.01，图3c、d）。与sh-NC和Vector组相比，敲降LINC00626组和过表达LINC00626组细胞增殖率和增殖指数明显下降或上升（P<0.01，图3e～f）。尾静脉注射肺转移模型实验中与sh-NC和Vector组相比，敲降LINC00626和过表达LINC00626均可显著抑制或促进肺部淋巴结转移数量（P<0.01，图3g～i）。以上结果表明LINC00626可促进裸鼠体内肺腺癌细胞生长、迁移和侵袭能力。
图3
LINC00626促进裸鼠体内肺腺癌细胞生长、迁移和侵袭能力
a. 第21 d时处死裸鼠和剖离瘤体；b. 统计肿瘤体积和重量的量化图；c. 第30 d时处死裸鼠和剖离瘤体；d. 统计瘤体积和体重的量化图；e、f. Ki-67染色结果和增殖指数；g. 裸鼠尾静脉注射肺转移模型肉眼下肺组织转移结节图；h、i. 裸鼠尾静脉注射显微镜下肺组织转移结节病理图和结节计数（HE×200）。*
2.4 LINC00626与KHSRP位于细胞核内，且LINC00626能够与KHSRP直接结合
将H1299和H1437细胞进行RNA核质分离后行qPCR检测，结果显示LINC00626主要定位于肺腺癌细胞核内（P<0.01，图4a、b）。FISH实验显示HKSRP同样主要定位于细胞核内（图4c）。采用RNA下拉实验拉下与LINC00626结合的所有蛋白，然后将这些的蛋白进行质谱分析，列举出排在前20的差异蛋白（表3）。RNA下拉银染实验显示，LINC00626所结合的蛋白在70 kDa处存在明显表达（图4d）。接着采用蛋白质印迹实验再次验证了LINC00626能够与KHSRP相互结合在一起（图4e）。根据上述机制研究结果，可以推测得出LINC00626与KHBSRP作用的分子机制图（图4f）。
图4
LINC00626直接与KHSRP蛋白互作用
a、b. 核质分离实验表明LINC00626主要位于细胞核内；c. FISH实验表明KHSRP主要位于细胞核内；d. 银染实验验证LINC00626能够与下拉的KHSRP结合；e. 蛋白质印迹实验验证KHSRP确实与LINC00626结合；f. LINC00626与KHSRP的分子作用机制图。
表3
质谱分析与LINC00626互作的蛋白（前20名）
2.5 KHSRP过表达逆转敲降LINC00626对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响
qRT-PCR结果显示，与正常组织相比，KHSRP在肺腺癌组织中表达上调（P<0.001，图5a）；与16HBE细胞相比，KHSRP在肺腺癌细胞系（A549、H1299、H1975和H1437）中均表达上调（P<0.001，图5b）。随后，将KHSRP加入sh-LINC00626中共转染（图5c、d），进行了细胞功能恢复试验。CCK-8、Transwell小室迁移/侵袭和划痕实验均表明，与sh-LINC00626+Vector组相比，sh-LINC00626组+KHSRP组中细胞增殖、迁移和侵袭能力显著增加（图5e～f）。KHSRP上调可消除敲降LINC00626对细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。以上结果表明LINC00626和KHSRP在肺腺癌中表达一致，且LINC00626对KHSRP具有正向调控作用。
图5
KHSRP过表达可逆转敲降LINC00626对肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响
a. KHSRP在144例肺腺癌组织中表达显著上调；b. HKSRP在肺癌细胞株中表达显著上调； c、d. qRT-PCR和蛋白质印迹实验KHSRP与sh-LINC00626共转染的效果；e. CCK-8实验检测敲降LINC00626与KHSRP共转染后对肺腺癌细胞增殖能力的影响；f. Transwell实验检测敲降LINC00626与KHSRP共转染后对肺腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。*
2.6 LINC00626在肺腺癌中对JAK/STAT信号通路的调控作用
PCR、qRT-PCR实验结果显示，与sh-NC组相比，sh-LINC00626组中JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA表达降低，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA表达降低不明显（图6a～c）；与Vector组相比，LINC00626组JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA表达水平升高，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA表达升高不明显（图6d～f）。以上结果表明在肺腺癌中LINC00626对JAK1/STAT3蛋白具有正向调控作用。
