引用本文: 王琴, 林宁, 王家雨, 白玉杰, 李玫, 石培洁, 罗书泓, 冯健, 李福祥. 曲美他嗪在重症加强治疗病房获得性衰弱中的作用及机制研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2024, 23(7): 478-487. doi: 10.7507/1671-6205.202312046 复制
重症加强治疗病房获得性衰弱(intensive care unit-acquired weakness,ICU-AW)是脓毒症患者在内的危重患者常见的并发症之一,是导致脓毒症致死率和致残率居高不下的重要原因[1-3]。ICU-AW主要表现为四肢弛缓性无力,且肢体近端肌肉萎缩和无力较为突出[4-5],此外,呼吸肌也经常受到影响,尤其接受机械通气的患者[6],其发生机制和脓毒症状态下骨骼肌蛋白质的过度降解[5,7-8]和合成减少[8]密切相关,但脓毒症状态下骨骼肌损伤的机制及调控靶点尚不完全清楚。细胞焦亡是一种细胞程序性死亡,几乎可以影响人体所有的重要系统[9]。曲美他嗪(trimetazidine,TMZ)作为抗心绞痛药物,能够通过抑制细胞焦亡而发挥心肌保护作用[10],最新研究发现TMZ还可以通过抑制细胞焦亡改善地塞米松诱导的肌肉萎缩[11]。由此可见,TMZ可能参与骨骼肌的代谢过程,但其能否通过调控细胞焦亡途径改善ICU-AW患者的骨骼肌损伤尚未见报道。因此,本研究拟通过小鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构建ICU-AW小鼠模型,并对TMZ在其中的作用和机制进行研究,为TMZ用于ICU-AW的防治提供可参考的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
8~9周龄SPF级雄性C57BL/6野生型小鼠140只,体重(24.21±1.82)g,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供[合格证号SCXK(京)2019-0010]。小鼠在西部战区总医院实验动物中心SPF级动物房常规饲养,室温维持20~25℃,12 h/12 h光照和黑暗交替,给予常规饲料自由饮食,正式实验开始前适应性饲养2周。实验动物中心的资质号SYXK(川)2020-230。本研究获得西部战区总医院实验动物伦理委员会批准(2023EC5-ky010)。
1.1.2 主要试剂
大肠杆菌LPS(O55:L8880;北京索莱宝科技有限公司);TMZ(13171-25-0;北京沃凯生物科技有限公司);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1)抑制剂AC-YVAD-CMK(AC,美国MCE公司),全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司);抗体肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶1(muscle-specific RING finger protein 1,MuRF1)、Atrogin-1、Caspase-1、消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、β-actin、二抗山羊抗兔购于英国Abcam公司;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)引物购于北京擎科生物科技有限公司;苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)试剂盒购于兰杰柯科技有限公司;白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)试剂盒购于(凡科维商城)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及模型制备
选取70只小鼠,随机分为Normal组、LPS溶剂(Vehicle)组、LPS(6 mg/kg)组、LPS(8 mg/kg)组、LPS(10 mg/kg)组、LPS(12 mg/kg)组、LPS(14 mg/kg)组,每组10只。Normal组为空白对照组,各不同浓度的LPS组参考Zhang等[12]研究的造模方法予以腹腔注射LPS构建ICU-AW小鼠模型,Vehicle组予以腹腔注射等体积生理盐水。观察各组小鼠体重、抓力、96 h存活率,选取最佳LPS浓度和取材时间,进一步检测该LPS浓度及取材时间对小鼠腓肠肌萎缩蛋白MuRF1、Atrogin-1的mRNA和蛋白表达的影响,以验证ICU-AW造模是否成功。根据前期研究结果最终选取LPS(12 mg/kg)腹腔注射96 h作为后续实验造模方法。
