引用本文： 王琴, 林宁, 王家雨, 白玉杰, 李玫, 石培洁, 罗书泓, 冯健, 李福祥. 曲美他嗪在重症加强治疗病房获得性衰弱中的作用及机制研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2024, 23(7): 478-487. doi: 10.7507/1671-6205.202312046 复制
重症加强治疗病房获得性衰弱（intensive care unit-acquired weakness，ICU-AW）是脓毒症患者在内的危重患者常见的并发症之一，是导致脓毒症致死率和致残率居高不下的重要原因[1-3]。ICU-AW主要表现为四肢弛缓性无力，且肢体近端肌肉萎缩和无力较为突出[4-5]，此外，呼吸肌也经常受到影响，尤其接受机械通气的患者[6]，其发生机制和脓毒症状态下骨骼肌蛋白质的过度降解[5，7-8]和合成减少[8]密切相关，但脓毒症状态下骨骼肌损伤的机制及调控靶点尚不完全清楚。细胞焦亡是一种细胞程序性死亡，几乎可以影响人体所有的重要系统[9]。曲美他嗪（trimetazidine，TMZ）作为抗心绞痛药物，能够通过抑制细胞焦亡而发挥心肌保护作用[10]，最新研究发现TMZ还可以通过抑制细胞焦亡改善地塞米松诱导的肌肉萎缩[11]。由此可见，TMZ可能参与骨骼肌的代谢过程，但其能否通过调控细胞焦亡途径改善ICU-AW患者的骨骼肌损伤尚未见报道。因此，本研究拟通过小鼠腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）构建ICU-AW小鼠模型，并对TMZ在其中的作用和机制进行研究，为TMZ用于ICU-AW的防治提供可参考的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
8～9周龄SPF级雄性C57BL/6野生型小鼠140只，体重（24.21±1.82）g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供［合格证号SCXK（京）2019-0010］。小鼠在西部战区总医院实验动物中心SPF级动物房常规饲养，室温维持20～25℃，12 h/12 h光照和黑暗交替，给予常规饲料自由饮食，正式实验开始前适应性饲养2周。实验动物中心的资质号SYXK（川）2020-230。本研究获得西部战区总医院实验动物伦理委员会批准（2023EC5-ky010）。
1.1.2 主要试剂
大肠杆菌LPS（O55：L8880；北京索莱宝科技有限公司）；TMZ（13171-25-0；北京沃凯生物科技有限公司）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）抑制剂AC-YVAD-CMK（AC，美国MCE公司），全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司）；抗体肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶1（muscle-specific RING finger protein 1，MuRF1）、Atrogin-1、Caspase-1、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）、β-actin、二抗山羊抗兔购于英国Abcam公司；实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物购于北京擎科生物科技有限公司；苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）试剂盒购于兰杰柯科技有限公司；白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）试剂盒购于（凡科维商城）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及模型制备
选取70只小鼠，随机分为Normal组、LPS溶剂（Vehicle）组、LPS（6 mg/kg）组、LPS（8 mg/kg）组、LPS（10 mg/kg）组、LPS（12 mg/kg）组、LPS（14 mg/kg）组，每组10只。Normal组为空白对照组，各不同浓度的LPS组参考Zhang等[12]研究的造模方法予以腹腔注射LPS构建ICU-AW小鼠模型，Vehicle组予以腹腔注射等体积生理盐水。观察各组小鼠体重、抓力、96 h存活率，选取最佳LPS浓度和取材时间，进一步检测该LPS浓度及取材时间对小鼠腓肠肌萎缩蛋白MuRF1、Atrogin-1的mRNA和蛋白表达的影响，以验证ICU-AW造模是否成功。根据前期研究结果最终选取LPS（12 mg/kg）腹腔注射96 h作为后续实验造模方法。