图6
PCR、qRT-PCR 检验LINC00626在肺腺癌中与JAK1/STAT3呈正相关
a～c. PCR和qPCR检测LINC00626与敲降组JAK/STAT信号通路相关蛋白mRNA水平表达的关系：d～f. PCR和qPCR检测LINC00626与过表达组JAK/STAT信号通路相关蛋白mRNA水平表达的关系。*
2.7 KHSRP在肺腺癌中对JAK/STAT信号通路的调控作用
PCR和qRT-PCR实验结果显示，与sh-NC组相比，sh-LINC00626组中JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA水平表达降低，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA水平降低不明显（图7a～c）；与Vector 组相比，LINC00626 组JAK1、p-JAK1和STAT3表达水平升高，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT 5 mRNA升高不明显（图7d～g）。以上结果显示肺腺癌中KHSRP蛋白对JAK1/STAT3具有正向调控作用。
图7
PCR、qPCR检测KHSRP在肺腺癌中与JAK1/STAT3呈正相关
a～c. PCR和qPCR检测KHSRP与敲降组JAK/STAT相关蛋白在H1437细胞系中mRNA水平表达的关系；d～f. PCR和qPCR检测KHSRP与过表达组JAK/STAT相关蛋白在A549细胞系中mRNA水平表达的关系。*
3 讨论
肺腺癌细胞恶性增殖和迁移与患者不良预后有关[16]。LncRNA异常表达可通过调节细胞增殖、迁移和侵袭来发挥肿瘤癌基因或抑制因子的作用[17-18]，许多lncRNA已被证实在肺腺癌中充当竞争性内源性RNAs而发挥关键作用[19-20]。Song等[21]发现lncRNA LINC01535在宫颈癌中高表达，并通过结合微RNA-214，从而上调EZH2蛋白表达。本研究首次发现LINC00626在肺腺癌组织和细胞中高表达，并促进肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。首先利用在线网站发现LINC00626在NSCLC细胞中呈高表达，随后通过qRT-PCR实验发现LINC00626在收集的144例新鲜肺腺癌组织标本和NSCLC细胞系中表达均上调，体外细胞功能实验发现敲降LINC00626基因表达后可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，过表达LINC00626则有相反的效果。
JAK/STAT信号通路是由表皮生长因子受体JAK激活的细胞信号通路，主要包括JAK家族和STAT家族。JAK/STAT信号通路的激活/失活与多种肿瘤的发生有关。JAK/STAT信号通路广泛参与细胞增殖、分化、凋亡和炎症等多种生理过程[22]。JAK/STAT信号通路在多种疾病的中起重要调节作用，例如Zhao等[23]发现LncRNAFEZF1-AS1可以通过激活JAK/STAT3信号通路刺激卵巢癌的发生和发展联合抑制JAK1/STAT3/PD-L1信号通路，有望为去除抵抗性前列腺癌的免疫治疗提供新的思路和靶点[24]。宫颈癌细胞中Aloperine抗肿瘤活性与IL-6/JAK1/STAT3反馈回路的抑制有关[25]。本研究验证了在肺腺癌中LINC00626能够通过调节JAK/STAT信号通路中的关键基因，从而促进肺腺癌转移的恶性进程。
KHSRP在1996年由Levens和Black实验室独立发现，为远上游元件结合蛋白家族的新成员[26]。KHSRP 是一种多功能的单链核酸（DNA或RNA）结合蛋白，位于细胞核和细胞质中。KHSRP结构分三部分：氨基酸的末端结构域、含有4个KH基序的中心结构域以及羧基的末端结构域[27]。这3个高度保守的区域由可变连接区域连接，中心的KH区域是最具特征的区域。除了直接与核酸结合外，KH1和KH4结构域外还有一个β-折叠结构，可与其他蛋白相互作用，KH2和KH3的结构域有负调控结合位点[28]。KHSRP基因在调控RNA剪接、RNA转运、RNA编辑以及mRNA稳定和降解中发挥重要作用[29]。目前研究表明KHSRP在胰腺癌[14]、NSCLC[30]、大肠癌[15]等肿瘤中的蛋白表达都与肿瘤的发生发展进程密切相关。本研究确定了LINC00626能够与KHSRP互作且呈正相关，通过激活JAK1/STATA3促进肺腺癌细胞转移的恶性进程。
综上所述，LINC00626在肺腺癌中表达上调，并与肺腺癌患者转移的恶性进程密切相关。LINC00626通过调节JAK1/STAT3/HKSRP轴，促进肺腺癌细胞生长和运动、侵袭、转移能力。本研究为肺腺癌的临床诊疗提供了一种新的分子标志物和潜在的治疗靶点。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
