引用本文： 夏宇, 考吾沙尔·巴合提江. 应用宏基因组二代测序技术分析慢性阻塞性肺疾病患者合并下呼吸道感染的BALF中微生物群落分布和载量. 中国呼吸与危重监护杂志, 2024, 23(6): 414-422. doi: 10.7507/1671-6205.202312059 复制
慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD，简称慢阻肺）是一种常见的慢性气道疾病，其特征包括持续性气道炎症、小气道阻塞和肺泡结构破坏。目前，慢阻肺已成为严重的公共卫生问题，同时也是全球疾病负担的主要贡献者之一。全球超过3亿人患有慢阻肺 ，每年导致数百万人死亡[1]。而单纯肺炎患者和慢阻肺患者合并下呼吸道感染是两种不同类型的呼吸系统疾病。单纯肺炎通常是由细菌或病毒引起的急性炎症反应，而慢阻肺合并下呼吸道感染则是指在慢性气道疾病的基础上发生的肺炎[2]。Chen等[3]研究提出，患有慢性气道疾病的患者与单纯肺炎患者在微生物组成上存在差异。另一篇文章也指出生物菌群结构及多样性改变与疾病严重程度、病情恶化、炎症程度和治疗方案等因素相关[4]。支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）宏基因组二代测序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）作为一种有效的检测方法，可以更加全面、快速、准确地反映下呼吸道的微生物群分布情况，对明确肺炎病原体具有重要意义[5]。常见的mNGS 报告病原体阳性鉴定标准有相对丰度、每百万有效测序序列数（reads per million，RPM）及严格映射读数（SDSMRN）等，在一项队列研究中，RPM 比率标准表现更好，在识别细菌、真菌和病毒方面具有更高的准确性[6]。该研究还发现RPM可以广泛用于临床医生的mNGS结果解释，并且RPMsample/RP- MNTC技术无论病原体分类如何，比率标准均优于其他标准[6]。目前，我国基于高通量测序的慢阻肺合并下呼吸道感染相关研究较少，本研究通过分析慢阻肺合并下呼吸道感染患者与单纯肺炎患者BALF菌群分布差异及微生物载量与感染程度之间的关系，为早期诊断提供参考依据，从而指导在紧急情况下的经验治疗。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2021年12月—2023年3月新疆医科大学第一附属医院收住入院经临床诊断为肺炎的患者，根据纳入及排除标准本研究共纳入97例研究对象，包括单纯肺炎患者52例，慢阻肺合并下呼吸道感染患者45例。所有患者均行BALF的mNGS 检测及常规微生物学检测（conventional microbiological tests，CMTs）。收集患者一般资料，包括年龄、性别、吸烟史及mNGS报告（结论与RPM值）。根据基础疾病分为单纯肺炎组（既往无基础疾病史）和慢阻肺合并下呼吸道感染组（合并阻塞性肺疾病，而无其他系统合并症）。分别在两组中根据重症肺炎诊断标准再分为重症肺炎及非重症肺炎两个亚组。本研究将分枝杆菌属、诺卡菌属、衣原体/支原体属等病原体归为其他微生物类型。本研究通过新疆医科大学第一附属医学伦理委员会批准（编号K202310-10）。
1.2 方法
1.2.1 社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）临床诊断标准
（1）社区发病。（2）相关临床表现：① 新近出现的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病症状加重，伴或不伴脓痰、胸痛、呼吸困难及咯血；② 发热；③ 肺实变体征和（或） 闻及湿啰音；④ 外周血白细胞>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴细胞核左移。（3）胸部影像学检查：显示新出现的斑片状浸润影、叶或段实变影、磨玻璃影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液。符合（1）与（3），以及（2）中的任何 1 项，并除外肺结核、肺部肿瘤、非感染性肺间质性疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、肺嗜酸粒细胞浸润症及肺血管炎等，可建立临床诊断[7]。
1.2.2 医院获得性肺炎（hospital-acquired pneumonia， HAP）/呼吸机相关性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）
临床诊断标准：HAP 是指患者住院期间没有接受有创机械通气、未处于病原感染的潜伏期，而于入院 48 h 后新发生的肺炎。VAP 是指气管插管或气管切开患者接受机械通气 48 h后发生的肺炎，机械通气撤机、拔管后48 h内出现的肺炎也属于VAP范畴。HAP/VAP 临床诊断标准[8]：胸部 X 线或CT显示新出现或进展性的浸润影、实变影或磨玻璃影，同时具有下列 3 种临床症候中的 2 种或以上，可建立临床诊断：（1）体温>38 ℃；（2）脓性气道分泌物；（3）外周血白细胞计数>10×109 /L或<4×109 /L。