造模成功后另取70只小鼠随机分为Normal组、Vehicle组、LPS组、LPS+TMZ溶剂组、LPS+TMZ组、LPS+TMZ+AC溶剂组、LPS+TMZ+AC组,每组10只。Normal组不做任何干预;Vehicle组腹腔注射LPS溶液等体积生理盐水;剩余各组均腹腔注射LPS(12 mg/kg);LPS注射完成后,LPS+TMZ组、LPS+TMZ+AC溶剂组、LPS+TMZ+AC组予以TMZ(5 mg·kg–1·d–1)灌胃[13-14],每天1次,持续4 d;LPS+TMZ溶剂组予以TMZ等量生理盐水灌胃,每天1次,持续4 d;其中,LPS+TMZ+AC组在LPS注射前1 h腹腔注射Caspase-1抑制剂AC[溶解在DMSO中,再用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)稀释,DMSO终浓度<1.67%,剂量为6.5 mg/kg[15]];LPS+TMZ+AC溶剂组注射等量AC溶剂PBS。TMZ治疗结束后,检测各组小鼠体重、抓力、96 h存活率,腓肠肌MuRF1、Atrogin-1、Caspase-1、GSDMD的mRNA和蛋白表达,以及小鼠血清IL-1β和IL-18的浓度,腓肠肌进行HE染色观察组织病理变化。
1.2.2 小鼠肌肉力量的检测
按Witteveen等[16]的抓力检测方法,从造模开始前1天至第14天,每天用无创小鼠抓力仪测量小鼠前肢肌肉抓力。每次测试前抓力仪调零。小鼠安静状态下,右手提小鼠尾巴,将小鼠的前肢放在抓力测试仪金属网上,匀速向后拉动小鼠,使小鼠向后移动至金属网最后一格,每次测量时当小鼠将爪子从网格上松开时,会收缩肢体,此时金属板连接着的抓力仪主机显示器将显示当次小鼠抓力峰值。每次测量后给予小鼠充分休息,连续测量5次,去掉最大值、最小值,剩余3次结果取平均值,即为抓力值。所有测试由一人操作,以减少测量误差。
1.2.3 血液及组织学标本的采集
每组小鼠在造模成功后第4天通过腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行麻醉,麻醉成功后,采用摘眼球取血法采集血液标本,静置30 min以后,离心,分离血清,保存于–80℃冰箱,备后续检测用。留取小鼠一侧腓肠肌,将所取标本置入4%多聚甲醛溶液中24 h以上,另一侧腓肠肌置于–80℃冰箱中保存待检。
1.2.4 腓肠肌组织学检查
HE染色:取固定后的小鼠腓肠肌标本,进行脱水、石蜡包埋,4 μm厚度切片,按照HE染色试剂盒操作说明书步骤进行HE染色,并在光学显微镜下观察、拍照。
1.2.5 qPCR检测mRNA表达
采用qPCR检测腓肠肌中MuRF1、Atrogin-1、GSDMD、Casepase-1基因的表达(引物序列见表1)。采用Trizol法提取腓肠肌组织标本中的总RNA,离心、RNA洗涤、再溶解,测定总Caspase-1、GSDMD的RNA浓度及纯度,最后进行引物设计及PCR反应。

1.2.6 蛋白免疫印迹(Western blot)测定蛋白的含量
采用Western blot检测腓肠肌中MuRF1、Atrogin-1、GSDMD、Casepase-1蛋白的表达。裂解腓肠肌组织并提取总蛋白,采用BCA法进行蛋白定量,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后,加入相应一抗,4℃孵育过夜,TBST漂洗3次后,加入相应二抗孵育1 h,TBST漂洗3次,洗膜后使用Millipore显色试剂盒进行显色,采用凝胶成像系统拍照。用Image J软件对目的基因条带灰度值进行统计分析。
1.2.7 ELISA试剂盒分别测定小鼠血清中IL-Iβ、IL-18的浓度
各炎症指标的检测操作均按相应ELISA试剂盒说明书步骤进行。
1.3 统计学方法
使用GraphPad Prism V5及SPSS 16.0软件进行制图及数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验;两组间比较采用t检验;方差不齐时采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS腹腔注射成功构建ICU-AW小鼠模型
小鼠腹腔不同浓度LPS注射后,LPS(6 mg/kg)组、LPS(8 mg/kg)组、LPS(10 mg/kg)组在2周的观察期内体重及抓力值无明显变化(图1a、b,P>0.05),而LPS(12 mg/kg)和LPS(14 mg/kg)组小鼠体重和抓力均呈先下降后逐渐升高趋势(图1a、b,P<0.05);组内分析发现,与第0天相比,LPS(12 mg/kg)和LPS(14 mg/kg)组小鼠均在3~5 d时体重和抓力最低(图1a、b,P<0.05)。各组小鼠96 h存活率分析发现,LPS(12 mg/kg)和LPS(14 mg/kg)组小鼠存活率均显著低于Normal组(图1c,P<0.05),而LPS(14 mg/kg)组比LPS(12 mg/kg)组小鼠存活率更低(图1c,P<0.05)。光镜下,Normal组和Vehicle组小鼠腓肠肌肌束结构完整,肌纤维排列紧密,大小形态正常,未见细胞碎裂、溶解;而LPS(12 mg/kg)组出现肌肉萎缩、肌束结构破坏、细胞数量减少、肌纤维排列疏松(图1d)。qPCR检测发现,与Normal组及Vehicle组相比,LPS(12 mg/kg)组小鼠MuRF1(图1e)、Atrogin-1(图1f)表达均显著升高(P<0.01),Western blot检测结果与qPCR趋势一致(图1g,P<0.01)。

