引用本文: 潘天宇, 邓圣洁, 林婷婷, 万慧敏, 单梦田, 陆晶晶. 骨髓间充质干细胞通过前列腺素E2调控NLRP3抑制肺泡巨噬细胞相关炎症反应. 中国呼吸与危重监护杂志, 2024, 23(7): 495-503. doi: 10.7507/1671-6205.202403037 复制
急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)发病机制复杂,病死率和致残率高,其主要的机制是病原体刺激中性粒细胞或者巨噬细胞引起“炎症因子风暴”,使肺泡-毛细血管屏障的破坏、肺水肿而导致的气体交换障碍等[1]。大量研究表明肺部炎症反应的失平衡是ALI/ARDS发病的关键环节,因此抑制和减轻肺部炎症反应是目前ALI/ARDS治疗的研究热点。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor 3,NLRP3)炎症小体是新的模式识别受体,其活化既可促进多种促炎症细胞因子的成熟和分泌,还可以调节细胞焦亡,在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的ALI/ARDS发生发展中起着重要作用。近年来,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)在抗炎症、免疫调节及促进血管新生等方面均展现出良好的临床应用前景,研究表明BMSC在炎症刺激下可以大量合成并释放前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)减轻炎症反应[2-4]。本研究旨在探究BMSC对ALI中巨噬细胞的作用,机制是否与调控PGE2与NLRP3炎症小体的活化有关等,以期为开发新的ALI治疗策略提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物:选择10只SPF级(6周龄,18~22 g)健康成年雄性BALB/c小鼠。购自常州卡文斯,饲养在同济大学附属东方医院动物房内,环境温度24~26℃,环境湿度55%~60%,光/暗周期为12 h/12 h,小鼠自由饮水和进食。
实验材料:LPS(Sigma),10%水合氯醛(上海生工),DMEM高糖/低糖培养基(Hyclone),FBS(Hyclone),DIL-ac-LDL(上海生工),Trizol(Invitrogen),DEPC处理水(CTCC),氯仿/异丙醇/无水乙醇(上海国药),SYBRGreen PCR试剂盒(Thermo F-415XL),逆转录试剂盒(Thermo K1622),CD90抗体(Invitrogen 61-0902-80),CD29抗体 (Invitrogen 12-0291-81),CD45抗体(Invitrogen 67-0451-82),CD34抗体(Invitrogen 11-0341-81),BCA蛋白定量试剂盒(凯基KGPBCA),RIPA强效裂解液(碧云天P0013B),丙烯酰胺/电泳缓冲液/过硫酸铵(上海国药),蛋白预染Marker(Thermo 26616),NLRP3(ABclonal A5652),pro-Caspase-1(ABclonal A0964),Caspase-1(ABclonal A0964),pro-IL-1β(CST 12242S),GAPDH(proteintech 60004-1-Ig),辣根酶标记山羊抗兔IgG(中杉金桥 ZB2301),辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(中杉金桥 ZB2305),肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(Elabscience E-EL-M0049c),白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)(Elabscience E-EL-M0037c),IL-10(Elabscience E-EL-M0046c),IL-18(Elabscience E-EL-M0730c),PGE2(酶联生物)。
实验仪器:细胞培养箱(Thermo Scientific 8000),荧光倒置显微镜(OLYMPUS,IX71),光学显微镜(XDS-1A),离心机(Eppendorf),流式细胞仪(BD-FACSVerse),低温冷冻离心机 (Sigma 3K15), Real-time检测仪(ABI-7500),电泳仪(BIORAD),酶标仪(ThermoMK3)等。
1.2 方法
1.2.1 支气管肺泡灌洗获取巨噬细胞并检测纯度