造模成功后另取70只小鼠随机分为Normal组、Vehicle组、LPS组、LPS+TMZ溶剂组、LPS+TMZ组、LPS+TMZ+AC溶剂组、LPS+TMZ+AC组，每组10只。Normal组不做任何干预；Vehicle组腹腔注射LPS溶液等体积生理盐水；剩余各组均腹腔注射LPS（12 mg/kg）；LPS注射完成后，LPS+TMZ组、LPS+TMZ+AC溶剂组、LPS+TMZ+AC组予以TMZ（5 mg·kg–1·d–1）灌胃[13-14]，每天1次，持续4 d；LPS+TMZ溶剂组予以TMZ等量生理盐水灌胃，每天1次，持续4 d；其中，LPS+TMZ+AC组在LPS注射前1 h腹腔注射Caspase-1抑制剂AC［溶解在DMSO中，再用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）稀释，DMSO终浓度<1.67%，剂量为6.5 mg/kg[15]］；LPS+TMZ+AC溶剂组注射等量AC溶剂PBS。TMZ治疗结束后，检测各组小鼠体重、抓力、96 h存活率，腓肠肌MuRF1、Atrogin-1、Caspase-1、GSDMD的mRNA和蛋白表达，以及小鼠血清IL-1β和IL-18的浓度，腓肠肌进行HE染色观察组织病理变化。
1.2.2 小鼠肌肉力量的检测
按Witteveen等[16]的抓力检测方法，从造模开始前1天至第14天，每天用无创小鼠抓力仪测量小鼠前肢肌肉抓力。每次测试前抓力仪调零。小鼠安静状态下，右手提小鼠尾巴，将小鼠的前肢放在抓力测试仪金属网上，匀速向后拉动小鼠，使小鼠向后移动至金属网最后一格，每次测量时当小鼠将爪子从网格上松开时，会收缩肢体，此时金属板连接着的抓力仪主机显示器将显示当次小鼠抓力峰值。每次测量后给予小鼠充分休息，连续测量5次，去掉最大值、最小值，剩余3次结果取平均值，即为抓力值。所有测试由一人操作，以减少测量误差。
1.2.3 血液及组织学标本的采集
每组小鼠在造模成功后第4天通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉，麻醉成功后，采用摘眼球取血法采集血液标本，静置30 min以后，离心，分离血清，保存于–80℃冰箱，备后续检测用。留取小鼠一侧腓肠肌，将所取标本置入4%多聚甲醛溶液中24 h以上，另一侧腓肠肌置于–80℃冰箱中保存待检。
1.2.4 腓肠肌组织学检查
HE染色：取固定后的小鼠腓肠肌标本，进行脱水、石蜡包埋，4 μm厚度切片，按照HE染色试剂盒操作说明书步骤进行HE染色，并在光学显微镜下观察、拍照。
1.2.5 qPCR检测mRNA表达
采用qPCR检测腓肠肌中MuRF1、Atrogin-1、GSDMD、Casepase-1基因的表达（引物序列见表1）。采用Trizol法提取腓肠肌组织标本中的总RNA，离心、RNA洗涤、再溶解，测定总Caspase-1、GSDMD的RNA浓度及纯度，最后进行引物设计及PCR反应。
表1
基因引物序列
1.2.6 蛋白免疫印迹（Western blot）测定蛋白的含量
采用Western blot检测腓肠肌中MuRF1、Atrogin-1、GSDMD、Casepase-1蛋白的表达。裂解腓肠肌组织并提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后，加入相应一抗，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后，加入相应二抗孵育1 h，TBST漂洗3次，洗膜后使用Millipore显色试剂盒进行显色，采用凝胶成像系统拍照。用Image J软件对目的基因条带灰度值进行统计分析。
1.2.7 ELISA试剂盒分别测定小鼠血清中IL-Iβ、IL-18的浓度
各炎症指标的检测操作均按相应ELISA试剂盒说明书步骤进行。
1.3 统计学方法
使用GraphPad Prism V5及SPSS 16.0软件进行制图及数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用t检验；方差不齐时采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS腹腔注射成功构建ICU-AW小鼠模型
小鼠腹腔不同浓度LPS注射后，LPS（6 mg/kg）组、LPS（8 mg/kg）组、LPS（10 mg/kg）组在2周的观察期内体重及抓力值无明显变化（图1a、b，P>0.05），而LPS（12 mg/kg）和LPS（14 mg/kg）组小鼠体重和抓力均呈先下降后逐渐升高趋势（图1a、b，P<0.05）；组内分析发现，与第0天相比，LPS（12 mg/kg）和LPS（14 mg/kg）组小鼠均在3～5 d时体重和抓力最低（图1a、b，P<0.05）。各组小鼠96 h存活率分析发现，LPS（12 mg/kg）和LPS（14 mg/kg）组小鼠存活率均显著低于Normal组（图1c，P<0.05），而LPS（14 mg/kg）组比LPS（12 mg/kg）组小鼠存活率更低（图1c，P<0.05）。光镜下，Normal组和Vehicle组小鼠腓肠肌肌束结构完整，肌纤维排列紧密，大小形态正常，未见细胞碎裂、溶解；而LPS（12 mg/kg）组出现肌肉萎缩、肌束结构破坏、细胞数量减少、肌纤维排列疏松（图1d）。qPCR检测发现，与Normal组及Vehicle组相比，LPS（12 mg/kg）组小鼠MuRF1（图1e）、Atrogin-1（图1f）表达均显著升高（P<0.01），Western blot检测结果与qPCR趋势一致（图1g，P<0.01）。
