引用本文： 朱鹏飞, 赖晓蓉, 熊沿, 肖祝. 蟛蜞菊内酯通过抑制AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路减轻脂多糖诱导的肺泡上皮细胞焦亡. 中国呼吸与危重监护杂志, 2024, 23(7): 488-494. doi: 10.7507/1671-6205.202402029 复制
急性肺损伤是由多种致病因素导致的炎症综合征，主要表现为肺上皮细胞损伤，严重时可以引起细胞焦亡[1]。脂多糖（lipolyaccharide，LPS）作为革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，可以引起急性肺损伤，常被用于构建肺损伤模型[2]。蟛蜞菊内酯（wedelactone，WEL）是菊科植物墨旱莲的主要成分之一，具有抗炎、抗氧化等作用。研究显示，WEL可以通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate activates protein kinase，AMPK）增加AMPK磷酸化水平，减少肺部炎症细胞浸润，减轻肺纤维化[3]。AMPK/核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor 3，NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）信号通路是细胞焦亡经典通路。研究显示达格列净可激活AMPK，抑制NLRP3、Caspase-1活化，发挥抗炎、抗氧化、抗焦亡作用，改善急性肺损伤[4]。但是WEL是否可以通过AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路，减轻LPS诱导的肺泡上皮细胞焦亡还有待进一步研究。本研究探索WEL对LPS诱导的肺泡上皮细胞焦亡及AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路的影响，为肺损伤的治疗提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要材料
BEAS-2B细胞（Y-00805）购于上海酶研生物科技有限公司。LPS（L8880）购于上海恒斐生物科技有限公司。WEL（HPLC≥98%）购于上海吉至生化科技有限公司。AMPK抑制剂Compound C（HY-13418A）购于MCE公司。Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK（HY-P1009）购于美国MedChemExpress公司。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）（PT518）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）（PI640）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；荧光标记的山羊抗兔lgG（ab150077）购于上海abcam公司；Gasdermin家族蛋白（gasdermin family proteins，DGSDMD）（sc-393581）购于Santa Cruz Biotechnology公司；AMPK（ab32047）、NLRP3（ab263899）、Caspase-1（ab62698）单抗购于上海Abcam公司；GAPDH单抗（5174）购于美国Cell Signaling Technology公司。
1.2 方法
1.2.1 MTT法检测细胞活性
在37℃、5% CO2培养箱中用含10%磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）的DMEM培养基培养BEAS-2B细胞，至细胞生长到对数期，用不同浓度的WEL处理BEAS-2B细胞，并将细胞置于37℃ 5% CO2培养箱培养2天，离心去上清，加入20 μL 5 g/L MTT溶液，37℃恒温培养箱培养4 h，离心去上清，加入100 μL DMSO，涡旋振荡，酶标仪测OD值。
1.2.2 细胞分组及处理
将肺泡上皮细胞BEAS-2B分为对照组、脂多糖组（LPS组）、10 μmol/L蟛蜞菊内酯组（WEL-L组）、20 μmol/L蟛蜞菊内酯组（WEL-M组）、40 μmol/L蟛蜞菊内酯组（WEL-H组）、40 μmol/L蟛蜞菊内酯+10 μmol/L AMPK抑制剂Compound C组（WEL-H+Compound C组）、20 μmol/L Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK组（Z-YVAD-FMK组）。对照组细胞不做任何处理；LPS组细胞用浓度为10 μg/mL LPS处理24 h[5]；WEL-L组、WEL-M组和WEL-H组细胞用浓度为10 μg/mL LPS及分别用10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的WEL共培养处理24 h；WEL-H+Compound C组细胞用10 μg/mL LPS、40 μmol/L的WEL、10 μmol/L AMPK抑制剂Compound C[6]共培养处理24 h；Z-YVAD-FMK组细胞用10 μg/mL LPS、20 μmol/L Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK[7]共培养处理24 h。