1.2.3 慢阻肺合并下呼吸道感染
慢阻肺合并下呼吸道感染是指慢阻肺患者因细菌、病毒或其他病原体感染而出现的急性加重症状。这种情况通常涉及支气管和/或肺部，导致症状明显加剧。慢阻肺 的诊断标准参考《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013年修订版）》[9]，下呼吸道感染的诊断标准参考《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016 年版）》[7]。
1.2.4 重症肺炎
符合 2019 年美国感染病学会/美国胸科学会《成人社区获得性肺炎诊治指南》中关于重症肺炎的相关诊断[10]，即符合以下1 项主要标准或至少 3 项次要标准可诊断为重症肺炎。主要标准：（1）脓毒症休克经积极液体复苏后仍需血管活性药物治疗；（2）需行气管插管进行机械通气治疗。次要标准：（1）体温<36℃；（2）血小板计数<100×109/L；（3）白细胞计数<4×109/L；（3）氧合指数≤250 mm Hg；（3）呼吸频率≥30 次/min；（4）血尿素氮≥20 mg/dL；（5）意识障碍；（6）多肺叶受累；（7）低血压需液体复苏。
1.2.5 纳入及排除标准
纳入标准：（1）年龄≥ 18岁；（2）符合CAP/HAP/VAP诊断标准；（3）同时完善 BALF mNGS 及CMTs。排除标准：（1）对纤支镜检查存在相关禁忌者；（2）排除慢阻肺以外的慢性病，如心血管疾病、糖尿病、肺癌、免疫系统疾病等；（3）临床信息不全。需要强调的是，临床医生需要依据患者病情、临床表现、影像学检查、经验，甚至多学科会诊，全面分析 mNGS 结果，最终确定致病病原体。
1.3 mNGS检测
1.3.1 BALF标本处理和测序
BALF标本检测程序按照标准安全规程进行，将采集完的BALF标本送往杭州杰毅医学检验实验室有限公司。首先，利用生物样品均质仪对BALF样本中微生物的细胞壁进行破碎，以提高后续核酸提取的效率。从每个样本中取1.2 mL置于震荡管中进行均质处理。之后，采用核酸提取试剂盒（磁珠法）和全自动核酸提取仪，从样本中提取DNA和RNA。对于RNA样本，进行逆转录以生成cDNA。通过mNGS技术，无偏移地测序样本中的所有核酸，从而分析样本中存在的微生物组。为确保测序质量，每次测序都包括一个不含任何DNA或RNA的阴性对照和一个包含已知灭活微生物的阳性对照，以监控实验过程中的潜在污染和验证测序流程的准确性。
1.3.2 数据库的建立
在本研究中，我们采用标准的文库构建流程进行核酸的片段化、末端修复、A尾添加和接头（index）连接，以构建适用于Illumina Nextseq™高通量测序平台的文库。我们计划通过这一平台进行测序，以获得大量的序列数据，虽然预期每个文库能产生约2 000万条序列数据，实际数据量可能根据测序配置和需求有所不同。序列数据将经过生物信息学分析，包括去除人类基因组数据和与微生物参考数据库的比对。我们将使用专业的病原微生物基因数据分析软件处理这些数据，首先过滤掉匹配到人类参考基因组GRCh38.p13的序列，然后将剩余的序列与NCBI GenBank以及我们内部策划的微生物基因组数据库比对。这个数据库包含超过35 257种病原微生物的信息。
1.3.3 mNGS汇报规则
① 序列数据满足质控要求（文库浓度>50 pM，Q20>85%，Q30>80%）；② 阴性对照 （NC）在同一张芯片中未检测到该物种或RPM（样本）/ RPM （NC）≥5，这是根据以往的研究经验确定的，作为从背景污染中区分真阳性的阈值。
1.3.4 mNGS阳性结果的标准
① 临床常见机会致病微生物、临床非典型呼吸道机会致病菌、临床非典型呼吸道机会致病菌，该复合群或物种为属第一或与属第一RPM相差5倍以内，且序列数≥10；② 检出常见的呼吸道定植菌，若其所在属的相对丰度超过50%；③ 临床关注肺脓肿或明确厌氧菌感染的患者，定植菌中属排名前5位的定植菌相加属≥50%；④ 检出下列CAP和HAP常见的致病病原体，即使所在属的相对丰度在该文库中所有微生物属的排位中在10位之后，只要排除hopping和污染，均放入疑似列表；⑤ 真菌：念珠菌属所在属的序列数≥200；耶氏肺孢子菌序列数>50；呼吸道常见致病真菌++、或真菌，且序列数≥10；⑥ 病毒：检出疱疹病毒（除8型外）时，序列数≥200；⑦ 寄生虫：序列数≥50。
1.4 统计学方法
采用SPSS 26.0、 GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据处理及绘图。计数资料用例数和百分比表示，比较采用皮尔森χ2 检验（不超过 20% 的格子理论频数或期望频数 T<5）。对计量指标进行正态性检验及方差齐性检验，满足正态分布及方差齐性的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用独立样本 t 检验。Mann-Whitney U 检验用于比较两组间微生物菌群RPM值之间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