图1
LPS腹腔注射构建ICU-AW模型小鼠生理指标及骨骼肌变化比较
a. 体重；b. 抓力；c. 存活率；d. 腓肠肌病理像（HE×200）；e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达；f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达；g. 腓肠肌MuRF1和Atrogin-1的蛋白表达。与Normal组及Vehicle组比较，*
2.2 Caspase-1/GSDMD信号通路介导的细胞焦亡可能参与ICU-AW发病过程
各组小鼠腓肠肌qPCR结果提示，与Normal组及Vehicle组相比，LPS组Caspase-1（图2a）和GSDMD（图2b）的mRNA表达及蛋白表达量（图2e）明显升高（P<0.01）。ELISA结果显示，与Normal组及Vehicle组相比，LPS组血清IL-1β（图2c）和IL-18（图2d）的浓度也明显升高（P<0.01）。
图2
各组小鼠焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD表达情况及血清IL-1β、IL-18浓度
a. 腓肠肌Caspase-1 mRNA的表达；b. 腓肠肌GSDMD mRNA的表达；c. 血清IL-1β的浓度；d. 血清IL-18的浓度；e. 腓肠肌Caspase-1和GSDMD的蛋白表达。与Normal组及Vehicle组比较，**
2.3 TMZ可能对ICU-AW小鼠具有保护作用
在LPS造模的基础上予以TMZ干预后，LPS+TMZ组体重及抓力均低于Normal组（图3a、b，P<0.05），但高于LPS组及LPS+TMZ溶剂组（表2，图3a、b，P<0.05）；LPS+TMZ组小鼠存活率低于Normal组但高于LPS组及LPS+TMZ溶剂组（图3c，P<0.05）；LPS+TMZ组相比LPS组及LPS+TMZ溶剂组肌肉萎缩程度减轻、肌束结构破坏较少、细胞的数量增多（图3d）；qPCR检测结果提示，与LPS组及LPS+TMZ溶剂组相比，LPS+TMZ组MuRF1（图3e）、Atrogin-1（图3f）表达均明显降低（P<0.05）；Western blot检测结果与qPCR结果趋势一致（图3g，P<0.05）。
图3
TMZ干预后各组小鼠生理指标及骨骼肌变化
a. 体重；b. 抓力；c. 存活率；d. 腓肠肌病理像（HE×200）；e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达；f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达；g. 腓肠肌MuRF1和Atrogin-1的蛋白表达。与Normal组比较，*
表2
TMZ干预前后各组小鼠体重及抓力变化（x±s，n=10）
2.4 TMZ的保护作用可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥作用
在LPS基础上予以TMZ干预后，LPS组、LPS+TMZ溶剂组及LPS+TMZ组Caspase-1和GSDMD的mRNA表达均高于Normal组（图4a、b，P<0.05），但TMZ组Caspase-1和GSDMD的mRNA表达低于LPS组及LPS+TMZ溶剂组（图4a、b，P<0.05）；进一步检测血清中IL-1β、IL-18浓度及腓肠肌Caspase-1、GSDMD表达量，发现与qPCR趋势一致（图4c、d、e，P<0.05）。
图4
各组小鼠骨骼肌焦亡通路蛋白Caspase-1、GSDMD的表达量及血清IL-1β、IL-18浓度
a. 腓肠肌Caspase-1 mRNA的表达；b. 腓肠肌GSDMD mRNA的表达；c. 血清IL-1β浓度；d. 血清IL-18浓度；e. 腓肠肌Caspase-1及GSDMD的Western blot结果。与Normal组比较，*
2.5 Caspase-1抑制剂AC能够通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡增强TMZ的骨骼肌保护作用