a. 体重;b. 抓力;c. 存活率;d. 腓肠肌病理像(HE×200);e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达;f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达;g. 腓肠肌MuRF1和Atrogin-1的蛋白表达。与Normal组及Vehicle组比较,*
2.2 Caspase-1/GSDMD信号通路介导的细胞焦亡可能参与ICU-AW发病过程
各组小鼠腓肠肌qPCR结果提示,与Normal组及Vehicle组相比,LPS组Caspase-1(图2a)和GSDMD(图2b)的mRNA表达及蛋白表达量(图2e)明显升高(P<0.01)。ELISA结果显示,与Normal组及Vehicle组相比,LPS组血清IL-1β(图2c)和IL-18(图2d)的浓度也明显升高(P<0.01)。

a. 腓肠肌Caspase-1 mRNA的表达;b. 腓肠肌GSDMD mRNA的表达;c. 血清IL-1β的浓度;d. 血清IL-18的浓度;e. 腓肠肌Caspase-1和GSDMD的蛋白表达。与Normal组及Vehicle组比较,**
2.3 TMZ可能对ICU-AW小鼠具有保护作用
在LPS造模的基础上予以TMZ干预后,LPS+TMZ组体重及抓力均低于Normal组(图3a、b,P<0.05),但高于LPS组及LPS+TMZ溶剂组(表2,图3a、b,P<0.05);LPS+TMZ组小鼠存活率低于Normal组但高于LPS组及LPS+TMZ溶剂组(图3c,P<0.05);LPS+TMZ组相比LPS组及LPS+TMZ溶剂组肌肉萎缩程度减轻、肌束结构破坏较少、细胞的数量增多(图3d);qPCR检测结果提示,与LPS组及LPS+TMZ溶剂组相比,LPS+TMZ组MuRF1(图3e)、Atrogin-1(图3f)表达均明显降低(P<0.05);Western blot检测结果与qPCR结果趋势一致(图3g,P<0.05)。

a. 体重;b. 抓力;c. 存活率;d. 腓肠肌病理像(HE×200);e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达;f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达;g. 腓肠肌MuRF1和Atrogin-1的蛋白表达。与Normal组比较,*

2.4 TMZ的保护作用可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥作用
在LPS基础上予以TMZ干预后,LPS组、LPS+TMZ溶剂组及LPS+TMZ组Caspase-1和GSDMD的mRNA表达均高于Normal组(图4a、b,P<0.05),但TMZ组Caspase-1和GSDMD的mRNA表达低于LPS组及LPS+TMZ溶剂组(图4a、b,P<0.05);进一步检测血清中IL-1β、IL-18浓度及腓肠肌Caspase-1、GSDMD表达量,发现与qPCR趋势一致(图4c、d、e,P<0.05)。

a. 腓肠肌Caspase-1 mRNA的表达;b. 腓肠肌GSDMD mRNA的表达;c. 血清IL-1β浓度;d. 血清IL-18浓度;e. 腓肠肌Caspase-1及GSDMD的Western blot结果。与Normal组比较,*
2.5 Caspase-1抑制剂AC能够通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡增强TMZ的骨骼肌保护作用