1.2.3 ELISA检测炎症因子
收集1.2.2制备的各组细胞培养基上清液，ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IL-8水平。
1.2.4 细胞显微结构观察细胞超微结构
取1.2.2制备的各组细胞用胰酶消化后将细胞悬液移入离心管，离心弃上清，加入1 mL 2.5%戊二醛溶液固定细胞，制作电镜切片，用透射电镜观察各组细胞超微结构。
1.2.5 免疫荧光检测Caspase-1、DGSDMD蛋白表达
取含1.2.2各组细胞玻片放置在24孔板，每孔2×105个细胞，4%多聚甲醛室温固定20 min，0.5% Triton X-100 4℃透膜5 min，含5% BSA的PBS室温封闭1 h，分别加入一抗Caspase-1、GSDMD 4℃孵育过夜，再加入二抗山羊抗兔lgG（H+L）37℃孵育1 h。PI染核5 min，封片，荧光显微镜下观察并拍照，Image J软件分析蛋白荧光强度。
1.2.6 Western blot法检测AMPK、NLRP3、Caspase-1表达
取1.2.2制备的各组细胞加入RIPA细胞裂解液裂解蛋白，电泳分离，转膜封闭。随后加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育，ECL曝光，Image J软件分析条带灰度值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0进行统计分析，呈正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 WEL对BEAS-2B细胞活性的影响
与对照组相比，100 μmol/L及200 μmol/L的WEL处理后细胞活性显著下降（P<0.05），而40 μmol/L及以下浓度的WEL对细胞活性无明显影响（P>0.05），结果见表1。因此，选择10、20、40 μmol/L的WEL不影响细胞活性的浓度进行后续实验。
表1
WEL对BEAS-2B细胞活性的影响（n=6，x±s）
2.2 WEL对LPS诱导的BEAS-2B细胞活性的影响
随着时间推移，除对照组，其余各组细胞存活率逐渐降低；与对照组相比，LPS组BEAS-2B细胞存活率显著降低（P<0.05）；与LPS组相比，WEL-L组、WEL-M组、WEL-H组BEAS-2B细胞存活率依次显著升高，Z-YVAD-FMK组细胞存活率显著升高（P<0.05）；与WEL-H组相比，WEL-H+Compound C组细胞存活率显著降低（P<0.05）。结果见图1、表2。
图1
各组细胞存活率比较
表2
WEL对LPS诱导的BEAS-2B细胞活性的影响（n=6，x±s）
2.3 WEL对LPS诱导的BEAS-2B细胞显微结构的影响
对照组细胞内质网和线粒体形态饱满；与对照组相比，LPS组细胞损伤严重，线粒体嵴断裂且数量减少；与LPS组相比，WEL-L组、WEL-M组、WEL-H组细胞损伤依次减轻，内质网和线粒体嵴逐渐正常完整，Z-YVAD-FMK组细胞损伤不明显，内质网与线粒体完整正常；与WEL-H组相比，WEL-H+Compound C组细胞损伤严重，线粒体嵴断裂且数量减少。结果见图2。
图2
各组细胞透射电镜像（×50 000）
a. 对照组；b. LPS组；c. WEL-L组；d. WEL-M组；e. WEL-H组；f. WEL-H+Compound C组；g. Z-YVAD-FMK组。
2.4 WEL对LPS诱导的BEAS-2B细胞TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影响
与对照组相比，LPS组TNF-α、IL-1β、IL-8水平显著上升（P<0.05）；与LPS组相比，WEL-L组、WEL-M组、WEL-H组TNF-α、IL-1β、IL-8水平依次显著下降，Z-YVAD-FMK组TNF-α、IL-1β、IL-8水平显著下降（P<0.05）；与WEL-H组相比，WEL-H+Compound C组TNF-α、IL-1β、IL-8水平显著上升（P<0.05）。结果见表3。
表3
WEL对BEAS-2B细胞TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影响（n=6，x±s）
2.5 WEL对LPS诱导的BEAS-2B细胞焦亡相关基因Caspase-1、GSDMD的影响
如图3所示，Caspase-1、GSDMD染色呈红色，DAPI染色呈蓝色。与对照组相比，LPS组Caspase-1、GSDMD水平上升（P<0.05）；与LPS组相比，WEL-L组、WEL-M组、WEL-H组Caspase-1、GSDMD水平依次显著下降，Z-YVAD-FMK组Caspase-1、GSDMD水平显著下降（P<0.05）；与WEL-H组相比，WEL-H+Compound C组Caspase-1、GSDMD水平显著上升（P<0.05）。结果见表4。