在LPS+TMZ基础上予以Caspase-1抑制剂AC干预后，与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组相比，LPS+TMZ+AC组小鼠体重、抓力明显升高（表3，图5a、b，P<0.05）；LPS+TMZ+AC组96 h存活率明显高于LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组（图5c，P<0.05）；腓肠肌HE染色结果提示，与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组比较，LPS+TMZ+AC组肌肉萎缩程度减轻，肌束结构破坏较少，细胞的数量增多（图5d）；腓肠肌qPCR检测结果提示，与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组比较，LPS+TMZ+AC组MuRF1（图5e）、Atrogin-1（图5f）、Caspase-1（图5g）和GSDMD（图5h）的mRNA表达均显著降低（P<0.05）；进一步检测各组GSDMD、Caspase-1蛋白及血清中IL-1β、IL-18浓度，发现与qPCR趋势一致（图5i～k，P<0.05）。
表3
Caspase-1抑制剂AC与TMZ干预前后各组小鼠体重及抓力变化（x±s，n=10）
图5
Caspase-1抑制剂AC与TMZ干预后各组小鼠生理指标及骨骼肌变化比较
a. 体重；b. 抓力；c. 存活率；d. 腓肠肌病理像（HE×200）；e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达；f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达；g. 腓肠肌Caspase-1的mRNA表达；h. 腓肠肌GSDMD的mRNA表达；i. 血清IL-1β的浓度；j. 血清IL-18的浓度；k. 腓肠肌MuRF1、Atrogin-1、Caspase-1、GSDMD的蛋白表达。与LPS+TMZ+AC溶剂组比较，@
3 讨论
ICU-AW是危重症患者的常见并发症，可致机械通气时间延长、ICU住院时间增加、病死率升高以及幸存者生活质量下降[17-18]，但目前治疗现状并不满意，主要原因在于发病机制尚不完全清楚、干预手段有限、缺乏特定药物或靶向药物进行治疗[19-21]。因此，对ICU-AW发病机制及干预靶点进行深入研究对ICU-AW的防治具有重要意义。
目前，利用LPS腹腔注射构建ICU-AW模型是研究较多、较为成熟的造模方法[21-22]。但现有文献中LPS造模浓度差异较大，本研究首先给小鼠腹腔注射不同浓度的LPS，综合考虑存活率、炎症程度、骨骼肌功能学和组织学等评价因素对最佳的LPS造模浓度进行了研究。结果发现采用12 mg/kg浓度的LPS腹腔注射造模稳定且小鼠存活率高，在96 h小鼠抓力和体重最低，外周血炎症指标明显升高，骨骼肌出现萎缩，因此将该浓度LPS干预96 h作为后续实验的造模条件。
越来越多的研究表明，细胞焦亡参与诸多炎症反应性疾病的发生发展[23-24]，是导致肌肉萎缩的主要机制之一[25]。而GSDMD蛋白是细胞焦亡发生机制中的关键执行者，在细胞焦亡过程中发挥着重要作用。GSDMD在炎性Caspases-1介导下被切割为一个N端片段和C端片段，其中N端片段能在细胞膜上打孔并启动细胞焦亡，进而促成成熟的IL-1β和IL-18释放到胞外[26]。但Caspases-1/GSDMD介导的细胞焦亡在ICU-AW中的作用及调控机制尚不完全清楚。本研究通过腹腔注射LPS制备了ICU-AW小鼠模型，取材其骨骼肌组织进行qPCR、Western blot及病理检测，收集外周血检测炎症因子浓度，发现细胞焦亡相关炎症因子IL-1β和IL-18在血清中大量释放，小鼠腓肠肌中Caspase-1、GSDMD基因和蛋白表达量均明显高于对照组，提示Caspase-1/GSDMD信号通路介导的细胞焦亡可能参与了ICU-AW的发生发展。TMZ已被证实能通过抑制细胞焦亡发挥心肌保护作用[10]，TMZ可减轻他汀类药物相关的骨骼肌损伤[27]，最新研究还发现TMZ通过抑制细胞焦亡改善地塞米松诱导的肌肉萎缩[11]。由此可见，TMZ和骨骼肌功能调控密切相关[11]，但其在ICU-AW状态下能否通过调控Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥骨骼肌保护作用尚无报道。本研究发现TMZ能够改善LPS诱导的小鼠体重减轻和抓力降低，提高存活率，改善腓肠肌萎缩程度，降低萎缩蛋白MuRF1和Atrogin-1的表达，提示TMZ对ICU-AW具有保护作用。进一步检测焦亡相关分子的表达，发现与对照组比较，TMZ组骨骼肌中Caspase-1、GSDMD基因和蛋白的表达明显降低（P<0.05），血清中IL-18、IL-1β浓度也明显降低（P<0.05），提示TMZ的保护作用可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD信号通路发挥作用的。而利用Caspase-1抑制剂AC干预后，发现AC干预能够增强TMZ的骨骼肌保护作用，则进一步证实了TMZ的保护作用依赖于Caspase-1/GSDMD信号通路。本研究首次明确了TMZ在ICU-AW中的作用及干预靶点，为TMZ拓宽适应证并应用于ICU-AW的临床防治提供了理论参考依据。本研究的不足之处在于缺乏临床试验和细胞试验的进一步验证，我们将在下一步的研究中继续探索，为TMZ应用于ICU-AW的防治提供更多参考依据。