取健康SPF级成年雄性BALB/c小鼠,麻醉后暴露气管并气管插管,用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)进行双肺灌洗,回收获得支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。BALF离心重悬后获得肺泡巨噬细胞,在巨噬细胞培养液中加入DIL-ac-LDL,避光孵育并拍照。
1.2.2 分离及流式细胞术鉴定BMSC
用颈椎脱位法处死小鼠后,用手术剪打开骨髓腔,冲洗、离心、重悬并培养出BMSC。将分离的BMSC收集培养,每孔分别加入200 μL的染色缓冲液,以及CD90、CD29、CD45和CD34抗体。避光孵育30 min后洗涤重悬。流式细胞术定量检测并分析。
1.2.3 建立稳定的慢病毒转染BMSC细胞株
(1)观察慢病毒MOI:商业合成ptges(Gene ID:64292)合成3条干扰慢病毒,1条过表达慢病毒。将病毒按照MOI为10、50、100感染BMSC,48 h后荧光显微镜下观察病毒感染效率。(2)筛选出最佳敲降慢病毒:细胞内总RNA的抽提采用Trizol提取试剂盒(Invitrogen),采用第一链cDNA合成试剂盒(天根),SYBRGreen PCR试剂盒(Thermo F-415XL)以及逆转录试剂盒(Thermo K1622)等完成实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)。逆转录PCR所使用的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0软件设计、合成。根据RT-PCR反应体系配制反应液。在PCR反应管(20 μL)中分别加入ddH2O 7 μL、SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、cDNA模板1 μL,充分混匀。94℃ 10 min,以及94℃ 20 s,55℃ 20s,72℃ 20 s共40个循环。PCR扩增后,以管家基因GAPDH为内参,采用2–△△CT法分析目的基因在对照组和各实验组之间的表达差异。筛选出最佳效率的敲降慢病毒序列。(3)采用慢病毒转染ptges及ptges shRNA至BMSC,建立稳定的ptges过表达BMSC细胞株[BMSC-PGE2(+)]及ptges沉默的BMSC细胞株[BMSC-PGE2(–)]。调整细胞数为1×106/mL接种于6孔板培养中,吸取上清,PBS冲洗3次,加入含有慢病毒的无血清培养基3 mL后继续培养、传代并继续下一步实验。
1.2.4 Western blot检测巨噬细胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达水平
(1)样品准备:肺泡巨噬细胞以2×106/mL接种在Transwell上室中,随机分为5组,即对照组、LPS组、LPS+BMSC组、LPS+BMSC-PGE2(+)组、LPS+BMSC-PGE2(–)组。共培养的3组中将BMSC/BMSC-PGE2(+)/BMSC-PGE2(–)以1×106/mL接种在Transwell下室。根据分组将肺泡巨噬细胞与BMSC/BMSC-PGE2(+)/BMSC-PGE2(–)置入Transwell共培养体系,LPS组及共培养体系组予以终浓度为10 ng/mL LPS的无血清培养基共培养5 h,然后以终浓度为5 mmol/L的ATP的无血清培养基共培养1 h。(2)收集细胞,向细胞样本中加入预冷的已加PMSF的RIPA裂解液,混匀,冰上充分裂解离心后收集蛋白。(3)进行SDS-PAGE凝胶电泳。上样,电泳,切胶,“三明治”法转膜,漂洗并封闭。加入NLRP3(1∶1 000)、pro-Caspase-1(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)、pro-IL-1β(1∶1 000)及GAPDH(1∶5 000)抗体,4℃孵育,漂洗后加入兔二抗或鼠二抗(1∶5 000)。加入ECL发光液显色拍照。
1.2.5 RT-PCR检测巨噬细胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平
收集各组细胞,加入Trizol试剂,提取细胞中的总RNA。随后按照第一链cDNA合成试剂盒(天根)说明书合成cDNA,按照SYBRGreen PCR试剂盒(Thermo F-415XL)说明书配制RT-PCR反应体系,反应程序为:94℃ 10 min,以及94℃ 20s,55℃ 20 s,72℃ 20 s共40个循环。以管家基因GAPDH为内参,采用2–△△CT法计算NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平。
