引用本文： 潘天宇, 邓圣洁, 林婷婷, 万慧敏, 单梦田, 陆晶晶. 骨髓间充质干细胞通过前列腺素E2调控NLRP3抑制肺泡巨噬细胞相关炎症反应. 中国呼吸与危重监护杂志, 2024, 23(7): 495-503. doi: 10.7507/1671-6205.202403037 复制
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）发病机制复杂，病死率和致残率高，其主要的机制是病原体刺激中性粒细胞或者巨噬细胞引起“炎症因子风暴”，使肺泡-毛细血管屏障的破坏、肺水肿而导致的气体交换障碍等[1]。大量研究表明肺部炎症反应的失平衡是ALI/ARDS发病的关键环节，因此抑制和减轻肺部炎症反应是目前ALI/ARDS治疗的研究热点。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor 3，NLRP3）炎症小体是新的模式识别受体，其活化既可促进多种促炎症细胞因子的成熟和分泌，还可以调节细胞焦亡，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的ALI/ARDS发生发展中起着重要作用。近年来，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）在抗炎症、免疫调节及促进血管新生等方面均展现出良好的临床应用前景，研究表明BMSC在炎症刺激下可以大量合成并释放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）减轻炎症反应[2-4]。本研究旨在探究BMSC对ALI中巨噬细胞的作用，机制是否与调控PGE2与NLRP3炎症小体的活化有关等，以期为开发新的ALI治疗策略提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物：选择10只SPF级（6周龄，18～22 g）健康成年雄性BALB/c小鼠。购自常州卡文斯，饲养在同济大学附属东方医院动物房内，环境温度24～26℃，环境湿度55%～60%，光/暗周期为12 h/12 h，小鼠自由饮水和进食。
实验材料：LPS（Sigma），10%水合氯醛（上海生工），DMEM高糖/低糖培养基（Hyclone），FBS（Hyclone），DIL-ac-LDL（上海生工），Trizol（Invitrogen），DEPC处理水（CTCC），氯仿/异丙醇/无水乙醇（上海国药），SYBRGreen PCR试剂盒（Thermo F-415XL），逆转录试剂盒（Thermo K1622），CD90抗体（Invitrogen 61-0902-80），CD29抗体 （Invitrogen 12-0291-81），CD45抗体（Invitrogen 67-0451-82），CD34抗体（Invitrogen 11-0341-81），BCA蛋白定量试剂盒（凯基KGPBCA），RIPA强效裂解液（碧云天P0013B），丙烯酰胺/电泳缓冲液/过硫酸铵（上海国药），蛋白预染Marker（Thermo 26616），NLRP3（ABclonal A5652），pro-Caspase-1（ABclonal A0964），Caspase-1（ABclonal A0964），pro-IL-1β（CST 12242S），GAPDH（proteintech 60004-1-Ig），辣根酶标记山羊抗兔IgG（中杉金桥 ZB2301），辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（中杉金桥 ZB2305），肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（Elabscience E-EL-M0049c），白细胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）（Elabscience E-EL-M0037c），IL-10（Elabscience E-EL-M0046c），IL-18（Elabscience E-EL-M0730c），PGE2（酶联生物）。
实验仪器：细胞培养箱（Thermo Scientific 8000），荧光倒置显微镜（OLYMPUS，IX71），光学显微镜（XDS-1A），离心机（Eppendorf），流式细胞仪（BD-FACSVerse），低温冷冻离心机 （Sigma 3K15）， Real-time检测仪（ABI-7500），电泳仪（BIORAD），酶标仪（ThermoMK3）等。
1.2 方法
1.2.1 支气管肺泡灌洗获取巨噬细胞并检测纯度
取健康SPF级成年雄性BALB/c小鼠，麻醉后暴露气管并气管插管，用预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）进行双肺灌洗，回收获得支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。BALF离心重悬后获得肺泡巨噬细胞，在巨噬细胞培养液中加入DIL-ac-LDL，避光孵育并拍照。
1.2.2 分离及流式细胞术鉴定BMSC
用颈椎脱位法处死小鼠后，用手术剪打开骨髓腔，冲洗、离心、重悬并培养出BMSC。将分离的BMSC收集培养，每孔分别加入200 μL的染色缓冲液，以及CD90、CD29、CD45和CD34抗体。避光孵育30 min后洗涤重悬。流式细胞术定量检测并分析。