综上所述，本研究首次明确了TMZ对ICU-AW具有保护作用，且可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥作用，这对ICU-AW的防治具有重要参考价值。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
重症加强治疗病房获得性衰弱（intensive care unit-acquired weakness，ICU-AW）是脓毒症患者在内的危重患者常见的并发症之一，是导致脓毒症致死率和致残率居高不下的重要原因[1-3]。ICU-AW主要表现为四肢弛缓性无力，且肢体近端肌肉萎缩和无力较为突出[4-5]，此外，呼吸肌也经常受到影响，尤其接受机械通气的患者[6]，其发生机制和脓毒症状态下骨骼肌蛋白质的过度降解[5，7-8]和合成减少[8]密切相关，但脓毒症状态下骨骼肌损伤的机制及调控靶点尚不完全清楚。细胞焦亡是一种细胞程序性死亡，几乎可以影响人体所有的重要系统[9]。曲美他嗪（trimetazidine，TMZ）作为抗心绞痛药物，能够通过抑制细胞焦亡而发挥心肌保护作用[10]，最新研究发现TMZ还可以通过抑制细胞焦亡改善地塞米松诱导的肌肉萎缩[11]。由此可见，TMZ可能参与骨骼肌的代谢过程，但其能否通过调控细胞焦亡途径改善ICU-AW患者的骨骼肌损伤尚未见报道。因此，本研究拟通过小鼠腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）构建ICU-AW小鼠模型，并对TMZ在其中的作用和机制进行研究，为TMZ用于ICU-AW的防治提供可参考的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
8～9周龄SPF级雄性C57BL/6野生型小鼠140只，体重（24.21±1.82）g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供［合格证号SCXK（京）2019-0010］。小鼠在西部战区总医院实验动物中心SPF级动物房常规饲养，室温维持20～25℃，12 h/12 h光照和黑暗交替，给予常规饲料自由饮食，正式实验开始前适应性饲养2周。实验动物中心的资质号SYXK（川）2020-230。本研究获得西部战区总医院实验动物伦理委员会批准（2023EC5-ky010）。
1.1.2 主要试剂
大肠杆菌LPS（O55：L8880；北京索莱宝科技有限公司）；TMZ（13171-25-0；北京沃凯生物科技有限公司）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）抑制剂AC-YVAD-CMK（AC，美国MCE公司），全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司）；抗体肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶1（muscle-specific RING finger protein 1，MuRF1）、Atrogin-1、Caspase-1、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）、β-actin、二抗山羊抗兔购于英国Abcam公司；实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物购于北京擎科生物科技有限公司；苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）试剂盒购于兰杰柯科技有限公司；白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）试剂盒购于（凡科维商城）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及模型制备
选取70只小鼠，随机分为Normal组、LPS溶剂（Vehicle）组、LPS（6 mg/kg）组、LPS（8 mg/kg）组、LPS（10 mg/kg）组、LPS（12 mg/kg）组、LPS（14 mg/kg）组，每组10只。Normal组为空白对照组，各不同浓度的LPS组参考Zhang等[12]研究的造模方法予以腹腔注射LPS构建ICU-AW小鼠模型，Vehicle组予以腹腔注射等体积生理盐水。观察各组小鼠体重、抓力、96 h存活率，选取最佳LPS浓度和取材时间，进一步检测该LPS浓度及取材时间对小鼠腓肠肌萎缩蛋白MuRF1、Atrogin-1的mRNA和蛋白表达的影响，以验证ICU-AW造模是否成功。根据前期研究结果最终选取LPS（12 mg/kg）腹腔注射96 h作为后续实验造模方法。