1.2.6 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2水平
采用TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2 ELISA试剂盒说明书。
1.3 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件分析,呈正态分布的计量数据以均数±标准差(x±s)表示,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,方差不齐时采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成功获取并培养肺泡巨噬细胞
采用原位支气管肺泡灌洗法收集的BALF中90%的是肺泡巨噬细胞,红细胞、中性粒细胞及淋巴细胞等经纯化培养被去除。获得的肺泡巨噬细胞呈圆形,伪足不明显,贴壁后,肺泡巨噬细胞铺展开,逐渐伸出伪足(图1a)。荧光显微镜下观察肺泡巨噬细胞内有大量DIL-ac-LDL,提示巨噬细胞吞噬活性良好(图1b)。

a. 镜下特征(×100,×200);b. 荧光显微镜下细胞特征(×500)。
2.2 成功提取、培养及鉴定BMSC
BMSC原代细胞在接种24 h后逐渐贴壁,细胞胞体小,大多为梭形,核居中,偶有宽大扁平的多边形,细胞折光性强。通过多次换液传代,可使BMSC更为均一,成梭形成纤维样(图2a)。利用流式细胞仪对第3代BMSC进行鉴定,其结果显示细胞CD29、CD90抗体阳性表达率均为99%,CD45、CD34抗体阳性表达率分别为1.39%和3.15%,提示CD29、CD90为阳性表达,CD45、CD34为阴性表达(图2b)。符合公认的BMSC免疫表型,提示提取BMSC培养并鉴定成功。

a. 小鼠BMSC的镜下特征(×200);b. 流式细胞仪鉴定结果:CD29阳性,CD90阳性,CD45阴性、CD34阴性。
2.3 确定慢病毒MOI值及感染效率最佳的序列
荧光显微镜下观察可见,沉默慢病毒当MOI值为50时,感染效率已达80%以上,故后续选择MOI值为50进行实验(图3a),而过表达慢病毒选择MOI为100进行后续实验(图3b)。RT-PCR实验结果显示,相比对照组,当分别感染沉默慢病毒后,目的基因表达水平均有不同程度的降低,其中慢病毒2效果最好(图3c),所以后期选择该靶向序列用于实验。

a. 沉默慢病毒的镜下特征(×50);b. 过表达慢病毒的镜下特征(×50);c. RT-PCR显示shRNA2沉默效率最高。与对照组比较,**
2.4 巨噬细胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达水平变化
Western blot结果显示,LPS组NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达量较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);LPS+BMSC组巨噬细胞与BMSC共培养后,NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达较LPS组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);LPS+BMSC-PGE2(+)组中巨噬细胞与BMSC-PGE2(+)共培养后,NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达进一步下降,差异有统计学意义(P<0.01);而LPS+BMSC-PGE2(–)组与LPS组无明显变化,差异无统计学意义(图4)。表明LPS刺激后的巨噬细胞中,BMSC通过分泌PGE2,进一步抑制下游NLRP3炎症小体的活化,减轻炎症反应。

a. NLRP3的表达水平;b. Caspase-1的表达水平;c. pro-Caspase-1的表达水平;d. pro-IL-1β的表达水平;e. NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达水平的代表性图像。与对照组比较,**
2.5 巨噬细胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平变化