1.2.3 建立稳定的慢病毒转染BMSC细胞株
（1）观察慢病毒MOI：商业合成ptges（Gene ID：64292）合成3条干扰慢病毒，1条过表达慢病毒。将病毒按照MOI为10、50、100感染BMSC，48 h后荧光显微镜下观察病毒感染效率。（2）筛选出最佳敲降慢病毒：细胞内总RNA的抽提采用Trizol提取试剂盒（Invitrogen），采用第一链cDNA合成试剂盒（天根），SYBRGreen PCR试剂盒（Thermo F-415XL）以及逆转录试剂盒（Thermo K1622）等完成实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）。逆转录PCR所使用的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0软件设计、合成。根据RT-PCR反应体系配制反应液。在PCR反应管（20 μL）中分别加入ddH2O 7 μL、SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、cDNA模板1 μL，充分混匀。94℃ 10 min，以及94℃ 20 s，55℃ 20s，72℃ 20 s共40个循环。PCR扩增后，以管家基因GAPDH为内参，采用2–△△CT法分析目的基因在对照组和各实验组之间的表达差异。筛选出最佳效率的敲降慢病毒序列。（3）采用慢病毒转染ptges及ptges shRNA至BMSC，建立稳定的ptges过表达BMSC细胞株［BMSC-PGE2（+）］及ptges沉默的BMSC细胞株［BMSC-PGE2（–）］。调整细胞数为1×106/mL接种于6孔板培养中，吸取上清，PBS冲洗3次，加入含有慢病毒的无血清培养基3 mL后继续培养、传代并继续下一步实验。
1.2.4 Western blot检测巨噬细胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达水平
（1）样品准备：肺泡巨噬细胞以2×106/mL接种在Transwell上室中，随机分为5组，即对照组、LPS组、LPS+BMSC组、LPS+BMSC-PGE2（+）组、LPS+BMSC-PGE2（–）组。共培养的3组中将BMSC/BMSC-PGE2（+）/BMSC-PGE2（–）以1×106/mL接种在Transwell下室。根据分组将肺泡巨噬细胞与BMSC/BMSC-PGE2（+）/BMSC-PGE2（–）置入Transwell共培养体系，LPS组及共培养体系组予以终浓度为10 ng/mL LPS的无血清培养基共培养5 h，然后以终浓度为5 mmol/L的ATP的无血清培养基共培养1 h。（2）收集细胞，向细胞样本中加入预冷的已加PMSF的RIPA裂解液，混匀，冰上充分裂解离心后收集蛋白。（3）进行SDS-PAGE凝胶电泳。上样，电泳，切胶，“三明治”法转膜，漂洗并封闭。加入NLRP3（1∶1 000）、pro-Caspase-1（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、pro-IL-1β（1∶1 000）及GAPDH（1∶5 000）抗体，4℃孵育，漂洗后加入兔二抗或鼠二抗（1∶5 000）。加入ECL发光液显色拍照。
1.2.5 RT-PCR检测巨噬细胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平
收集各组细胞，加入Trizol试剂，提取细胞中的总RNA。随后按照第一链cDNA合成试剂盒（天根）说明书合成cDNA，按照SYBRGreen PCR试剂盒（Thermo F-415XL）说明书配制RT-PCR反应体系，反应程序为：94℃ 10 min，以及94℃ 20s，55℃ 20 s，72℃ 20 s共40个循环。以管家基因GAPDH为内参，采用2–△△CT法计算NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平。
1.2.6 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2水平
采用TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2 ELISA试剂盒说明书。
1.3 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件分析，呈正态分布的计量数据以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，方差不齐时采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成功获取并培养肺泡巨噬细胞
采用原位支气管肺泡灌洗法收集的BALF中90%的是肺泡巨噬细胞，红细胞、中性粒细胞及淋巴细胞等经纯化培养被去除。获得的肺泡巨噬细胞呈圆形，伪足不明显，贴壁后，肺泡巨噬细胞铺展开，逐渐伸出伪足（图1a）。荧光显微镜下观察肺泡巨噬细胞内有大量DIL-ac-LDL，提示巨噬细胞吞噬活性良好（图1b）。
图1
小鼠巨噬细胞特征
a. 镜下特征（×100，×200）；b. 荧光显微镜下细胞特征（×500）。
2.2 成功提取、培养及鉴定BMSC