在LPS+TMZ基础上予以Caspase-1抑制剂AC干预后,与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组相比,LPS+TMZ+AC组小鼠体重、抓力明显升高(表3,图5a、b,P<0.05);LPS+TMZ+AC组96 h存活率明显高于LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组(图5c,P<0.05);腓肠肌HE染色结果提示,与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组比较,LPS+TMZ+AC组肌肉萎缩程度减轻,肌束结构破坏较少,细胞的数量增多(图5d);腓肠肌qPCR检测结果提示,与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组比较,LPS+TMZ+AC组MuRF1(图5e)、Atrogin-1(图5f)、Caspase-1(图5g)和GSDMD(图5h)的mRNA表达均显著降低(P<0.05);进一步检测各组GSDMD、Caspase-1蛋白及血清中IL-1β、IL-18浓度,发现与qPCR趋势一致(图5i~k,P<0.05)。


a. 体重;b. 抓力;c. 存活率;d. 腓肠肌病理像(HE×200);e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达;f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达;g. 腓肠肌Caspase-1的mRNA表达;h. 腓肠肌GSDMD的mRNA表达;i. 血清IL-1β的浓度;j. 血清IL-18的浓度;k. 腓肠肌MuRF1、Atrogin-1、Caspase-1、GSDMD的蛋白表达。与LPS+TMZ+AC溶剂组比较,@
3 讨论
ICU-AW是危重症患者的常见并发症,可致机械通气时间延长、ICU住院时间增加、病死率升高以及幸存者生活质量下降[17-18],但目前治疗现状并不满意,主要原因在于发病机制尚不完全清楚、干预手段有限、缺乏特定药物或靶向药物进行治疗[19-21]。因此,对ICU-AW发病机制及干预靶点进行深入研究对ICU-AW的防治具有重要意义。
目前,利用LPS腹腔注射构建ICU-AW模型是研究较多、较为成熟的造模方法[21-22]。但现有文献中LPS造模浓度差异较大,本研究首先给小鼠腹腔注射不同浓度的LPS,综合考虑存活率、炎症程度、骨骼肌功能学和组织学等评价因素对最佳的LPS造模浓度进行了研究。结果发现采用12 mg/kg浓度的LPS腹腔注射造模稳定且小鼠存活率高,在96 h小鼠抓力和体重最低,外周血炎症指标明显升高,骨骼肌出现萎缩,因此将该浓度LPS干预96 h作为后续实验的造模条件。
越来越多的研究表明,细胞焦亡参与诸多炎症反应性疾病的发生发展[23-24],是导致肌肉萎缩的主要机制之一[25]。而GSDMD蛋白是细胞焦亡发生机制中的关键执行者,在细胞焦亡过程中发挥着重要作用。GSDMD在炎性Caspases-1介导下被切割为一个N端片段和C端片段,其中N端片段能在细胞膜上打孔并启动细胞焦亡,进而促成成熟的IL-1β和IL-18释放到胞外[26]。但Caspases-1/GSDMD介导的细胞焦亡在ICU-AW中的作用及调控机制尚不完全清楚。本研究通过腹腔注射LPS制备了ICU-AW小鼠模型,取材其骨骼肌组织进行qPCR、Western blot及病理检测,收集外周血检测炎症因子浓度,发现细胞焦亡相关炎症因子IL-1β和IL-18在血清中大量释放,小鼠腓肠肌中Caspase-1、GSDMD基因和蛋白表达量均明显高于对照组,提示Caspase-1/GSDMD信号通路介导的细胞焦亡可能参与了ICU-AW的发生发展。TMZ已被证实能通过抑制细胞焦亡发挥心肌保护作用[10],TMZ可减轻他汀类药物相关的骨骼肌损伤[27],最新研究还发现TMZ通过抑制细胞焦亡改善地塞米松诱导的肌肉萎缩[11]。由此可见,TMZ和骨骼肌功能调控密切相关[11],但其在ICU-AW状态下能否通过调控Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥骨骼肌保护作用尚无报道。本研究发现TMZ能够改善LPS诱导的小鼠体重减轻和抓力降低,提高存活率,改善腓肠肌萎缩程度,降低萎缩蛋白MuRF1和Atrogin-1的表达,提示TMZ对ICU-AW具有保护作用。进一步检测焦亡相关分子的表达,发现与对照组比较,TMZ组骨骼肌中Caspase-1、GSDMD基因和蛋白的表达明显降低(P<0.05),血清中IL-18、IL-1β浓度也明显降低(P<0.05),提示TMZ的保护作用可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD信号通路发挥作用的。而利用Caspase-1抑制剂AC干预后,发现AC干预能够增强TMZ的骨骼肌保护作用,则进一步证实了TMZ的保护作用依赖于Caspase-1/GSDMD信号通路。本研究首次明确了TMZ在ICU-AW中的作用及干预靶点,为TMZ拓宽适应证并应用于ICU-AW的临床防治提供了理论参考依据。本研究的不足之处在于缺乏临床试验和细胞试验的进一步验证,我们将在下一步的研究中继续探索,为TMZ应用于ICU-AW的防治提供更多参考依据。