共纳入97例肺炎患者，单纯肺炎组52例，平均年龄53.60岁，其中男性31例。慢阻肺合并下呼吸道感染组45例，平均年龄65.73岁，其中男性26例。两组年龄和吸烟指数差异有统计学意义（P<0.05），在性别、mNGS阳性率、重症肺炎方面差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。
表表 1
患者的一般临床信息特征
2.2 微生物分析
2.2.1 微生物总体分布特征
在97例肺炎患者的测序结果中，mNGS微生物阳性患者有80例（81.82%），对两组检测到的所有微生物在属与种水平分布进行比较。属水平比较：单纯肺炎组在属水平检出19种微生物，细菌有8种（42.11%），检出频率最多的是不动杆菌属、棒状杆菌属；真菌2种（10.53%），分别是假丝酵母菌属、肺孢子菌属；病毒3种（15.79%），分别是单纯疱疹病毒属、巨细胞病毒属及淋巴隐病毒属；其他类型微生物6种（31.58%），检出频率最多的是分枝杆菌属和诺卡菌属。而慢阻肺合并下呼吸道感染组在属水平检出22种微生物，细菌有10种（47.62%），检出频率最多的假单胞菌属和链球菌属；真菌3种（14.29%），分别是假丝酵母菌属、肺孢子菌属和曲霉菌属；病毒4种（19.05%），分别是肠道病毒属、淋巴隐病毒属、β多瘤病毒属和单纯疱疹病毒属；其他类型微生物4种（19.05%），检出频率最多的是分枝杆菌和诺卡菌属。检出种类、数量及比例见图1a与图2。在种水平比较：单纯肺炎组在种水平检出23种微生物，细菌有9种（39.13%），检出频率最多的是鲍曼不动杆菌和纹带棒状杆菌；真菌2种（8.70%），分别是白色假丝酵母菌和耶氏肺孢子菌；病毒3种（13.04%），分别是人疱疹病毒1型、4型、5型；其他类型微生物9种（39.13%），检出频率最多的是结核分枝杆菌复合群和鹦鹉热衣原体。而慢阻肺合并下呼吸道感染组在种水平检出30种微生物，细菌有12种（38.71%），检出频率最多的是铜绿假单胞菌；真菌9种（29.03%），检出频率最多的是白色假丝酵母菌和烟曲霉；病毒5种（12.90%），检出频率最多的是人疱疹病毒4型；其他类型微生物6种（19.35%），检出频率最多的是结核分枝杆菌复合群。检出种类、数量及比例见图1b与图3。
2.2.2 不同感染类型微生物RPM值比较
不同程度肺炎的微生物在属和种水平存在一定的差异。在属水平的比较结果发现，在非重症肺炎中，慢阻肺合并下呼吸道感染组细菌RPM值显著高于单纯肺炎组（Z=–2.706，P=0.007）；对于真菌、病毒，慢阻肺合并下呼吸道感染组RPM值高于单纯肺炎组；对于其他微生物，单纯肺炎组RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染组，但差异均无统计学意义。在种水平非重症肺炎，对于真菌、病毒，慢阻肺合并下呼吸道感染组RPM值高于单纯肺炎组，对于细菌、其他微生物，单纯肺炎组RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染组，但差异均无统计学意义。结果见表2。在重症肺炎中，在属和种水平，对于细菌、其他微生物，慢阻肺合并下呼吸道感染组RPM值高于单纯肺炎组；对于真菌、病毒，单纯肺炎组RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染组，但差异均无统计学意义。结果见表3。
表表 2
两组非重症肺炎微生物RPM值比较
表表 3
两组重症肺炎微生物RPM值比较
2.2.3 不同亚组微生物RPM值比较
不论在属水平还是在种水平，单纯肺炎组的重症肺炎细菌RPM值显著高于非重症肺炎组（Z=−2.202，P=0.028；Z=−2.141，P=0.032）。结果见表4。慢阻肺合并重症肺炎时细菌RPM值只有在种水平显著高于非重症肺炎（Z=−2.367，P=0.017）。结果见表5。不论在单纯肺炎组还是在慢阻肺合并下呼吸道感染组，真菌、病毒RPM值在属和种水平重症肺炎高于非重症肺炎；其他微生物RPM值在属和种水平非重症肺炎高于重症肺炎，但差异均无统计意义。
表表 4
单纯肺炎组微生物RPM值比较
表表 5
慢阻肺合并下呼吸道感染组微生物RPM比较
3 讨论
肺炎是临床上最常见的感染性疾病之一， 由肺炎引起的急性缺氧性呼吸衰竭是患者收治重症监护室的主要原因 。如何早期、快速诊断病原体，从而精准用药，缩短住院时间，减少并发症及降低病死率至关重要。BALF相比其他类型标本，能更好地反映下呼吸道菌群分布，结合mNGS的高灵敏度、无偏移检测及病原体覆盖度广等优势[11]，BALF的mNGS检测技术在肺炎微生物检测方面表现出较好的临床诊断效能[12]。