BMSC原代细胞在接种24 h后逐渐贴壁，细胞胞体小，大多为梭形，核居中，偶有宽大扁平的多边形，细胞折光性强。通过多次换液传代，可使BMSC更为均一，成梭形成纤维样（图2a）。利用流式细胞仪对第3代BMSC进行鉴定，其结果显示细胞CD29、CD90抗体阳性表达率均为99%，CD45、CD34抗体阳性表达率分别为1.39%和3.15%，提示CD29、CD90为阳性表达，CD45、CD34为阴性表达（图2b）。符合公认的BMSC免疫表型，提示提取BMSC培养并鉴定成功。
图2
小鼠骨髓间充质细胞特征
a. 小鼠BMSC的镜下特征（×200）；b. 流式细胞仪鉴定结果：CD29阳性，CD90阳性，CD45阴性、CD34阴性。
2.3 确定慢病毒MOI值及感染效率最佳的序列
荧光显微镜下观察可见，沉默慢病毒当MOI值为50时，感染效率已达80%以上，故后续选择MOI值为50进行实验（图3a），而过表达慢病毒选择MOI为100进行后续实验（图3b）。RT-PCR实验结果显示，相比对照组，当分别感染沉默慢病毒后，目的基因表达水平均有不同程度的降低，其中慢病毒2效果最好（图3c），所以后期选择该靶向序列用于实验。
图3
BMSC细胞株转染慢病毒荧光显微镜下像和RT-PCR结果
a. 沉默慢病毒的镜下特征（×50）；b. 过表达慢病毒的镜下特征（×50）；c. RT-PCR显示shRNA2沉默效率最高。与对照组比较，**
2.4 巨噬细胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达水平变化
Western blot结果显示，LPS组NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达量较对照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；LPS+BMSC组巨噬细胞与BMSC共培养后，NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达较LPS组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；LPS+BMSC-PGE2（+）组中巨噬细胞与BMSC-PGE2（+）共培养后，NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达进一步下降，差异有统计学意义（P<0.01）；而LPS+BMSC-PGE2（–）组与LPS组无明显变化，差异无统计学意义（图4）。表明LPS刺激后的巨噬细胞中，BMSC通过分泌PGE2，进一步抑制下游NLRP3炎症小体的活化，减轻炎症反应。
图4
NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达Western blot结果
a. NLRP3的表达水平；b. Caspase-1的表达水平；c. pro-Caspase-1的表达水平；d. pro-IL-1β的表达水平；e. NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达水平的代表性图像。与对照组比较，**
2.5 巨噬细胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平变化
RT-PCR实验结果显示，LPS组NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量较对照组明显升高，差异显著，具有统计学意义（P<0.01）；LPS+BMSC组巨噬细胞与BMSC共培养后，NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量较LPS组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；LPS+BMSC-PGE2（+）组中，巨噬细胞与BMSC-PGE2（+）共培养后，NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量进一步下降，差异有统计学意义（P<0.01）；而LPS+BMSC-PGE2（–）组与LPS组无明显变化，差异无统计学意义（图5）。
图5
各组NLRP3的表达水平（a）以及Caspase-1的表达水平（b）
与对照组比较，**
2.6 细胞上清液中相关炎症因子的水平变化
ELISA结果显示，培养液上清中TNF-α、IL-1β及IL-18含量在LPS组中最高，显著高于对照组、LPS+BMSC组和LPS+BMSC-PGE2（+）组，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。培养液上清中IL-10和PGE2含量，LPS组较对照组有升高趋势，LPS+BMSC组和LPS+BMSC-PGE2（+）组进一步增加，与LPS组比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），LPS+BMSC-PGE2（–）组与LPS组没有显著差异（图6）。
图6
细胞上清液中相关炎症因子表达的ELISA结果
a. TNF-α的表达水平；b. IL-1β的表达水平；c. PGE2的表达水平；d. IL-10的表达水平；e. IL-18的表达水平。与对照组比较，*
3 讨论