RT-PCR实验结果显示,LPS组NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量较对照组明显升高,差异显著,具有统计学意义(P<0.01);LPS+BMSC组巨噬细胞与BMSC共培养后,NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量较LPS组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);LPS+BMSC-PGE2(+)组中,巨噬细胞与BMSC-PGE2(+)共培养后,NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量进一步下降,差异有统计学意义(P<0.01);而LPS+BMSC-PGE2(–)组与LPS组无明显变化,差异无统计学意义(图5)。

与对照组比较,**
2.6 细胞上清液中相关炎症因子的水平变化
ELISA结果显示,培养液上清中TNF-α、IL-1β及IL-18含量在LPS组中最高,显著高于对照组、LPS+BMSC组和LPS+BMSC-PGE2(+)组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。培养液上清中IL-10和PGE2含量,LPS组较对照组有升高趋势,LPS+BMSC组和LPS+BMSC-PGE2(+)组进一步增加,与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),LPS+BMSC-PGE2(–)组与LPS组没有显著差异(图6)。

a. TNF-α的表达水平;b. IL-1β的表达水平;c. PGE2的表达水平;d. IL-10的表达水平;e. IL-18的表达水平。与对照组比较,*
3 讨论
ALI和ARDS起病急,病情非常凶险,病死率高,是严重威胁人类健康的呼吸系统急危重症[5]。其本质是由多种炎性介质和效应细胞共同参与,呈瀑布样级联放大的炎症反应,发病过程中涉及炎症、凋亡、氧化应激等一系列信号通路。肺泡巨噬细胞的激活是ALI/ARDS进程中的始动环节[6],在受到内外致病因素的刺激下,一方面分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein 2,MIP-2)等促炎因子,后者募集大量中性粒细胞,启动和维持肺部炎症反应,造成肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤;另一方面,肺泡巨噬细胞还可以分泌IL-4、IL-10等抗炎因子,后者促进免疫细胞吞噬坏死组织细胞和凋亡的中性粒细胞,促进炎症消散和组织修复。因此,肺泡巨噬细胞介导的促炎和抗炎失衡是ALI/ARDS发生发展的关键性因素。
近年来许多研究证实了BMSC可调节肺部炎症反应,恢复细胞因子网络之间的平衡,减少促炎因子的分泌,增加抗炎标志物和细胞因子的释放[7]。在我们的研究中,通过流式细胞仪得到CD29、CD90为阳性表达,而CD45、CD34为阴性表达的较为纯化的BMSC,可以用于进一步实验。在LPS诱导的ALI模型中,肺泡巨噬细胞相关炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18的表达明显增加,而BMSC能够明显逆转这些促炎因子的表达并增强抗炎因子IL-10 的表达水平。同时,与BMSC相比,过表达PGE2的BMSC可进一步抑制炎症反应,表明过表达PGE2可增强BMSC对LPS诱导的肺泡巨噬细胞损伤的保护作用。
NLRP3是一种模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)[8],主要在中性粒细胞和巨噬细胞的细胞质中表达,其组成部分包括先天免疫受体蛋白NLRP3、炎性蛋白酶Caspase-1与衔接蛋白ASC。作为机体固有免疫的重要组成部分[9-10],NLRP3蛋白可被病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)识别并激活,如NLRP3炎症小体可以被细菌LPS、活性氧、K+外流、Ca2+信号、毒素、颗粒物质、病毒RNA和溶酶体破坏等。NLRP3炎症小体激活机制有三种不同信号通路:经典NLRP3炎性体激活、非经典NLRP3炎性体激活和替代NLRP3 炎性体激活(也称为一步NLRP3 炎性体激活)[11-12]。NLRP3炎性体的激活将诱导pro-Caspase-1的自我切割和激活,从而促进包括IL-1β和IL-18在内的多种促炎性细胞因子的剪切和分泌[13],另一方面活化的Caspase-1还将切割消皮素D(gasdermin D,GSDMD)并释放其N端结构域,这一结构域将转移并在细胞膜处形成孔,从而释放细胞内容物,进而调节程序性细胞焦亡(pyroptosis),诱导细胞在炎性和应激的病理条件下死亡[3,14-17]。研究表明在小鼠ALI模型中,NLRP3炎症小体可被激活,而抑制NLRP3炎症小体可以显著抑制TNF-α、IL-1β的合成和分泌,改善脓毒症所致的肺泡上皮细胞通透性的增加[18]。因此,NLRP3炎症小体的活化在ALI的发生发展中起到重要作用。