本研究以BALF的mNGS为基础，比较单纯肺炎组与慢阻肺合并下呼吸道感染组下呼吸道微生物分布特征，结果发现在97例肺炎患者的测序结果中，微生物阳性患者有80例（81.82%）。本研究发现，慢阻肺合并下呼吸道感染组吸烟指数显著高于单纯肺炎组（t=−3.62，P=0.001），有研究发现吸烟和气流受限会增加假单胞菌属和链球菌属感染风险[13-15]。在本研究中，慢阻肺合并下呼吸道感染组中有59.46%的吸烟患者，而且75.68%患者明确存在气流受限，本研究在属水平优势细菌为假单胞菌属、链球菌属，与上述研究结果一致。
不论在单纯肺炎组还是在慢阻肺合并下呼吸道感染组，在属水平和种水平检出频率最多的是细菌，但细菌属种类并不相同，在单纯肺炎患者最常见的菌属不动杆菌属，与Huang等[16]的研究结果不同，可能由于本研究单纯肺炎组纳入的患者因车祸、骨折等因素收住重症监护室或者在外院经验性抗生素抗感染治疗欠佳后转入我院。还发现不同微生物在种分布上存在差异，在种水平单纯肺炎组最常见的是结核分枝杆菌，可能是因为我国仍属于发展中国家，而且新疆地区本来就是肺结核高发地区，这与其他研究结果相似[15，17-18]。慢阻肺合并下呼吸道感染组检出频率最高的是铜绿假单胞菌，反复肺炎、长期住院史以及接受有创呼吸机辅助呼吸等均是铜绿假单胞菌感染的危险因素，尤其是耐药菌的感染[19-20]。
曲霉、假丝酵母菌、耶氏肺孢子菌在慢阻肺合并下呼吸道感染组中的检出率较高，在种类和数量上远超过单纯肺炎组，这也进一步证实了慢阻肺等慢性气道疾病会增加真菌感染的风险，与Chen等[3]对220例疑似肺炎患者的研究结果一致。单纯疱疹病毒1型和5型在单纯肺炎组中检出率较高，病毒在多数情况下（83.33%）是与其他微生物混合感染，而混合感染会明显增加疾病的严重程度，这也提示我们在临床工作应认识到多种微生物感染的重要性。本研究中，3例重症感染患者鉴定为鹦鹉热衣原体感染，鹦鹉热衣原体肺炎是一种动物源性感染性疾病，感染后部分患者不典型起病，尤其在老年患者中，上呼吸道感染症状不明显，发热不典型，较易误诊，很容易发展成重症肺炎危及生命[21]。近年来，越来越多的研究证实肺诺卡菌病会发生在患有肺部基础疾病患者中[22]，在我们的研究中检出7例诺卡菌患者中有5例既往或者入院后诊断患有慢阻肺等肺基础疾病。提示临床医生在遇到不明原因的肺炎患者时，不能排除这些少见的致病病原体。
在本研究中，我们使用RPM值代表微生物检出载量，为进一步探索微生物载量与慢阻肺和感染程度之间的关系，我们将两组根据感染程度再分亚组，即重症肺炎和非重症肺炎，结果发现在非重症肺炎组中，慢阻肺合并下呼吸道感染组细菌RPM值在属水平显著高于单纯肺炎组，差异有统计学意义，这说明，慢阻肺等慢性气道疾病可能会增加微生物RPM值。单纯肺炎组重症肺炎细菌RPM值在属和种水显著高于非重症感染组；而慢阻肺合并重症肺炎时细菌RPM值在属和种水平也高于非重症肺炎，但属水平差异无统计学意义，本研究中的差异不显著可能与样本量较少有关，但也可以说明微生物RPM值可能与感染严重程度有关系，即载量越高，感染越重。对于真菌，不论在慢阻肺合并下呼吸道感染组还是在单纯肺炎组，RPM值均较小，各亚组间的差异也没有统计学意义，考虑与真菌在mNGS测序过程中需要破壁导致其载量减低相关[20，23]，因此在临床中不能忽视对低载量真菌感染的诊断。
研究表明一种微生物的存在可能会促进或抑制其他微生物的定植[24-25]。在我们研究中，从整体水平来说，病毒RPM值与其他微生物RPM值在各亚组中的大小恰恰相反。对于病毒，重症感染RPM值高于非重症感染，慢阻肺合并下呼吸道感染组RPM值高于单纯肺炎组；而其他类型微生物，如分枝杆菌和诺卡菌属等，非重症感染RPM值高于重症感染，单纯肺炎组高于慢阻肺合并下呼吸道感染组，这可能与重症感染及多种微生物混合感染会影响不同微生物载量有关。因此需要更多临床研究证明，肺炎时病毒载量的增加或不典型微生物载量的减少是否能提示判断感染程度加重。这是第一份使用RPM值载量探索RPM值与慢阻肺和感染程度的研究，RPM值可在mNGS报告中得到，同时对于本研究结果需要更多研究证实其RPM值对疾病炎症程度的效能。
本研究还存在以下不足：（1）本研究为回顾性，可能存在信息偏移；（2）样本量相对较少；（3）微生物研究个体差异较大，容易受到气候、环境及地区因素干扰；（4）在慢阻肺组中部分患者同时患有支气管扩张症及支气管哮喘等其他肺部疾病，这可能会影响其结果的可靠性与准确性，未来需要更大规模的研究结合临床感染指标进一步分析RPM值与慢阻肺和肺炎严重程度的关系，从而指导临床治疗。
综上所述，本研究通过BALF的mNGS检测技术，对单纯肺炎及慢阻肺合并下呼吸道感染患者的BALF菌群分布特征分析，发现细菌为最主要的微生物，但两组优势细菌类型并不相同，单纯肺炎组与慢阻肺合并下呼吸道感染组的优势细菌分别为不动杆菌属和假单胞菌属。非典型微生物在单纯肺炎组占比较高，而真菌更多见于慢阻肺合并下呼吸道感染组，这种菌群分布上的差异提示，在临床工作中，对于单纯肺炎患者除了经验性覆盖治疗以外，不能忽视非典型微生物的感染，而mNGS对于非典型病原体诊断拥有独特优势；而对于慢阻肺合并下呼吸道感染患者应尽可能同步完善真菌相关检查。此外，慢阻肺合并下呼吸道感染组的细菌RPM值显著高于单纯肺炎组，重症肺炎细菌RPM值显著高于非重症肺炎，这种差异是否提示RPM值成为提示肺炎严重程度的预测指标，以及对于真菌和某些胞内细菌及病毒这些被认为是低载量微生物，是否有其他更好的mNGS指标提示肺炎严重程度，仍需进一步研究。