造模成功后另取70只小鼠随机分为Normal组、Vehicle组、LPS组、LPS+TMZ溶剂组、LPS+TMZ组、LPS+TMZ+AC溶剂组、LPS+TMZ+AC组，每组10只。Normal组不做任何干预；Vehicle组腹腔注射LPS溶液等体积生理盐水；剩余各组均腹腔注射LPS（12 mg/kg）；LPS注射完成后，LPS+TMZ组、LPS+TMZ+AC溶剂组、LPS+TMZ+AC组予以TMZ（5 mg·kg–1·d–1）灌胃[13-14]，每天1次，持续4 d；LPS+TMZ溶剂组予以TMZ等量生理盐水灌胃，每天1次，持续4 d；其中，LPS+TMZ+AC组在LPS注射前1 h腹腔注射Caspase-1抑制剂AC［溶解在DMSO中，再用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）稀释，DMSO终浓度<1.67%，剂量为6.5 mg/kg[15]］；LPS+TMZ+AC溶剂组注射等量AC溶剂PBS。TMZ治疗结束后，检测各组小鼠体重、抓力、96 h存活率，腓肠肌MuRF1、Atrogin-1、Caspase-1、GSDMD的mRNA和蛋白表达，以及小鼠血清IL-1β和IL-18的浓度，腓肠肌进行HE染色观察组织病理变化。
1.2.2 小鼠肌肉力量的检测
按Witteveen等[16]的抓力检测方法，从造模开始前1天至第14天，每天用无创小鼠抓力仪测量小鼠前肢肌肉抓力。每次测试前抓力仪调零。小鼠安静状态下，右手提小鼠尾巴，将小鼠的前肢放在抓力测试仪金属网上，匀速向后拉动小鼠，使小鼠向后移动至金属网最后一格，每次测量时当小鼠将爪子从网格上松开时，会收缩肢体，此时金属板连接着的抓力仪主机显示器将显示当次小鼠抓力峰值。每次测量后给予小鼠充分休息，连续测量5次，去掉最大值、最小值，剩余3次结果取平均值，即为抓力值。所有测试由一人操作，以减少测量误差。
1.2.3 血液及组织学标本的采集
每组小鼠在造模成功后第4天通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉，麻醉成功后，采用摘眼球取血法采集血液标本，静置30 min以后，离心，分离血清，保存于–80℃冰箱，备后续检测用。留取小鼠一侧腓肠肌，将所取标本置入4%多聚甲醛溶液中24 h以上，另一侧腓肠肌置于–80℃冰箱中保存待检。
1.2.4 腓肠肌组织学检查
HE染色：取固定后的小鼠腓肠肌标本，进行脱水、石蜡包埋，4 μm厚度切片，按照HE染色试剂盒操作说明书步骤进行HE染色，并在光学显微镜下观察、拍照。
1.2.5 qPCR检测mRNA表达
采用qPCR检测腓肠肌中MuRF1、Atrogin-1、GSDMD、Casepase-1基因的表达（引物序列见表1）。采用Trizol法提取腓肠肌组织标本中的总RNA，离心、RNA洗涤、再溶解，测定总Caspase-1、GSDMD的RNA浓度及纯度，最后进行引物设计及PCR反应。
表1
基因引物序列
1.2.6 蛋白免疫印迹（Western blot）测定蛋白的含量
采用Western blot检测腓肠肌中MuRF1、Atrogin-1、GSDMD、Casepase-1蛋白的表达。裂解腓肠肌组织并提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后，加入相应一抗，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后，加入相应二抗孵育1 h，TBST漂洗3次，洗膜后使用Millipore显色试剂盒进行显色，采用凝胶成像系统拍照。用Image J软件对目的基因条带灰度值进行统计分析。
1.2.7 ELISA试剂盒分别测定小鼠血清中IL-Iβ、IL-18的浓度
各炎症指标的检测操作均按相应ELISA试剂盒说明书步骤进行。
1.3 统计学方法
使用GraphPad Prism V5及SPSS 16.0软件进行制图及数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用t检验；方差不齐时采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS腹腔注射成功构建ICU-AW小鼠模型
小鼠腹腔不同浓度LPS注射后，LPS（6 mg/kg）组、LPS（8 mg/kg）组、LPS（10 mg/kg）组在2周的观察期内体重及抓力值无明显变化（图1a、b，P>0.05），而LPS（12 mg/kg）和LPS（14 mg/kg）组小鼠体重和抓力均呈先下降后逐渐升高趋势（图1a、b，P<0.05）；组内分析发现，与第0天相比，LPS（12 mg/kg）和LPS（14 mg/kg）组小鼠均在3～5 d时体重和抓力最低（图1a、b，P<0.05）。各组小鼠96 h存活率分析发现，LPS（12 mg/kg）和LPS（14 mg/kg）组小鼠存活率均显著低于Normal组（图1c，P<0.05），而LPS（14 mg/kg）组比LPS（12 mg/kg）组小鼠存活率更低（图1c，P<0.05）。光镜下，Normal组和Vehicle组小鼠腓肠肌肌束结构完整，肌纤维排列紧密，大小形态正常，未见细胞碎裂、溶解；而LPS（12 mg/kg）组出现肌肉萎缩、肌束结构破坏、细胞数量减少、肌纤维排列疏松（图1d）。qPCR检测发现，与Normal组及Vehicle组相比，LPS（12 mg/kg）组小鼠MuRF1（图1e）、Atrogin-1（图1f）表达均显著升高（P<0.01），Western blot检测结果与qPCR趋势一致（图1g，P<0.01）。