图3
免疫荧光观察各组细胞Caspase-1、GSDMD蛋白表达（×1 000）
表4
WEL对BEAS-2B细胞Caspase-1、GSDMD水平的影响（n=6，x±s）
2.6 WEL对AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路的影响
与对照组相比，LPS组p-AMPK/AMPK下降，NLRP3、Caspase-1蛋白表达上升（P<0.05）；与LPS组相比，WEL-L组、WEL-M组、WEL-H组p-AMPK/AMPK上升，NLRP3、Caspase-1蛋白表达依次下降，Z-YVAD-FMK组p-AMPK/AMPK表达上升，NLRP3、Caspase-1蛋白表达下降（P<0.05）；与WEL-H组相比，WEL-H+Compound C组p-AMPK/AMPK下降，NLRP3、Caspase-1蛋白表达上升（P<0.05）。结果见图4和表5。
图4
Western blot检测AMPK/NLRP3/Caspase-1通路相关蛋白表达
a. 对照组；b. LPS组；c. WEL-L组；d. WEL-M组；e. WEL-H组；f. WEL-H+Compound C组；g. Z-YVAD-FMK组。
表5
WEL对BEAS-2B细胞AMPK/NLRP3/Caspase-1通路相关蛋白表达的影响（n=6，x±s）
3 讨论
炎症反应是肺损伤的主要标志，而TNF-α、IL-1β、IL-8等炎症因子在细胞的炎症反应中发挥重要作用。LPS作为感染疾病中的主要促炎因子之一，过量时会促进TNF-α、IL-1β、IL-8等相关炎症细胞因子大量分泌和释放，导致肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞过度炎症损伤，甚至细胞焦亡，从而造成肺功能损伤[8]。WEL具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，在肺损伤的治疗中发挥重要作用[9]。研究发现WEL可通过调控铁死亡抑制TNF-α、IL-1β水平，从而减轻高氧性急性肺损伤[10]。WEL可以抑制炎症小体活化，减轻急性胰腺炎和相关肺损伤[11]。本研究显示WEL可以减轻LPS诱导的肺泡上皮细胞炎症，降低TNF-α、IL-1β、IL-8水平，抑制细胞死亡。
细胞焦亡是细胞死亡的一种，适当的焦亡可以使宿主对感染病起到防御作用，过度焦亡可以危害宿主。细胞焦亡是一种炎性半胱氨酸蛋白酶依赖性的细胞程序性死亡，与多种炎症性疾病相关。当细胞受到伤害刺激，形成含NLR的炎症小体，其中NLRP3最具有代表性，然后与凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）结合，形成炎症小体复合物，激活多种Caspase如Caspase-1，从而造成多种GSDMD蛋白家族成员发生剪切和多聚化，释放大量促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-8等，造成细胞穿孔死亡，最终焦亡[12-13]。研究显示Caspase-1、NLRP3、GSDMD焦亡相关因子的缺失可以减轻炎症反应，降低胰腺炎引起的焦亡[14]。电针可抑制NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、GSDMD-N蛋白表达及IL-1β、IL-8水平，减轻大鼠脓毒症急性肺损伤[15]。本研究显示WEL可以抑制Caspase-1、GSDMD水平，从而减轻细胞焦亡。
AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路作为经典细胞焦亡通路，在细胞炎症反应及焦亡过程中发挥重要作用。当机体遭到损伤时，可激活NLRs和Caspase-1，促进下游相关因子的表达，进而增加炎症因子的释放，加剧炎症反应，促进细胞的焦亡。而降低NLRP3、Caspase-1水平和炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8释放，可以抑制细胞焦亡，减轻炎症，从而起到保护作用[16]。AMPK作为真核细胞的能量感受器，能够协调包括自噬、凋亡、细胞周期和蛋白质合成在内的一系列细胞过程，与人类疾病的发生发展密切相关，其可以抑制NLRP3介导的细胞焦亡，从而保护肺损伤[17]。本研究显示WEL可以上调AMPK，下调NLRP3、Caspase-1表达，AMPK抑制剂可以逆转AMPK对LPS诱导的肺上皮细胞焦亡的抑制作用，WEL与Caspase-1抑制剂均可以降低细胞的炎症水平，抑制细胞焦亡。说明WEL通过增加AMPK磷酸化，可抑制NLRP3，可抑制Caspase-1表达，从而抑制细胞焦亡。
综上所述，WEL可以通过抑制AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路，从而抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞焦亡。但是WEL调控AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路的作用机制仍需结合动物模型进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