综上所述,本研究首次明确了TMZ对ICU-AW具有保护作用,且可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥作用,这对ICU-AW的防治具有重要参考价值。
利益冲突:本研究不涉及任何利益冲突。
重症加强治疗病房获得性衰弱(intensive care unit-acquired weakness,ICU-AW)是脓毒症患者在内的危重患者常见的并发症之一,是导致脓毒症致死率和致残率居高不下的重要原因[1-3]。ICU-AW主要表现为四肢弛缓性无力,且肢体近端肌肉萎缩和无力较为突出[4-5],此外,呼吸肌也经常受到影响,尤其接受机械通气的患者[6],其发生机制和脓毒症状态下骨骼肌蛋白质的过度降解[5,7-8]和合成减少[8]密切相关,但脓毒症状态下骨骼肌损伤的机制及调控靶点尚不完全清楚。细胞焦亡是一种细胞程序性死亡,几乎可以影响人体所有的重要系统[9]。曲美他嗪(trimetazidine,TMZ)作为抗心绞痛药物,能够通过抑制细胞焦亡而发挥心肌保护作用[10],最新研究发现TMZ还可以通过抑制细胞焦亡改善地塞米松诱导的肌肉萎缩[11]。由此可见,TMZ可能参与骨骼肌的代谢过程,但其能否通过调控细胞焦亡途径改善ICU-AW患者的骨骼肌损伤尚未见报道。因此,本研究拟通过小鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构建ICU-AW小鼠模型,并对TMZ在其中的作用和机制进行研究,为TMZ用于ICU-AW的防治提供可参考的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
8~9周龄SPF级雄性C57BL/6野生型小鼠140只,体重(24.21±1.82)g,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供[合格证号SCXK(京)2019-0010]。小鼠在西部战区总医院实验动物中心SPF级动物房常规饲养,室温维持20~25℃,12 h/12 h光照和黑暗交替,给予常规饲料自由饮食,正式实验开始前适应性饲养2周。实验动物中心的资质号SYXK(川)2020-230。本研究获得西部战区总医院实验动物伦理委员会批准(2023EC5-ky010)。
1.1.2 主要试剂
大肠杆菌LPS(O55:L8880;北京索莱宝科技有限公司);TMZ(13171-25-0;北京沃凯生物科技有限公司);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1)抑制剂AC-YVAD-CMK(AC,美国MCE公司),全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司);抗体肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶1(muscle-specific RING finger protein 1,MuRF1)、Atrogin-1、Caspase-1、消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、β-actin、二抗山羊抗兔购于英国Abcam公司;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)引物购于北京擎科生物科技有限公司;苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)试剂盒购于兰杰柯科技有限公司;白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)试剂盒购于(凡科维商城)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及模型制备
选取70只小鼠,随机分为Normal组、LPS溶剂(Vehicle)组、LPS(6 mg/kg)组、LPS(8 mg/kg)组、LPS(10 mg/kg)组、LPS(12 mg/kg)组、LPS(14 mg/kg)组,每组10只。Normal组为空白对照组,各不同浓度的LPS组参考Zhang等[12]研究的造模方法予以腹腔注射LPS构建ICU-AW小鼠模型,Vehicle组予以腹腔注射等体积生理盐水。观察各组小鼠体重、抓力、96 h存活率,选取最佳LPS浓度和取材时间,进一步检测该LPS浓度及取材时间对小鼠腓肠肌萎缩蛋白MuRF1、Atrogin-1的mRNA和蛋白表达的影响,以验证ICU-AW造模是否成功。根据前期研究结果最终选取LPS(12 mg/kg)腹腔注射96 h作为后续实验造模方法。