利益冲突：本文不涉及任何利益冲突
慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD，简称慢阻肺）是一种常见的慢性气道疾病，其特征包括持续性气道炎症、小气道阻塞和肺泡结构破坏。目前，慢阻肺已成为严重的公共卫生问题，同时也是全球疾病负担的主要贡献者之一。全球超过3亿人患有慢阻肺 ，每年导致数百万人死亡[1]。而单纯肺炎患者和慢阻肺患者合并下呼吸道感染是两种不同类型的呼吸系统疾病。单纯肺炎通常是由细菌或病毒引起的急性炎症反应，而慢阻肺合并下呼吸道感染则是指在慢性气道疾病的基础上发生的肺炎[2]。Chen等[3]研究提出，患有慢性气道疾病的患者与单纯肺炎患者在微生物组成上存在差异。另一篇文章也指出生物菌群结构及多样性改变与疾病严重程度、病情恶化、炎症程度和治疗方案等因素相关[4]。支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）宏基因组二代测序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）作为一种有效的检测方法，可以更加全面、快速、准确地反映下呼吸道的微生物群分布情况，对明确肺炎病原体具有重要意义[5]。常见的mNGS 报告病原体阳性鉴定标准有相对丰度、每百万有效测序序列数（reads per million，RPM）及严格映射读数（SDSMRN）等，在一项队列研究中，RPM 比率标准表现更好，在识别细菌、真菌和病毒方面具有更高的准确性[6]。该研究还发现RPM可以广泛用于临床医生的mNGS结果解释，并且RPMsample/RP- MNTC技术无论病原体分类如何，比率标准均优于其他标准[6]。目前，我国基于高通量测序的慢阻肺合并下呼吸道感染相关研究较少，本研究通过分析慢阻肺合并下呼吸道感染患者与单纯肺炎患者BALF菌群分布差异及微生物载量与感染程度之间的关系，为早期诊断提供参考依据，从而指导在紧急情况下的经验治疗。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2021年12月—2023年3月新疆医科大学第一附属医院收住入院经临床诊断为肺炎的患者，根据纳入及排除标准本研究共纳入97例研究对象，包括单纯肺炎患者52例，慢阻肺合并下呼吸道感染患者45例。所有患者均行BALF的mNGS 检测及常规微生物学检测（conventional microbiological tests，CMTs）。收集患者一般资料，包括年龄、性别、吸烟史及mNGS报告（结论与RPM值）。根据基础疾病分为单纯肺炎组（既往无基础疾病史）和慢阻肺合并下呼吸道感染组（合并阻塞性肺疾病，而无其他系统合并症）。分别在两组中根据重症肺炎诊断标准再分为重症肺炎及非重症肺炎两个亚组。本研究将分枝杆菌属、诺卡菌属、衣原体/支原体属等病原体归为其他微生物类型。本研究通过新疆医科大学第一附属医学伦理委员会批准（编号K202310-10）。
1.2 方法
1.2.1 社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）临床诊断标准
（1）社区发病。（2）相关临床表现：① 新近出现的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病症状加重，伴或不伴脓痰、胸痛、呼吸困难及咯血；② 发热；③ 肺实变体征和（或） 闻及湿啰音；④ 外周血白细胞>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴细胞核左移。（3）胸部影像学检查：显示新出现的斑片状浸润影、叶或段实变影、磨玻璃影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液。符合（1）与（3），以及（2）中的任何 1 项，并除外肺结核、肺部肿瘤、非感染性肺间质性疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、肺嗜酸粒细胞浸润症及肺血管炎等，可建立临床诊断[7]。
1.2.2 医院获得性肺炎（hospital-acquired pneumonia， HAP）/呼吸机相关性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）
临床诊断标准：HAP 是指患者住院期间没有接受有创机械通气、未处于病原感染的潜伏期，而于入院 48 h 后新发生的肺炎。VAP 是指气管插管或气管切开患者接受机械通气 48 h后发生的肺炎，机械通气撤机、拔管后48 h内出现的肺炎也属于VAP范畴。HAP/VAP 临床诊断标准[8]：胸部 X 线或CT显示新出现或进展性的浸润影、实变影或磨玻璃影，同时具有下列 3 种临床症候中的 2 种或以上，可建立临床诊断：（1）体温>38 ℃；（2）脓性气道分泌物；（3）外周血白细胞计数>10×109 /L或<4×109 /L。