急性肺损伤是由多种致病因素导致的炎症综合征，主要表现为肺上皮细胞损伤，严重时可以引起细胞焦亡[1]。脂多糖（lipolyaccharide，LPS）作为革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，可以引起急性肺损伤，常被用于构建肺损伤模型[2]。蟛蜞菊内酯（wedelactone，WEL）是菊科植物墨旱莲的主要成分之一，具有抗炎、抗氧化等作用。研究显示，WEL可以通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate activates protein kinase，AMPK）增加AMPK磷酸化水平，减少肺部炎症细胞浸润，减轻肺纤维化[3]。AMPK/核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor 3，NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）信号通路是细胞焦亡经典通路。研究显示达格列净可激活AMPK，抑制NLRP3、Caspase-1活化，发挥抗炎、抗氧化、抗焦亡作用，改善急性肺损伤[4]。但是WEL是否可以通过AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路，减轻LPS诱导的肺泡上皮细胞焦亡还有待进一步研究。本研究探索WEL对LPS诱导的肺泡上皮细胞焦亡及AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路的影响，为肺损伤的治疗提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要材料
BEAS-2B细胞（Y-00805）购于上海酶研生物科技有限公司。LPS（L8880）购于上海恒斐生物科技有限公司。WEL（HPLC≥98%）购于上海吉至生化科技有限公司。AMPK抑制剂Compound C（HY-13418A）购于MCE公司。Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK（HY-P1009）购于美国MedChemExpress公司。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）（PT518）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）（PI640）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；荧光标记的山羊抗兔lgG（ab150077）购于上海abcam公司；Gasdermin家族蛋白（gasdermin family proteins，DGSDMD）（sc-393581）购于Santa Cruz Biotechnology公司；AMPK（ab32047）、NLRP3（ab263899）、Caspase-1（ab62698）单抗购于上海Abcam公司；GAPDH单抗（5174）购于美国Cell Signaling Technology公司。
1.2 方法
1.2.1 MTT法检测细胞活性
在37℃、5% CO2培养箱中用含10%磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）的DMEM培养基培养BEAS-2B细胞，至细胞生长到对数期，用不同浓度的WEL处理BEAS-2B细胞，并将细胞置于37℃ 5% CO2培养箱培养2天，离心去上清，加入20 μL 5 g/L MTT溶液，37℃恒温培养箱培养4 h，离心去上清，加入100 μL DMSO，涡旋振荡，酶标仪测OD值。
1.2.2 细胞分组及处理
将肺泡上皮细胞BEAS-2B分为对照组、脂多糖组（LPS组）、10 μmol/L蟛蜞菊内酯组（WEL-L组）、20 μmol/L蟛蜞菊内酯组（WEL-M组）、40 μmol/L蟛蜞菊内酯组（WEL-H组）、40 μmol/L蟛蜞菊内酯+10 μmol/L AMPK抑制剂Compound C组（WEL-H+Compound C组）、20 μmol/L Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK组（Z-YVAD-FMK组）。对照组细胞不做任何处理；LPS组细胞用浓度为10 μg/mL LPS处理24 h[5]；WEL-L组、WEL-M组和WEL-H组细胞用浓度为10 μg/mL LPS及分别用10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的WEL共培养处理24 h；WEL-H+Compound C组细胞用10 μg/mL LPS、40 μmol/L的WEL、10 μmol/L AMPK抑制剂Compound C[6]共培养处理24 h；Z-YVAD-FMK组细胞用10 μg/mL LPS、20 μmol/L Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK[7]共培养处理24 h。