造模成功后另取70只小鼠随机分为Normal组、Vehicle组、LPS组、LPS+TMZ溶剂组、LPS+TMZ组、LPS+TMZ+AC溶剂组、LPS+TMZ+AC组,每组10只。Normal组不做任何干预;Vehicle组腹腔注射LPS溶液等体积生理盐水;剩余各组均腹腔注射LPS(12 mg/kg);LPS注射完成后,LPS+TMZ组、LPS+TMZ+AC溶剂组、LPS+TMZ+AC组予以TMZ(5 mg·kg–1·d–1)灌胃[13-14],每天1次,持续4 d;LPS+TMZ溶剂组予以TMZ等量生理盐水灌胃,每天1次,持续4 d;其中,LPS+TMZ+AC组在LPS注射前1 h腹腔注射Caspase-1抑制剂AC[溶解在DMSO中,再用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)稀释,DMSO终浓度<1.67%,剂量为6.5 mg/kg[15]];LPS+TMZ+AC溶剂组注射等量AC溶剂PBS。TMZ治疗结束后,检测各组小鼠体重、抓力、96 h存活率,腓肠肌MuRF1、Atrogin-1、Caspase-1、GSDMD的mRNA和蛋白表达,以及小鼠血清IL-1β和IL-18的浓度,腓肠肌进行HE染色观察组织病理变化。
1.2.2 小鼠肌肉力量的检测
按Witteveen等[16]的抓力检测方法,从造模开始前1天至第14天,每天用无创小鼠抓力仪测量小鼠前肢肌肉抓力。每次测试前抓力仪调零。小鼠安静状态下,右手提小鼠尾巴,将小鼠的前肢放在抓力测试仪金属网上,匀速向后拉动小鼠,使小鼠向后移动至金属网最后一格,每次测量时当小鼠将爪子从网格上松开时,会收缩肢体,此时金属板连接着的抓力仪主机显示器将显示当次小鼠抓力峰值。每次测量后给予小鼠充分休息,连续测量5次,去掉最大值、最小值,剩余3次结果取平均值,即为抓力值。所有测试由一人操作,以减少测量误差。
1.2.3 血液及组织学标本的采集
每组小鼠在造模成功后第4天通过腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行麻醉,麻醉成功后,采用摘眼球取血法采集血液标本,静置30 min以后,离心,分离血清,保存于–80℃冰箱,备后续检测用。留取小鼠一侧腓肠肌,将所取标本置入4%多聚甲醛溶液中24 h以上,另一侧腓肠肌置于–80℃冰箱中保存待检。
1.2.4 腓肠肌组织学检查
HE染色:取固定后的小鼠腓肠肌标本,进行脱水、石蜡包埋,4 μm厚度切片,按照HE染色试剂盒操作说明书步骤进行HE染色,并在光学显微镜下观察、拍照。
1.2.5 qPCR检测mRNA表达
采用qPCR检测腓肠肌中MuRF1、Atrogin-1、GSDMD、Casepase-1基因的表达(引物序列见表1)。采用Trizol法提取腓肠肌组织标本中的总RNA,离心、RNA洗涤、再溶解,测定总Caspase-1、GSDMD的RNA浓度及纯度,最后进行引物设计及PCR反应。

1.2.6 蛋白免疫印迹(Western blot)测定蛋白的含量
采用Western blot检测腓肠肌中MuRF1、Atrogin-1、GSDMD、Casepase-1蛋白的表达。裂解腓肠肌组织并提取总蛋白,采用BCA法进行蛋白定量,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后,加入相应一抗,4℃孵育过夜,TBST漂洗3次后,加入相应二抗孵育1 h,TBST漂洗3次,洗膜后使用Millipore显色试剂盒进行显色,采用凝胶成像系统拍照。用Image J软件对目的基因条带灰度值进行统计分析。
1.2.7 ELISA试剂盒分别测定小鼠血清中IL-Iβ、IL-18的浓度
各炎症指标的检测操作均按相应ELISA试剂盒说明书步骤进行。
1.3 统计学方法
使用GraphPad Prism V5及SPSS 16.0软件进行制图及数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验;两组间比较采用t检验;方差不齐时采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS腹腔注射成功构建ICU-AW小鼠模型
小鼠腹腔不同浓度LPS注射后,LPS(6 mg/kg)组、LPS(8 mg/kg)组、LPS(10 mg/kg)组在2周的观察期内体重及抓力值无明显变化(图1a、b,P>0.05),而LPS(12 mg/kg)和LPS(14 mg/kg)组小鼠体重和抓力均呈先下降后逐渐升高趋势(图1a、b,P<0.05);组内分析发现,与第0天相比,LPS(12 mg/kg)和LPS(14 mg/kg)组小鼠均在3~5 d时体重和抓力最低(图1a、b,P<0.05)。各组小鼠96 h存活率分析发现,LPS(12 mg/kg)和LPS(14 mg/kg)组小鼠存活率均显著低于Normal组(图1c,P<0.05),而LPS(14 mg/kg)组比LPS(12 mg/kg)组小鼠存活率更低(图1c,P<0.05)。光镜下,Normal组和Vehicle组小鼠腓肠肌肌束结构完整,肌纤维排列紧密,大小形态正常,未见细胞碎裂、溶解;而LPS(12 mg/kg)组出现肌肉萎缩、肌束结构破坏、细胞数量减少、肌纤维排列疏松(图1d)。qPCR检测发现,与Normal组及Vehicle组相比,LPS(12 mg/kg)组小鼠MuRF1(图1e)、Atrogin-1(图1f)表达均显著升高(P<0.01),Western blot检测结果与qPCR趋势一致(图1g,P<0.01)。