ALI和ARDS起病急，病情非常凶险，病死率高，是严重威胁人类健康的呼吸系统急危重症[5]。其本质是由多种炎性介质和效应细胞共同参与，呈瀑布样级联放大的炎症反应，发病过程中涉及炎症、凋亡、氧化应激等一系列信号通路。肺泡巨噬细胞的激活是ALI/ARDS进程中的始动环节[6]，在受到内外致病因素的刺激下，一方面分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白2（macrophage inflammatory protein 2，MIP-2）等促炎因子，后者募集大量中性粒细胞，启动和维持肺部炎症反应，造成肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤；另一方面，肺泡巨噬细胞还可以分泌IL-4、IL-10等抗炎因子，后者促进免疫细胞吞噬坏死组织细胞和凋亡的中性粒细胞，促进炎症消散和组织修复。因此，肺泡巨噬细胞介导的促炎和抗炎失衡是ALI/ARDS发生发展的关键性因素。
近年来许多研究证实了BMSC可调节肺部炎症反应，恢复细胞因子网络之间的平衡，减少促炎因子的分泌，增加抗炎标志物和细胞因子的释放[7]。在我们的研究中，通过流式细胞仪得到CD29、CD90为阳性表达，而CD45、CD34为阴性表达的较为纯化的BMSC，可以用于进一步实验。在LPS诱导的ALI模型中，肺泡巨噬细胞相关炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18的表达明显增加，而BMSC能够明显逆转这些促炎因子的表达并增强抗炎因子IL-10 的表达水平。同时，与BMSC相比，过表达PGE2的BMSC可进一步抑制炎症反应，表明过表达PGE2可增强BMSC对LPS诱导的肺泡巨噬细胞损伤的保护作用。
NLRP3是一种模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）[8]，主要在中性粒细胞和巨噬细胞的细胞质中表达，其组成部分包括先天免疫受体蛋白NLRP3、炎性蛋白酶Caspase-1与衔接蛋白ASC。作为机体固有免疫的重要组成部分[9-10]，NLRP3蛋白可被病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）识别并激活，如NLRP3炎症小体可以被细菌LPS、活性氧、K+外流、Ca2+信号、毒素、颗粒物质、病毒RNA和溶酶体破坏等。NLRP3炎症小体激活机制有三种不同信号通路：经典NLRP3炎性体激活、非经典NLRP3炎性体激活和替代NLRP3 炎性体激活（也称为一步NLRP3 炎性体激活）[11-12]。NLRP3炎性体的激活将诱导pro-Caspase-1的自我切割和激活，从而促进包括IL-1β和IL-18在内的多种促炎性细胞因子的剪切和分泌[13]，另一方面活化的Caspase-1还将切割消皮素D（gasdermin D，GSDMD）并释放其N端结构域，这一结构域将转移并在细胞膜处形成孔，从而释放细胞内容物，进而调节程序性细胞焦亡（pyroptosis），诱导细胞在炎性和应激的病理条件下死亡[3，14-17]。研究表明在小鼠ALI模型中，NLRP3炎症小体可被激活，而抑制NLRP3炎症小体可以显著抑制TNF-α、IL-1β的合成和分泌，改善脓毒症所致的肺泡上皮细胞通透性的增加[18]。因此，NLRP3炎症小体的活化在ALI的发生发展中起到重要作用。
其中，包括PGE2在内的许多因子都与NLRP3炎症小体通路激活密切相关[4，19]。PGE合酶（PGE synthase，PTGES）作为PGE2合成中的终末限速酶，参与PGE2的合成[20]。PGE2通过前列腺素E受体（prostaglandin E receptor，EP）家族的4种不同受体发出信号：EP1、EP2、EP3和EP4[21]。研究发现NLRP3炎症体的快速激活被蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）直接抑制，PKA直接磷酸化胞浆受体NLRP3，减弱其ATP酶功能。而PKA是由PGE2通过PGE2受体EP4信号传导诱导的[1]。还有研究发现PGE2通过促进抗炎因子IL-10的分泌，能够抑制中性粒细胞的黏附和内皮细胞激活，对NLRP3炎性小体有拮抗作用[22-23]。阻断巨噬细胞IL-10受体可促进NLRP3炎性体的激活[24]，NLRP3炎症小体的活化也可以抑制单核细胞中IL-10的分泌[25]。IL-10基因敲除的小鼠在LPS刺激后，NLRP3、pro-Caspase-1和pro-IL-1β水平均明显高于野生型[26]，因此通过IL-10来抑制NLRP3炎症小体的活化可能是PGE2的作用机制之一。本研究中，BMSC可明显抑制NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β的表达，降低TNF-α、IL-1β表达水平，增加IL-10的表达水平，当给予过表达PGE2的BMSC后，PGE2可抑制NLRP3活化，与BMSC相比，对ALI的抑制作用进一步增强，从而发挥对ALI的治疗作用。