图1
LPS腹腔注射构建ICU-AW模型小鼠生理指标及骨骼肌变化比较
a. 体重；b. 抓力；c. 存活率；d. 腓肠肌病理像（HE×200）；e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达；f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达；g. 腓肠肌MuRF1和Atrogin-1的蛋白表达。与Normal组及Vehicle组比较，*
2.2 Caspase-1/GSDMD信号通路介导的细胞焦亡可能参与ICU-AW发病过程
各组小鼠腓肠肌qPCR结果提示，与Normal组及Vehicle组相比，LPS组Caspase-1（图2a）和GSDMD（图2b）的mRNA表达及蛋白表达量（图2e）明显升高（P<0.01）。ELISA结果显示，与Normal组及Vehicle组相比，LPS组血清IL-1β（图2c）和IL-18（图2d）的浓度也明显升高（P<0.01）。
图2
各组小鼠焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD表达情况及血清IL-1β、IL-18浓度
a. 腓肠肌Caspase-1 mRNA的表达；b. 腓肠肌GSDMD mRNA的表达；c. 血清IL-1β的浓度；d. 血清IL-18的浓度；e. 腓肠肌Caspase-1和GSDMD的蛋白表达。与Normal组及Vehicle组比较，**
2.3 TMZ可能对ICU-AW小鼠具有保护作用
在LPS造模的基础上予以TMZ干预后，LPS+TMZ组体重及抓力均低于Normal组（图3a、b，P<0.05），但高于LPS组及LPS+TMZ溶剂组（表2，图3a、b，P<0.05）；LPS+TMZ组小鼠存活率低于Normal组但高于LPS组及LPS+TMZ溶剂组（图3c，P<0.05）；LPS+TMZ组相比LPS组及LPS+TMZ溶剂组肌肉萎缩程度减轻、肌束结构破坏较少、细胞的数量增多（图3d）；qPCR检测结果提示，与LPS组及LPS+TMZ溶剂组相比，LPS+TMZ组MuRF1（图3e）、Atrogin-1（图3f）表达均明显降低（P<0.05）；Western blot检测结果与qPCR结果趋势一致（图3g，P<0.05）。
图3
TMZ干预后各组小鼠生理指标及骨骼肌变化
a. 体重；b. 抓力；c. 存活率；d. 腓肠肌病理像（HE×200）；e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达；f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达；g. 腓肠肌MuRF1和Atrogin-1的蛋白表达。与Normal组比较，*
表2
TMZ干预前后各组小鼠体重及抓力变化（x±s，n=10）
2.4 TMZ的保护作用可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥作用
在LPS基础上予以TMZ干预后，LPS组、LPS+TMZ溶剂组及LPS+TMZ组Caspase-1和GSDMD的mRNA表达均高于Normal组（图4a、b，P<0.05），但TMZ组Caspase-1和GSDMD的mRNA表达低于LPS组及LPS+TMZ溶剂组（图4a、b，P<0.05）；进一步检测血清中IL-1β、IL-18浓度及腓肠肌Caspase-1、GSDMD表达量，发现与qPCR趋势一致（图4c、d、e，P<0.05）。
图4
各组小鼠骨骼肌焦亡通路蛋白Caspase-1、GSDMD的表达量及血清IL-1β、IL-18浓度
a. 腓肠肌Caspase-1 mRNA的表达；b. 腓肠肌GSDMD mRNA的表达；c. 血清IL-1β浓度；d. 血清IL-18浓度；e. 腓肠肌Caspase-1及GSDMD的Western blot结果。与Normal组比较，*
2.5 Caspase-1抑制剂AC能够通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡增强TMZ的骨骼肌保护作用
在LPS+TMZ基础上予以Caspase-1抑制剂AC干预后，与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组相比，LPS+TMZ+AC组小鼠体重、抓力明显升高（表3，图5a、b，P<0.05）；LPS+TMZ+AC组96 h存活率明显高于LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组（图5c，P<0.05）；腓肠肌HE染色结果提示，与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组比较，LPS+TMZ+AC组肌肉萎缩程度减轻，肌束结构破坏较少，细胞的数量增多（图5d）；腓肠肌qPCR检测结果提示，与LPS+TMZ组及LPS+TMZ+AC溶剂组比较，LPS+TMZ+AC组MuRF1（图5e）、Atrogin-1（图5f）、Caspase-1（图5g）和GSDMD（图5h）的mRNA表达均显著降低（P<0.05）；进一步检测各组GSDMD、Caspase-1蛋白及血清中IL-1β、IL-18浓度，发现与qPCR趋势一致（图5i～k，P<0.05）。