a. 体重;b. 抓力;c. 存活率;d. 腓肠肌病理像(HE×200);e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达;f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达;g. 腓肠肌MuRF1和Atrogin-1的蛋白表达。与Normal组及Vehicle组比较,*
2.2 Caspase-1/GSDMD信号通路介导的细胞焦亡可能参与ICU-AW发病过程
各组小鼠腓肠肌qPCR结果提示,与Normal组及Vehicle组相比,LPS组Caspase-1(图2a)和GSDMD(图2b)的mRNA表达及蛋白表达量(图2e)明显升高(P<0.01)。ELISA结果显示,与Normal组及Vehicle组相比,LPS组血清IL-1β(图2c)和IL-18(图2d)的浓度也明显升高(P<0.01)。

a. 腓肠肌Caspase-1 mRNA的表达;b. 腓肠肌GSDMD mRNA的表达;c. 血清IL-1β的浓度;d. 血清IL-18的浓度;e. 腓肠肌Caspase-1和GSDMD的蛋白表达。与Normal组及Vehicle组比较,**
2.3 TMZ可能对ICU-AW小鼠具有保护作用
在LPS造模的基础上予以TMZ干预后,LPS+TMZ组体重及抓力均低于Normal组(图3a、b,P<0.05),但高于LPS组及LPS+TMZ溶剂组(表2,图3a、b,P<0.05);LPS+TMZ组小鼠存活率低于Normal组但高于LPS组及LPS+TMZ溶剂组(图3c,P<0.05);LPS+TMZ组相比LPS组及LPS+TMZ溶剂组肌肉萎缩程度减轻、肌束结构破坏较少、细胞的数量增多(图3d);qPCR检测结果提示,与LPS组及LPS+TMZ溶剂组相比,LPS+TMZ组MuRF1(图3e)、Atrogin-1(图3f)表达均明显降低(P<0.05);Western blot检测结果与qPCR结果趋势一致(图3g,P<0.05)。

a. 体重;b. 抓力;c. 存活率;d. 腓肠肌病理像(HE×200);e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达;f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达;g. 腓肠肌MuRF1和Atrogin-1的蛋白表达。与Normal组比较,*

2.4 TMZ的保护作用可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥作用
在LPS基础上予以TMZ干预后,LPS组、LPS+TMZ溶剂组及LPS+TMZ组Caspase-1和GSDMD的mRNA表达均高于Normal组(图4a、b,P<0.05),但TMZ组Caspase-1和GSDMD的mRNA表达低于LPS组及LPS+TMZ溶剂组(图4a、b,P<0.05);进一步检测血清中IL-1β、IL-18浓度及腓肠肌Caspase-1、GSDMD表达量,发现与qPCR趋势一致(图4c、d、e,P<0.05)。

a. 腓肠肌Caspase-1 mRNA的表达;b. 腓肠肌GSDMD mRNA的表达;c. 血清IL-1β浓度;d. 血清IL-18浓度;e. 腓肠肌Caspase-1及GSDMD的Western blot结果。与Normal组比较,*
2.5 Caspase-1抑制剂AC能够通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡增强TMZ的骨骼肌保护作用
在LPS+TMZ基础上予以Caspase-1抑制剂AC干预后,与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组相比,LPS+TMZ+AC组小鼠体重、抓力明显升高(表3,图5a、b,P<0.05);LPS+TMZ+AC组96 h存活率明显高于LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组(图5c,P<0.05);腓肠肌HE染色结果提示,与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组比较,LPS+TMZ+AC组肌肉萎缩程度减轻,肌束结构破坏较少,细胞的数量增多(图5d);腓肠肌qPCR检测结果提示,与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组比较,LPS+TMZ+AC组MuRF1(图5e)、Atrogin-1(图5f)、Caspase-1(图5g)和GSDMD(图5h)的mRNA表达均显著降低(P<0.05);进一步检测各组GSDMD、Caspase-1蛋白及血清中IL-1β、IL-18浓度,发现与qPCR趋势一致(图5i~k,P<0.05)。