综上所述，研究结果从细胞层面表明，在LPS诱导的ALI发病过程中，BMSC通过携带并分泌PGE2来促进肺泡巨噬细胞中抗炎因子的释放，从而抑制肺泡巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化，减轻肺部炎性损害。本研究为运用BMSC来调控ALI时的炎症反应提供理论基础，为临床救治ALI患者提供新的治疗策略和重要的理论依据。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）发病机制复杂，病死率和致残率高，其主要的机制是病原体刺激中性粒细胞或者巨噬细胞引起“炎症因子风暴”，使肺泡-毛细血管屏障的破坏、肺水肿而导致的气体交换障碍等[1]。大量研究表明肺部炎症反应的失平衡是ALI/ARDS发病的关键环节，因此抑制和减轻肺部炎症反应是目前ALI/ARDS治疗的研究热点。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor 3，NLRP3）炎症小体是新的模式识别受体，其活化既可促进多种促炎症细胞因子的成熟和分泌，还可以调节细胞焦亡，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的ALI/ARDS发生发展中起着重要作用。近年来，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）在抗炎症、免疫调节及促进血管新生等方面均展现出良好的临床应用前景，研究表明BMSC在炎症刺激下可以大量合成并释放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）减轻炎症反应[2-4]。本研究旨在探究BMSC对ALI中巨噬细胞的作用，机制是否与调控PGE2与NLRP3炎症小体的活化有关等，以期为开发新的ALI治疗策略提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物：选择10只SPF级（6周龄，18～22 g）健康成年雄性BALB/c小鼠。购自常州卡文斯，饲养在同济大学附属东方医院动物房内，环境温度24～26℃，环境湿度55%～60%，光/暗周期为12 h/12 h，小鼠自由饮水和进食。
实验材料：LPS（Sigma），10%水合氯醛（上海生工），DMEM高糖/低糖培养基（Hyclone），FBS（Hyclone），DIL-ac-LDL（上海生工），Trizol（Invitrogen），DEPC处理水（CTCC），氯仿/异丙醇/无水乙醇（上海国药），SYBRGreen PCR试剂盒（Thermo F-415XL），逆转录试剂盒（Thermo K1622），CD90抗体（Invitrogen 61-0902-80），CD29抗体 （Invitrogen 12-0291-81），CD45抗体（Invitrogen 67-0451-82），CD34抗体（Invitrogen 11-0341-81），BCA蛋白定量试剂盒（凯基KGPBCA），RIPA强效裂解液（碧云天P0013B），丙烯酰胺/电泳缓冲液/过硫酸铵（上海国药），蛋白预染Marker（Thermo 26616），NLRP3（ABclonal A5652），pro-Caspase-1（ABclonal A0964），Caspase-1（ABclonal A0964），pro-IL-1β（CST 12242S），GAPDH（proteintech 60004-1-Ig），辣根酶标记山羊抗兔IgG（中杉金桥 ZB2301），辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（中杉金桥 ZB2305），肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（Elabscience E-EL-M0049c），白细胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）（Elabscience E-EL-M0037c），IL-10（Elabscience E-EL-M0046c），IL-18（Elabscience E-EL-M0730c），PGE2（酶联生物）。
实验仪器：细胞培养箱（Thermo Scientific 8000），荧光倒置显微镜（OLYMPUS，IX71），光学显微镜（XDS-1A），离心机（Eppendorf），流式细胞仪（BD-FACSVerse），低温冷冻离心机 （Sigma 3K15）， Real-time检测仪（ABI-7500），电泳仪（BIORAD），酶标仪（ThermoMK3）等。
1.2 方法
1.2.1 支气管肺泡灌洗获取巨噬细胞并检测纯度
取健康SPF级成年雄性BALB/c小鼠，麻醉后暴露气管并气管插管，用预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）进行双肺灌洗，回收获得支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。BALF离心重悬后获得肺泡巨噬细胞，在巨噬细胞培养液中加入DIL-ac-LDL，避光孵育并拍照。
1.2.2 分离及流式细胞术鉴定BMSC
用颈椎脱位法处死小鼠后，用手术剪打开骨髓腔，冲洗、离心、重悬并培养出BMSC。将分离的BMSC收集培养，每孔分别加入200 μL的染色缓冲液，以及CD90、CD29、CD45和CD34抗体。避光孵育30 min后洗涤重悬。流式细胞术定量检测并分析。
1.2.3 建立稳定的慢病毒转染BMSC细胞株