1.2.3 慢阻肺合并下呼吸道感染
慢阻肺合并下呼吸道感染是指慢阻肺患者因细菌、病毒或其他病原体感染而出现的急性加重症状。这种情况通常涉及支气管和/或肺部，导致症状明显加剧。慢阻肺 的诊断标准参考《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013年修订版）》[9]，下呼吸道感染的诊断标准参考《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016 年版）》[7]。
1.2.4 重症肺炎
符合 2019 年美国感染病学会/美国胸科学会《成人社区获得性肺炎诊治指南》中关于重症肺炎的相关诊断[10]，即符合以下1 项主要标准或至少 3 项次要标准可诊断为重症肺炎。主要标准：（1）脓毒症休克经积极液体复苏后仍需血管活性药物治疗；（2）需行气管插管进行机械通气治疗。次要标准：（1）体温<36℃；（2）血小板计数<100×109/L；（3）白细胞计数<4×109/L；（3）氧合指数≤250 mm Hg；（3）呼吸频率≥30 次/min；（4）血尿素氮≥20 mg/dL；（5）意识障碍；（6）多肺叶受累；（7）低血压需液体复苏。
1.2.5 纳入及排除标准
纳入标准：（1）年龄≥ 18岁；（2）符合CAP/HAP/VAP诊断标准；（3）同时完善 BALF mNGS 及CMTs。排除标准：（1）对纤支镜检查存在相关禁忌者；（2）排除慢阻肺以外的慢性病，如心血管疾病、糖尿病、肺癌、免疫系统疾病等；（3）临床信息不全。需要强调的是，临床医生需要依据患者病情、临床表现、影像学检查、经验，甚至多学科会诊，全面分析 mNGS 结果，最终确定致病病原体。
1.3 mNGS检测
1.3.1 BALF标本处理和测序
BALF标本检测程序按照标准安全规程进行，将采集完的BALF标本送往杭州杰毅医学检验实验室有限公司。首先，利用生物样品均质仪对BALF样本中微生物的细胞壁进行破碎，以提高后续核酸提取的效率。从每个样本中取1.2 mL置于震荡管中进行均质处理。之后，采用核酸提取试剂盒（磁珠法）和全自动核酸提取仪，从样本中提取DNA和RNA。对于RNA样本，进行逆转录以生成cDNA。通过mNGS技术，无偏移地测序样本中的所有核酸，从而分析样本中存在的微生物组。为确保测序质量，每次测序都包括一个不含任何DNA或RNA的阴性对照和一个包含已知灭活微生物的阳性对照，以监控实验过程中的潜在污染和验证测序流程的准确性。
1.3.2 数据库的建立
在本研究中，我们采用标准的文库构建流程进行核酸的片段化、末端修复、A尾添加和接头（index）连接，以构建适用于Illumina Nextseq™高通量测序平台的文库。我们计划通过这一平台进行测序，以获得大量的序列数据，虽然预期每个文库能产生约2 000万条序列数据，实际数据量可能根据测序配置和需求有所不同。序列数据将经过生物信息学分析，包括去除人类基因组数据和与微生物参考数据库的比对。我们将使用专业的病原微生物基因数据分析软件处理这些数据，首先过滤掉匹配到人类参考基因组GRCh38.p13的序列，然后将剩余的序列与NCBI GenBank以及我们内部策划的微生物基因组数据库比对。这个数据库包含超过35 257种病原微生物的信息。
1.3.3 mNGS汇报规则
① 序列数据满足质控要求（文库浓度>50 pM，Q20>85%，Q30>80%）；② 阴性对照 （NC）在同一张芯片中未检测到该物种或RPM（样本）/ RPM （NC）≥5，这是根据以往的研究经验确定的，作为从背景污染中区分真阳性的阈值。
1.3.4 mNGS阳性结果的标准
① 临床常见机会致病微生物、临床非典型呼吸道机会致病菌、临床非典型呼吸道机会致病菌，该复合群或物种为属第一或与属第一RPM相差5倍以内，且序列数≥10；② 检出常见的呼吸道定植菌，若其所在属的相对丰度超过50%；③ 临床关注肺脓肿或明确厌氧菌感染的患者，定植菌中属排名前5位的定植菌相加属≥50%；④ 检出下列CAP和HAP常见的致病病原体，即使所在属的相对丰度在该文库中所有微生物属的排位中在10位之后，只要排除hopping和污染，均放入疑似列表；⑤ 真菌：念珠菌属所在属的序列数≥200；耶氏肺孢子菌序列数>50；呼吸道常见致病真菌++、或真菌，且序列数≥10；⑥ 病毒：检出疱疹病毒（除8型外）时，序列数≥200；⑦ 寄生虫：序列数≥50。
1.4 统计学方法
采用SPSS 26.0、 GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据处理及绘图。计数资料用例数和百分比表示，比较采用皮尔森χ2 检验（不超过 20% 的格子理论频数或期望频数 T<5）。对计量指标进行正态性检验及方差齐性检验，满足正态分布及方差齐性的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用独立样本 t 检验。Mann-Whitney U 检验用于比较两组间微生物菌群RPM值之间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