a. 体重;b. 抓力;c. 存活率;d. 腓肠肌病理像(HE×200);e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达;f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达;g. 腓肠肌Caspase-1的mRNA表达;h. 腓肠肌GSDMD的mRNA表达;i. 血清IL-1β的浓度;j. 血清IL-18的浓度;k. 腓肠肌MuRF1、Atrogin-1、Caspase-1、GSDMD的蛋白表达。与LPS+TMZ+AC溶剂组比较,@
3 讨论
ICU-AW是危重症患者的常见并发症,可致机械通气时间延长、ICU住院时间增加、病死率升高以及幸存者生活质量下降[17-18],但目前治疗现状并不满意,主要原因在于发病机制尚不完全清楚、干预手段有限、缺乏特定药物或靶向药物进行治疗[19-21]。因此,对ICU-AW发病机制及干预靶点进行深入研究对ICU-AW的防治具有重要意义。
目前,利用LPS腹腔注射构建ICU-AW模型是研究较多、较为成熟的造模方法[21-22]。但现有文献中LPS造模浓度差异较大,本研究首先给小鼠腹腔注射不同浓度的LPS,综合考虑存活率、炎症程度、骨骼肌功能学和组织学等评价因素对最佳的LPS造模浓度进行了研究。结果发现采用12 mg/kg浓度的LPS腹腔注射造模稳定且小鼠存活率高,在96 h小鼠抓力和体重最低,外周血炎症指标明显升高,骨骼肌出现萎缩,因此将该浓度LPS干预96 h作为后续实验的造模条件。
越来越多的研究表明,细胞焦亡参与诸多炎症反应性疾病的发生发展[23-24],是导致肌肉萎缩的主要机制之一[25]。而GSDMD蛋白是细胞焦亡发生机制中的关键执行者,在细胞焦亡过程中发挥着重要作用。GSDMD在炎性Caspases-1介导下被切割为一个N端片段和C端片段,其中N端片段能在细胞膜上打孔并启动细胞焦亡,进而促成成熟的IL-1β和IL-18释放到胞外[26]。但Caspases-1/GSDMD介导的细胞焦亡在ICU-AW中的作用及调控机制尚不完全清楚。本研究通过腹腔注射LPS制备了ICU-AW小鼠模型,取材其骨骼肌组织进行qPCR、Western blot及病理检测,收集外周血检测炎症因子浓度,发现细胞焦亡相关炎症因子IL-1β和IL-18在血清中大量释放,小鼠腓肠肌中Caspase-1、GSDMD基因和蛋白表达量均明显高于对照组,提示Caspase-1/GSDMD信号通路介导的细胞焦亡可能参与了ICU-AW的发生发展。TMZ已被证实能通过抑制细胞焦亡发挥心肌保护作用[10],TMZ可减轻他汀类药物相关的骨骼肌损伤[27],最新研究还发现TMZ通过抑制细胞焦亡改善地塞米松诱导的肌肉萎缩[11]。由此可见,TMZ和骨骼肌功能调控密切相关[11],但其在ICU-AW状态下能否通过调控Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥骨骼肌保护作用尚无报道。本研究发现TMZ能够改善LPS诱导的小鼠体重减轻和抓力降低,提高存活率,改善腓肠肌萎缩程度,降低萎缩蛋白MuRF1和Atrogin-1的表达,提示TMZ对ICU-AW具有保护作用。进一步检测焦亡相关分子的表达,发现与对照组比较,TMZ组骨骼肌中Caspase-1、GSDMD基因和蛋白的表达明显降低(P<0.05),血清中IL-18、IL-1β浓度也明显降低(P<0.05),提示TMZ的保护作用可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD信号通路发挥作用的。而利用Caspase-1抑制剂AC干预后,发现AC干预能够增强TMZ的骨骼肌保护作用,则进一步证实了TMZ的保护作用依赖于Caspase-1/GSDMD信号通路。本研究首次明确了TMZ在ICU-AW中的作用及干预靶点,为TMZ拓宽适应证并应用于ICU-AW的临床防治提供了理论参考依据。本研究的不足之处在于缺乏临床试验和细胞试验的进一步验证,我们将在下一步的研究中继续探索,为TMZ应用于ICU-AW的防治提供更多参考依据。
综上所述,本研究首次明确了TMZ对ICU-AW具有保护作用,且可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥作用,这对ICU-AW的防治具有重要参考价值。
利益冲突:本研究不涉及任何利益冲突。