（1）观察慢病毒MOI：商业合成ptges（Gene ID：64292）合成3条干扰慢病毒，1条过表达慢病毒。将病毒按照MOI为10、50、100感染BMSC，48 h后荧光显微镜下观察病毒感染效率。（2）筛选出最佳敲降慢病毒：细胞内总RNA的抽提采用Trizol提取试剂盒（Invitrogen），采用第一链cDNA合成试剂盒（天根），SYBRGreen PCR试剂盒（Thermo F-415XL）以及逆转录试剂盒（Thermo K1622）等完成实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）。逆转录PCR所使用的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0软件设计、合成。根据RT-PCR反应体系配制反应液。在PCR反应管（20 μL）中分别加入ddH2O 7 μL、SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、cDNA模板1 μL，充分混匀。94℃ 10 min，以及94℃ 20 s，55℃ 20s，72℃ 20 s共40个循环。PCR扩增后，以管家基因GAPDH为内参，采用2–△△CT法分析目的基因在对照组和各实验组之间的表达差异。筛选出最佳效率的敲降慢病毒序列。（3）采用慢病毒转染ptges及ptges shRNA至BMSC，建立稳定的ptges过表达BMSC细胞株［BMSC-PGE2（+）］及ptges沉默的BMSC细胞株［BMSC-PGE2（–）］。调整细胞数为1×106/mL接种于6孔板培养中，吸取上清，PBS冲洗3次，加入含有慢病毒的无血清培养基3 mL后继续培养、传代并继续下一步实验。
1.2.4 Western blot检测巨噬细胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达水平
（1）样品准备：肺泡巨噬细胞以2×106/mL接种在Transwell上室中，随机分为5组，即对照组、LPS组、LPS+BMSC组、LPS+BMSC-PGE2（+）组、LPS+BMSC-PGE2（–）组。共培养的3组中将BMSC/BMSC-PGE2（+）/BMSC-PGE2（–）以1×106/mL接种在Transwell下室。根据分组将肺泡巨噬细胞与BMSC/BMSC-PGE2（+）/BMSC-PGE2（–）置入Transwell共培养体系，LPS组及共培养体系组予以终浓度为10 ng/mL LPS的无血清培养基共培养5 h，然后以终浓度为5 mmol/L的ATP的无血清培养基共培养1 h。（2）收集细胞，向细胞样本中加入预冷的已加PMSF的RIPA裂解液，混匀，冰上充分裂解离心后收集蛋白。（3）进行SDS-PAGE凝胶电泳。上样，电泳，切胶，“三明治”法转膜，漂洗并封闭。加入NLRP3（1∶1 000）、pro-Caspase-1（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、pro-IL-1β（1∶1 000）及GAPDH（1∶5 000）抗体，4℃孵育，漂洗后加入兔二抗或鼠二抗（1∶5 000）。加入ECL发光液显色拍照。
1.2.5 RT-PCR检测巨噬细胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平
收集各组细胞，加入Trizol试剂，提取细胞中的总RNA。随后按照第一链cDNA合成试剂盒（天根）说明书合成cDNA，按照SYBRGreen PCR试剂盒（Thermo F-415XL）说明书配制RT-PCR反应体系，反应程序为：94℃ 10 min，以及94℃ 20s，55℃ 20 s，72℃ 20 s共40个循环。以管家基因GAPDH为内参，采用2–△△CT法计算NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平。
1.2.6 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2水平
采用TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2 ELISA试剂盒说明书。
1.3 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件分析，呈正态分布的计量数据以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，方差不齐时采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成功获取并培养肺泡巨噬细胞
采用原位支气管肺泡灌洗法收集的BALF中90%的是肺泡巨噬细胞，红细胞、中性粒细胞及淋巴细胞等经纯化培养被去除。获得的肺泡巨噬细胞呈圆形，伪足不明显，贴壁后，肺泡巨噬细胞铺展开，逐渐伸出伪足（图1a）。荧光显微镜下观察肺泡巨噬细胞内有大量DIL-ac-LDL，提示巨噬细胞吞噬活性良好（图1b）。
图1
小鼠巨噬细胞特征
a. 镜下特征（×100，×200）；b. 荧光显微镜下细胞特征（×500）。
2.2 成功提取、培养及鉴定BMSC