共纳入97例肺炎患者，单纯肺炎组52例，平均年龄53.60岁，其中男性31例。慢阻肺合并下呼吸道感染组45例，平均年龄65.73岁，其中男性26例。两组年龄和吸烟指数差异有统计学意义（P<0.05），在性别、mNGS阳性率、重症肺炎方面差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。
表表 1
患者的一般临床信息特征
2.2 微生物分析
2.2.1 微生物总体分布特征
在97例肺炎患者的测序结果中，mNGS微生物阳性患者有80例（81.82%），对两组检测到的所有微生物在属与种水平分布进行比较。属水平比较：单纯肺炎组在属水平检出19种微生物，细菌有8种（42.11%），检出频率最多的是不动杆菌属、棒状杆菌属；真菌2种（10.53%），分别是假丝酵母菌属、肺孢子菌属；病毒3种（15.79%），分别是单纯疱疹病毒属、巨细胞病毒属及淋巴隐病毒属；其他类型微生物6种（31.58%），检出频率最多的是分枝杆菌属和诺卡菌属。而慢阻肺合并下呼吸道感染组在属水平检出22种微生物，细菌有10种（47.62%），检出频率最多的假单胞菌属和链球菌属；真菌3种（14.29%），分别是假丝酵母菌属、肺孢子菌属和曲霉菌属；病毒4种（19.05%），分别是肠道病毒属、淋巴隐病毒属、β多瘤病毒属和单纯疱疹病毒属；其他类型微生物4种（19.05%），检出频率最多的是分枝杆菌和诺卡菌属。检出种类、数量及比例见图1a与图2。在种水平比较：单纯肺炎组在种水平检出23种微生物，细菌有9种（39.13%），检出频率最多的是鲍曼不动杆菌和纹带棒状杆菌；真菌2种（8.70%），分别是白色假丝酵母菌和耶氏肺孢子菌；病毒3种（13.04%），分别是人疱疹病毒1型、4型、5型；其他类型微生物9种（39.13%），检出频率最多的是结核分枝杆菌复合群和鹦鹉热衣原体。而慢阻肺合并下呼吸道感染组在种水平检出30种微生物，细菌有12种（38.71%），检出频率最多的是铜绿假单胞菌；真菌9种（29.03%），检出频率最多的是白色假丝酵母菌和烟曲霉；病毒5种（12.90%），检出频率最多的是人疱疹病毒4型；其他类型微生物6种（19.35%），检出频率最多的是结核分枝杆菌复合群。检出种类、数量及比例见图1b与图3。
2.2.2 不同感染类型微生物RPM值比较
不同程度肺炎的微生物在属和种水平存在一定的差异。在属水平的比较结果发现，在非重症肺炎中，慢阻肺合并下呼吸道感染组细菌RPM值显著高于单纯肺炎组（Z=–2.706，P=0.007）；对于真菌、病毒，慢阻肺合并下呼吸道感染组RPM值高于单纯肺炎组；对于其他微生物，单纯肺炎组RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染组，但差异均无统计学意义。在种水平非重症肺炎，对于真菌、病毒，慢阻肺合并下呼吸道感染组RPM值高于单纯肺炎组，对于细菌、其他微生物，单纯肺炎组RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染组，但差异均无统计学意义。结果见表2。在重症肺炎中，在属和种水平，对于细菌、其他微生物，慢阻肺合并下呼吸道感染组RPM值高于单纯肺炎组；对于真菌、病毒，单纯肺炎组RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染组，但差异均无统计学意义。结果见表3。
表表 2
两组非重症肺炎微生物RPM值比较
表表 3
两组重症肺炎微生物RPM值比较
2.2.3 不同亚组微生物RPM值比较
不论在属水平还是在种水平，单纯肺炎组的重症肺炎细菌RPM值显著高于非重症肺炎组（Z=−2.202，P=0.028；Z=−2.141，P=0.032）。结果见表4。慢阻肺合并重症肺炎时细菌RPM值只有在种水平显著高于非重症肺炎（Z=−2.367，P=0.017）。结果见表5。不论在单纯肺炎组还是在慢阻肺合并下呼吸道感染组，真菌、病毒RPM值在属和种水平重症肺炎高于非重症肺炎；其他微生物RPM值在属和种水平非重症肺炎高于重症肺炎，但差异均无统计意义。
表表 4
单纯肺炎组微生物RPM值比较
表表 5
慢阻肺合并下呼吸道感染组微生物RPM比较
3 讨论
肺炎是临床上最常见的感染性疾病之一， 由肺炎引起的急性缺氧性呼吸衰竭是患者收治重症监护室的主要原因 。如何早期、快速诊断病原体，从而精准用药，缩短住院时间，减少并发症及降低病死率至关重要。BALF相比其他类型标本，能更好地反映下呼吸道菌群分布，结合mNGS的高灵敏度、无偏移检测及病原体覆盖度广等优势[11]，BALF的mNGS检测技术在肺炎微生物检测方面表现出较好的临床诊断效能[12]。
本研究以BALF的mNGS为基础，比较单纯肺炎组与慢阻肺合并下呼吸道感染组下呼吸道微生物分布特征，结果发现在97例肺炎患者的测序结果中，微生物阳性患者有80例（81.82%）。本研究发现，慢阻肺合并下呼吸道感染组吸烟指数显著高于单纯肺炎组（t=−3.62，P=0.001），有研究发现吸烟和气流受限会增加假单胞菌属和链球菌属感染风险[13-15]。在本研究中，慢阻肺合并下呼吸道感染组中有59.46%的吸烟患者，而且75.68%患者明确存在气流受限，本研究在属水平优势细菌为假单胞菌属、链球菌属，与上述研究结果一致。