1.2.3 ELISA检测炎症因子
收集1.2.2制备的各组细胞培养基上清液，ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IL-8水平。
1.2.4 细胞显微结构观察细胞超微结构
取1.2.2制备的各组细胞用胰酶消化后将细胞悬液移入离心管，离心弃上清，加入1 mL 2.5%戊二醛溶液固定细胞，制作电镜切片，用透射电镜观察各组细胞超微结构。
1.2.5 免疫荧光检测Caspase-1、DGSDMD蛋白表达
取含1.2.2各组细胞玻片放置在24孔板，每孔2×105个细胞，4%多聚甲醛室温固定20 min，0.5% Triton X-100 4℃透膜5 min，含5% BSA的PBS室温封闭1 h，分别加入一抗Caspase-1、GSDMD 4℃孵育过夜，再加入二抗山羊抗兔lgG（H+L）37℃孵育1 h。PI染核5 min，封片，荧光显微镜下观察并拍照，Image J软件分析蛋白荧光强度。
1.2.6 Western blot法检测AMPK、NLRP3、Caspase-1表达
取1.2.2制备的各组细胞加入RIPA细胞裂解液裂解蛋白，电泳分离，转膜封闭。随后加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育，ECL曝光，Image J软件分析条带灰度值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0进行统计分析，呈正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 WEL对BEAS-2B细胞活性的影响
与对照组相比，100 μmol/L及200 μmol/L的WEL处理后细胞活性显著下降（P<0.05），而40 μmol/L及以下浓度的WEL对细胞活性无明显影响（P>0.05），结果见表1。因此，选择10、20、40 μmol/L的WEL不影响细胞活性的浓度进行后续实验。
表1
WEL对BEAS-2B细胞活性的影响（n=6，x±s）
2.2 WEL对LPS诱导的BEAS-2B细胞活性的影响
随着时间推移，除对照组，其余各组细胞存活率逐渐降低；与对照组相比，LPS组BEAS-2B细胞存活率显著降低（P<0.05）；与LPS组相比，WEL-L组、WEL-M组、WEL-H组BEAS-2B细胞存活率依次显著升高，Z-YVAD-FMK组细胞存活率显著升高（P<0.05）；与WEL-H组相比，WEL-H+Compound C组细胞存活率显著降低（P<0.05）。结果见图1、表2。
图1
各组细胞存活率比较
表2
WEL对LPS诱导的BEAS-2B细胞活性的影响（n=6，x±s）
2.3 WEL对LPS诱导的BEAS-2B细胞显微结构的影响
对照组细胞内质网和线粒体形态饱满；与对照组相比，LPS组细胞损伤严重，线粒体嵴断裂且数量减少；与LPS组相比，WEL-L组、WEL-M组、WEL-H组细胞损伤依次减轻，内质网和线粒体嵴逐渐正常完整，Z-YVAD-FMK组细胞损伤不明显，内质网与线粒体完整正常；与WEL-H组相比，WEL-H+Compound C组细胞损伤严重，线粒体嵴断裂且数量减少。结果见图2。
图2
各组细胞透射电镜像（×50 000）
a. 对照组；b. LPS组；c. WEL-L组；d. WEL-M组；e. WEL-H组；f. WEL-H+Compound C组；g. Z-YVAD-FMK组。
2.4 WEL对LPS诱导的BEAS-2B细胞TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影响
与对照组相比，LPS组TNF-α、IL-1β、IL-8水平显著上升（P<0.05）；与LPS组相比，WEL-L组、WEL-M组、WEL-H组TNF-α、IL-1β、IL-8水平依次显著下降，Z-YVAD-FMK组TNF-α、IL-1β、IL-8水平显著下降（P<0.05）；与WEL-H组相比，WEL-H+Compound C组TNF-α、IL-1β、IL-8水平显著上升（P<0.05）。结果见表3。
表3
WEL对BEAS-2B细胞TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影响（n=6，x±s）
2.5 WEL对LPS诱导的BEAS-2B细胞焦亡相关基因Caspase-1、GSDMD的影响
如图3所示，Caspase-1、GSDMD染色呈红色，DAPI染色呈蓝色。与对照组相比，LPS组Caspase-1、GSDMD水平上升（P<0.05）；与LPS组相比，WEL-L组、WEL-M组、WEL-H组Caspase-1、GSDMD水平依次显著下降，Z-YVAD-FMK组Caspase-1、GSDMD水平显著下降（P<0.05）；与WEL-H组相比，WEL-H+Compound C组Caspase-1、GSDMD水平显著上升（P<0.05）。结果见表4。
图3
免疫荧光观察各组细胞Caspase-1、GSDMD蛋白表达（×1 000）