BMSC原代细胞在接种24 h后逐渐贴壁，细胞胞体小，大多为梭形，核居中，偶有宽大扁平的多边形，细胞折光性强。通过多次换液传代，可使BMSC更为均一，成梭形成纤维样（图2a）。利用流式细胞仪对第3代BMSC进行鉴定，其结果显示细胞CD29、CD90抗体阳性表达率均为99%，CD45、CD34抗体阳性表达率分别为1.39%和3.15%，提示CD29、CD90为阳性表达，CD45、CD34为阴性表达（图2b）。符合公认的BMSC免疫表型，提示提取BMSC培养并鉴定成功。
图2
小鼠骨髓间充质细胞特征
a. 小鼠BMSC的镜下特征（×200）；b. 流式细胞仪鉴定结果：CD29阳性，CD90阳性，CD45阴性、CD34阴性。
2.3 确定慢病毒MOI值及感染效率最佳的序列
荧光显微镜下观察可见，沉默慢病毒当MOI值为50时，感染效率已达80%以上，故后续选择MOI值为50进行实验（图3a），而过表达慢病毒选择MOI为100进行后续实验（图3b）。RT-PCR实验结果显示，相比对照组，当分别感染沉默慢病毒后，目的基因表达水平均有不同程度的降低，其中慢病毒2效果最好（图3c），所以后期选择该靶向序列用于实验。
图3
BMSC细胞株转染慢病毒荧光显微镜下像和RT-PCR结果
a. 沉默慢病毒的镜下特征（×50）；b. 过表达慢病毒的镜下特征（×50）；c. RT-PCR显示shRNA2沉默效率最高。与对照组比较，**
2.4 巨噬细胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达水平变化
Western blot结果显示，LPS组NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达量较对照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；LPS+BMSC组巨噬细胞与BMSC共培养后，NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达较LPS组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；LPS+BMSC-PGE2（+）组中巨噬细胞与BMSC-PGE2（+）共培养后，NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达进一步下降，差异有统计学意义（P<0.01）；而LPS+BMSC-PGE2（–）组与LPS组无明显变化，差异无统计学意义（图4）。表明LPS刺激后的巨噬细胞中，BMSC通过分泌PGE2，进一步抑制下游NLRP3炎症小体的活化，减轻炎症反应。
图4
NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达Western blot结果
a. NLRP3的表达水平；b. Caspase-1的表达水平；c. pro-Caspase-1的表达水平；d. pro-IL-1β的表达水平；e. NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达水平的代表性图像。与对照组比较，**
2.5 巨噬细胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平变化
RT-PCR实验结果显示，LPS组NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量较对照组明显升高，差异显著，具有统计学意义（P<0.01）；LPS+BMSC组巨噬细胞与BMSC共培养后，NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量较LPS组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；LPS+BMSC-PGE2（+）组中，巨噬细胞与BMSC-PGE2（+）共培养后，NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量进一步下降，差异有统计学意义（P<0.01）；而LPS+BMSC-PGE2（–）组与LPS组无明显变化，差异无统计学意义（图5）。
图5
各组NLRP3的表达水平（a）以及Caspase-1的表达水平（b）
与对照组比较，**
2.6 细胞上清液中相关炎症因子的水平变化
ELISA结果显示，培养液上清中TNF-α、IL-1β及IL-18含量在LPS组中最高，显著高于对照组、LPS+BMSC组和LPS+BMSC-PGE2（+）组，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。培养液上清中IL-10和PGE2含量，LPS组较对照组有升高趋势，LPS+BMSC组和LPS+BMSC-PGE2（+）组进一步增加，与LPS组比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），LPS+BMSC-PGE2（–）组与LPS组没有显著差异（图6）。
图6
细胞上清液中相关炎症因子表达的ELISA结果
a. TNF-α的表达水平；b. IL-1β的表达水平；c. PGE2的表达水平；d. IL-10的表达水平；e. IL-18的表达水平。与对照组比较，*
3 讨论