表3
Caspase-1抑制剂AC与TMZ干预前后各组小鼠体重及抓力变化（x±s，n=10）
图5
Caspase-1抑制剂AC与TMZ干预后各组小鼠生理指标及骨骼肌变化比较
a. 体重；b. 抓力；c. 存活率；d. 腓肠肌病理像（HE×200）；e. 腓肠肌MuRF1的mRNA表达；f. 腓肠肌Atrogin-1的mRNA表达；g. 腓肠肌Caspase-1的mRNA表达；h. 腓肠肌GSDMD的mRNA表达；i. 血清IL-1β的浓度；j. 血清IL-18的浓度；k. 腓肠肌MuRF1、Atrogin-1、Caspase-1、GSDMD的蛋白表达。与LPS+TMZ+AC溶剂组比较，@
3 讨论
ICU-AW是危重症患者的常见并发症，可致机械通气时间延长、ICU住院时间增加、病死率升高以及幸存者生活质量下降[17-18]，但目前治疗现状并不满意，主要原因在于发病机制尚不完全清楚、干预手段有限、缺乏特定药物或靶向药物进行治疗[19-21]。因此，对ICU-AW发病机制及干预靶点进行深入研究对ICU-AW的防治具有重要意义。
目前，利用LPS腹腔注射构建ICU-AW模型是研究较多、较为成熟的造模方法[21-22]。但现有文献中LPS造模浓度差异较大，本研究首先给小鼠腹腔注射不同浓度的LPS，综合考虑存活率、炎症程度、骨骼肌功能学和组织学等评价因素对最佳的LPS造模浓度进行了研究。结果发现采用12 mg/kg浓度的LPS腹腔注射造模稳定且小鼠存活率高，在96 h小鼠抓力和体重最低，外周血炎症指标明显升高，骨骼肌出现萎缩，因此将该浓度LPS干预96 h作为后续实验的造模条件。
越来越多的研究表明，细胞焦亡参与诸多炎症反应性疾病的发生发展[23-24]，是导致肌肉萎缩的主要机制之一[25]。而GSDMD蛋白是细胞焦亡发生机制中的关键执行者，在细胞焦亡过程中发挥着重要作用。GSDMD在炎性Caspases-1介导下被切割为一个N端片段和C端片段，其中N端片段能在细胞膜上打孔并启动细胞焦亡，进而促成成熟的IL-1β和IL-18释放到胞外[26]。但Caspases-1/GSDMD介导的细胞焦亡在ICU-AW中的作用及调控机制尚不完全清楚。本研究通过腹腔注射LPS制备了ICU-AW小鼠模型，取材其骨骼肌组织进行qPCR、Western blot及病理检测，收集外周血检测炎症因子浓度，发现细胞焦亡相关炎症因子IL-1β和IL-18在血清中大量释放，小鼠腓肠肌中Caspase-1、GSDMD基因和蛋白表达量均明显高于对照组，提示Caspase-1/GSDMD信号通路介导的细胞焦亡可能参与了ICU-AW的发生发展。TMZ已被证实能通过抑制细胞焦亡发挥心肌保护作用[10]，TMZ可减轻他汀类药物相关的骨骼肌损伤[27]，最新研究还发现TMZ通过抑制细胞焦亡改善地塞米松诱导的肌肉萎缩[11]。由此可见，TMZ和骨骼肌功能调控密切相关[11]，但其在ICU-AW状态下能否通过调控Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥骨骼肌保护作用尚无报道。本研究发现TMZ能够改善LPS诱导的小鼠体重减轻和抓力降低，提高存活率，改善腓肠肌萎缩程度，降低萎缩蛋白MuRF1和Atrogin-1的表达，提示TMZ对ICU-AW具有保护作用。进一步检测焦亡相关分子的表达，发现与对照组比较，TMZ组骨骼肌中Caspase-1、GSDMD基因和蛋白的表达明显降低（P<0.05），血清中IL-18、IL-1β浓度也明显降低（P<0.05），提示TMZ的保护作用可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD信号通路发挥作用的。而利用Caspase-1抑制剂AC干预后，发现AC干预能够增强TMZ的骨骼肌保护作用，则进一步证实了TMZ的保护作用依赖于Caspase-1/GSDMD信号通路。本研究首次明确了TMZ在ICU-AW中的作用及干预靶点，为TMZ拓宽适应证并应用于ICU-AW的临床防治提供了理论参考依据。本研究的不足之处在于缺乏临床试验和细胞试验的进一步验证，我们将在下一步的研究中继续探索，为TMZ应用于ICU-AW的防治提供更多参考依据。
综上所述，本研究首次明确了TMZ对ICU-AW具有保护作用，且可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡发挥作用，这对ICU-AW的防治具有重要参考价值。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