表4
WEL对BEAS-2B细胞Caspase-1、GSDMD水平的影响（n=6，x±s）
2.6 WEL对AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路的影响
与对照组相比，LPS组p-AMPK/AMPK下降，NLRP3、Caspase-1蛋白表达上升（P<0.05）；与LPS组相比，WEL-L组、WEL-M组、WEL-H组p-AMPK/AMPK上升，NLRP3、Caspase-1蛋白表达依次下降，Z-YVAD-FMK组p-AMPK/AMPK表达上升，NLRP3、Caspase-1蛋白表达下降（P<0.05）；与WEL-H组相比，WEL-H+Compound C组p-AMPK/AMPK下降，NLRP3、Caspase-1蛋白表达上升（P<0.05）。结果见图4和表5。
图4
Western blot检测AMPK/NLRP3/Caspase-1通路相关蛋白表达
a. 对照组；b. LPS组；c. WEL-L组；d. WEL-M组；e. WEL-H组；f. WEL-H+Compound C组；g. Z-YVAD-FMK组。
表5
WEL对BEAS-2B细胞AMPK/NLRP3/Caspase-1通路相关蛋白表达的影响（n=6，x±s）
3 讨论
炎症反应是肺损伤的主要标志，而TNF-α、IL-1β、IL-8等炎症因子在细胞的炎症反应中发挥重要作用。LPS作为感染疾病中的主要促炎因子之一，过量时会促进TNF-α、IL-1β、IL-8等相关炎症细胞因子大量分泌和释放，导致肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞过度炎症损伤，甚至细胞焦亡，从而造成肺功能损伤[8]。WEL具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，在肺损伤的治疗中发挥重要作用[9]。研究发现WEL可通过调控铁死亡抑制TNF-α、IL-1β水平，从而减轻高氧性急性肺损伤[10]。WEL可以抑制炎症小体活化，减轻急性胰腺炎和相关肺损伤[11]。本研究显示WEL可以减轻LPS诱导的肺泡上皮细胞炎症，降低TNF-α、IL-1β、IL-8水平，抑制细胞死亡。
细胞焦亡是细胞死亡的一种，适当的焦亡可以使宿主对感染病起到防御作用，过度焦亡可以危害宿主。细胞焦亡是一种炎性半胱氨酸蛋白酶依赖性的细胞程序性死亡，与多种炎症性疾病相关。当细胞受到伤害刺激，形成含NLR的炎症小体，其中NLRP3最具有代表性，然后与凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）结合，形成炎症小体复合物，激活多种Caspase如Caspase-1，从而造成多种GSDMD蛋白家族成员发生剪切和多聚化，释放大量促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-8等，造成细胞穿孔死亡，最终焦亡[12-13]。研究显示Caspase-1、NLRP3、GSDMD焦亡相关因子的缺失可以减轻炎症反应，降低胰腺炎引起的焦亡[14]。电针可抑制NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、GSDMD-N蛋白表达及IL-1β、IL-8水平，减轻大鼠脓毒症急性肺损伤[15]。本研究显示WEL可以抑制Caspase-1、GSDMD水平，从而减轻细胞焦亡。
AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路作为经典细胞焦亡通路，在细胞炎症反应及焦亡过程中发挥重要作用。当机体遭到损伤时，可激活NLRs和Caspase-1，促进下游相关因子的表达，进而增加炎症因子的释放，加剧炎症反应，促进细胞的焦亡。而降低NLRP3、Caspase-1水平和炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8释放，可以抑制细胞焦亡，减轻炎症，从而起到保护作用[16]。AMPK作为真核细胞的能量感受器，能够协调包括自噬、凋亡、细胞周期和蛋白质合成在内的一系列细胞过程，与人类疾病的发生发展密切相关，其可以抑制NLRP3介导的细胞焦亡，从而保护肺损伤[17]。本研究显示WEL可以上调AMPK，下调NLRP3、Caspase-1表达，AMPK抑制剂可以逆转AMPK对LPS诱导的肺上皮细胞焦亡的抑制作用，WEL与Caspase-1抑制剂均可以降低细胞的炎症水平，抑制细胞焦亡。说明WEL通过增加AMPK磷酸化，可抑制NLRP3，可抑制Caspase-1表达，从而抑制细胞焦亡。
综上所述，WEL可以通过抑制AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路，从而抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞焦亡。但是WEL调控AMPK/NLRP3/Caspase-1信号通路的作用机制仍需结合动物模型进一步研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