ALI和ARDS起病急，病情非常凶险，病死率高，是严重威胁人类健康的呼吸系统急危重症[5]。其本质是由多种炎性介质和效应细胞共同参与，呈瀑布样级联放大的炎症反应，发病过程中涉及炎症、凋亡、氧化应激等一系列信号通路。肺泡巨噬细胞的激活是ALI/ARDS进程中的始动环节[6]，在受到内外致病因素的刺激下，一方面分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白2（macrophage inflammatory protein 2，MIP-2）等促炎因子，后者募集大量中性粒细胞，启动和维持肺部炎症反应，造成肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤；另一方面，肺泡巨噬细胞还可以分泌IL-4、IL-10等抗炎因子，后者促进免疫细胞吞噬坏死组织细胞和凋亡的中性粒细胞，促进炎症消散和组织修复。因此，肺泡巨噬细胞介导的促炎和抗炎失衡是ALI/ARDS发生发展的关键性因素。
近年来许多研究证实了BMSC可调节肺部炎症反应，恢复细胞因子网络之间的平衡，减少促炎因子的分泌，增加抗炎标志物和细胞因子的释放[7]。在我们的研究中，通过流式细胞仪得到CD29、CD90为阳性表达，而CD45、CD34为阴性表达的较为纯化的BMSC，可以用于进一步实验。在LPS诱导的ALI模型中，肺泡巨噬细胞相关炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18的表达明显增加，而BMSC能够明显逆转这些促炎因子的表达并增强抗炎因子IL-10 的表达水平。同时，与BMSC相比，过表达PGE2的BMSC可进一步抑制炎症反应，表明过表达PGE2可增强BMSC对LPS诱导的肺泡巨噬细胞损伤的保护作用。
NLRP3是一种模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）[8]，主要在中性粒细胞和巨噬细胞的细胞质中表达，其组成部分包括先天免疫受体蛋白NLRP3、炎性蛋白酶Caspase-1与衔接蛋白ASC。作为机体固有免疫的重要组成部分[9-10]，NLRP3蛋白可被病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）识别并激活，如NLRP3炎症小体可以被细菌LPS、活性氧、K+外流、Ca2+信号、毒素、颗粒物质、病毒RNA和溶酶体破坏等。NLRP3炎症小体激活机制有三种不同信号通路：经典NLRP3炎性体激活、非经典NLRP3炎性体激活和替代NLRP3 炎性体激活（也称为一步NLRP3 炎性体激活）[11-12]。NLRP3炎性体的激活将诱导pro-Caspase-1的自我切割和激活，从而促进包括IL-1β和IL-18在内的多种促炎性细胞因子的剪切和分泌[13]，另一方面活化的Caspase-1还将切割消皮素D（gasdermin D，GSDMD）并释放其N端结构域，这一结构域将转移并在细胞膜处形成孔，从而释放细胞内容物，进而调节程序性细胞焦亡（pyroptosis），诱导细胞在炎性和应激的病理条件下死亡[3，14-17]。研究表明在小鼠ALI模型中，NLRP3炎症小体可被激活，而抑制NLRP3炎症小体可以显著抑制TNF-α、IL-1β的合成和分泌，改善脓毒症所致的肺泡上皮细胞通透性的增加[18]。因此，NLRP3炎症小体的活化在ALI的发生发展中起到重要作用。
其中，包括PGE2在内的许多因子都与NLRP3炎症小体通路激活密切相关[4，19]。PGE合酶（PGE synthase，PTGES）作为PGE2合成中的终末限速酶，参与PGE2的合成[20]。PGE2通过前列腺素E受体（prostaglandin E receptor，EP）家族的4种不同受体发出信号：EP1、EP2、EP3和EP4[21]。研究发现NLRP3炎症体的快速激活被蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）直接抑制，PKA直接磷酸化胞浆受体NLRP3，减弱其ATP酶功能。而PKA是由PGE2通过PGE2受体EP4信号传导诱导的[1]。还有研究发现PGE2通过促进抗炎因子IL-10的分泌，能够抑制中性粒细胞的黏附和内皮细胞激活，对NLRP3炎性小体有拮抗作用[22-23]。阻断巨噬细胞IL-10受体可促进NLRP3炎性体的激活[24]，NLRP3炎症小体的活化也可以抑制单核细胞中IL-10的分泌[25]。IL-10基因敲除的小鼠在LPS刺激后，NLRP3、pro-Caspase-1和pro-IL-1β水平均明显高于野生型[26]，因此通过IL-10来抑制NLRP3炎症小体的活化可能是PGE2的作用机制之一。本研究中，BMSC可明显抑制NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β的表达，降低TNF-α、IL-1β表达水平，增加IL-10的表达水平，当给予过表达PGE2的BMSC后，PGE2可抑制NLRP3活化，与BMSC相比，对ALI的抑制作用进一步增强，从而发挥对ALI的治疗作用。
综上所述，研究结果从细胞层面表明，在LPS诱导的ALI发病过程中，BMSC通过携带并分泌PGE2来促进肺泡巨噬细胞中抗炎因子的释放，从而抑制肺泡巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化，减轻肺部炎性损害。本研究为运用BMSC来调控ALI时的炎症反应提供理论基础，为临床救治ALI患者提供新的治疗策略和重要的理论依据。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