不论在单纯肺炎组还是在慢阻肺合并下呼吸道感染组，在属水平和种水平检出频率最多的是细菌，但细菌属种类并不相同，在单纯肺炎患者最常见的菌属不动杆菌属，与Huang等[16]的研究结果不同，可能由于本研究单纯肺炎组纳入的患者因车祸、骨折等因素收住重症监护室或者在外院经验性抗生素抗感染治疗欠佳后转入我院。还发现不同微生物在种分布上存在差异，在种水平单纯肺炎组最常见的是结核分枝杆菌，可能是因为我国仍属于发展中国家，而且新疆地区本来就是肺结核高发地区，这与其他研究结果相似[15，17-18]。慢阻肺合并下呼吸道感染组检出频率最高的是铜绿假单胞菌，反复肺炎、长期住院史以及接受有创呼吸机辅助呼吸等均是铜绿假单胞菌感染的危险因素，尤其是耐药菌的感染[19-20]。
曲霉、假丝酵母菌、耶氏肺孢子菌在慢阻肺合并下呼吸道感染组中的检出率较高，在种类和数量上远超过单纯肺炎组，这也进一步证实了慢阻肺等慢性气道疾病会增加真菌感染的风险，与Chen等[3]对220例疑似肺炎患者的研究结果一致。单纯疱疹病毒1型和5型在单纯肺炎组中检出率较高，病毒在多数情况下（83.33%）是与其他微生物混合感染，而混合感染会明显增加疾病的严重程度，这也提示我们在临床工作应认识到多种微生物感染的重要性。本研究中，3例重症感染患者鉴定为鹦鹉热衣原体感染，鹦鹉热衣原体肺炎是一种动物源性感染性疾病，感染后部分患者不典型起病，尤其在老年患者中，上呼吸道感染症状不明显，发热不典型，较易误诊，很容易发展成重症肺炎危及生命[21]。近年来，越来越多的研究证实肺诺卡菌病会发生在患有肺部基础疾病患者中[22]，在我们的研究中检出7例诺卡菌患者中有5例既往或者入院后诊断患有慢阻肺等肺基础疾病。提示临床医生在遇到不明原因的肺炎患者时，不能排除这些少见的致病病原体。
在本研究中，我们使用RPM值代表微生物检出载量，为进一步探索微生物载量与慢阻肺和感染程度之间的关系，我们将两组根据感染程度再分亚组，即重症肺炎和非重症肺炎，结果发现在非重症肺炎组中，慢阻肺合并下呼吸道感染组细菌RPM值在属水平显著高于单纯肺炎组，差异有统计学意义，这说明，慢阻肺等慢性气道疾病可能会增加微生物RPM值。单纯肺炎组重症肺炎细菌RPM值在属和种水显著高于非重症感染组；而慢阻肺合并重症肺炎时细菌RPM值在属和种水平也高于非重症肺炎，但属水平差异无统计学意义，本研究中的差异不显著可能与样本量较少有关，但也可以说明微生物RPM值可能与感染严重程度有关系，即载量越高，感染越重。对于真菌，不论在慢阻肺合并下呼吸道感染组还是在单纯肺炎组，RPM值均较小，各亚组间的差异也没有统计学意义，考虑与真菌在mNGS测序过程中需要破壁导致其载量减低相关[20，23]，因此在临床中不能忽视对低载量真菌感染的诊断。
研究表明一种微生物的存在可能会促进或抑制其他微生物的定植[24-25]。在我们研究中，从整体水平来说，病毒RPM值与其他微生物RPM值在各亚组中的大小恰恰相反。对于病毒，重症感染RPM值高于非重症感染，慢阻肺合并下呼吸道感染组RPM值高于单纯肺炎组；而其他类型微生物，如分枝杆菌和诺卡菌属等，非重症感染RPM值高于重症感染，单纯肺炎组高于慢阻肺合并下呼吸道感染组，这可能与重症感染及多种微生物混合感染会影响不同微生物载量有关。因此需要更多临床研究证明，肺炎时病毒载量的增加或不典型微生物载量的减少是否能提示判断感染程度加重。这是第一份使用RPM值载量探索RPM值与慢阻肺和感染程度的研究，RPM值可在mNGS报告中得到，同时对于本研究结果需要更多研究证实其RPM值对疾病炎症程度的效能。
本研究还存在以下不足：（1）本研究为回顾性，可能存在信息偏移；（2）样本量相对较少；（3）微生物研究个体差异较大，容易受到气候、环境及地区因素干扰；（4）在慢阻肺组中部分患者同时患有支气管扩张症及支气管哮喘等其他肺部疾病，这可能会影响其结果的可靠性与准确性，未来需要更大规模的研究结合临床感染指标进一步分析RPM值与慢阻肺和肺炎严重程度的关系，从而指导临床治疗。
综上所述，本研究通过BALF的mNGS检测技术，对单纯肺炎及慢阻肺合并下呼吸道感染患者的BALF菌群分布特征分析，发现细菌为最主要的微生物，但两组优势细菌类型并不相同，单纯肺炎组与慢阻肺合并下呼吸道感染组的优势细菌分别为不动杆菌属和假单胞菌属。非典型微生物在单纯肺炎组占比较高，而真菌更多见于慢阻肺合并下呼吸道感染组，这种菌群分布上的差异提示，在临床工作中，对于单纯肺炎患者除了经验性覆盖治疗以外，不能忽视非典型微生物的感染，而mNGS对于非典型病原体诊断拥有独特优势；而对于慢阻肺合并下呼吸道感染患者应尽可能同步完善真菌相关检查。此外，慢阻肺合并下呼吸道感染组的细菌RPM值显著高于单纯肺炎组，重症肺炎细菌RPM值显著高于非重症肺炎，这种差异是否提示RPM值成为提示肺炎严重程度的预测指标，以及对于真菌和某些胞内细菌及病毒这些被认为是低载量微生物，是否有其他更好的mNGS指标提示肺炎严重程度，仍需进一步研究。
利益冲突：本文不涉及任何利益冲突