其中,包括PGE2在内的许多因子都与NLRP3炎症小体通路激活密切相关[4,19]。PGE合酶(PGE synthase,PTGES)作为PGE2合成中的终末限速酶,参与PGE2的合成[20]。PGE2通过前列腺素E受体(prostaglandin E receptor,EP)家族的4种不同受体发出信号:EP1、EP2、EP3和EP4[21]。研究发现NLRP3炎症体的快速激活被蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)直接抑制,PKA直接磷酸化胞浆受体NLRP3,减弱其ATP酶功能。而PKA是由PGE2通过PGE2受体EP4信号传导诱导的[1]。还有研究发现PGE2通过促进抗炎因子IL-10的分泌,能够抑制中性粒细胞的黏附和内皮细胞激活,对NLRP3炎性小体有拮抗作用[22-23]。阻断巨噬细胞IL-10受体可促进NLRP3炎性体的激活[24],NLRP3炎症小体的活化也可以抑制单核细胞中IL-10的分泌[25]。IL-10基因敲除的小鼠在LPS刺激后,NLRP3、pro-Caspase-1和pro-IL-1β水平均明显高于野生型[26],因此通过IL-10来抑制NLRP3炎症小体的活化可能是PGE2的作用机制之一。本研究中,BMSC可明显抑制NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β的表达,降低TNF-α、IL-1β表达水平,增加IL-10的表达水平,当给予过表达PGE2的BMSC后,PGE2可抑制NLRP3活化,与BMSC相比,对ALI的抑制作用进一步增强,从而发挥对ALI的治疗作用。
综上所述,研究结果从细胞层面表明,在LPS诱导的ALI发病过程中,BMSC通过携带并分泌PGE2来促进肺泡巨噬细胞中抗炎因子的释放,从而抑制肺泡巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化,减轻肺部炎性损害。本研究为运用BMSC来调控ALI时的炎症反应提供理论基础,为临床救治ALI患者提供新的治疗策略和重要的理论依据。
利益冲突:本研究不涉及任何利益冲突。
急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)发病机制复杂,病死率和致残率高,其主要的机制是病原体刺激中性粒细胞或者巨噬细胞引起“炎症因子风暴”,使肺泡-毛细血管屏障的破坏、肺水肿而导致的气体交换障碍等[1]。大量研究表明肺部炎症反应的失平衡是ALI/ARDS发病的关键环节,因此抑制和减轻肺部炎症反应是目前ALI/ARDS治疗的研究热点。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor 3,NLRP3)炎症小体是新的模式识别受体,其活化既可促进多种促炎症细胞因子的成熟和分泌,还可以调节细胞焦亡,在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的ALI/ARDS发生发展中起着重要作用。近年来,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)在抗炎症、免疫调节及促进血管新生等方面均展现出良好的临床应用前景,研究表明BMSC在炎症刺激下可以大量合成并释放前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)减轻炎症反应[2-4]。本研究旨在探究BMSC对ALI中巨噬细胞的作用,机制是否与调控PGE2与NLRP3炎症小体的活化有关等,以期为开发新的ALI治疗策略提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物:选择10只SPF级(6周龄,18~22 g)健康成年雄性BALB/c小鼠。购自常州卡文斯,饲养在同济大学附属东方医院动物房内,环境温度24~26℃,环境湿度55%~60%,光/暗周期为12 h/12 h,小鼠自由饮水和进食。
实验材料:LPS(Sigma),10%水合氯醛(上海生工),DMEM高糖/低糖培养基(Hyclone),FBS(Hyclone),DIL-ac-LDL(上海生工),Trizol(Invitrogen),DEPC处理水(CTCC),氯仿/异丙醇/无水乙醇(上海国药),SYBRGreen PCR试剂盒(Thermo F-415XL),逆转录试剂盒(Thermo K1622),CD90抗体(Invitrogen 61-0902-80),CD29抗体 (Invitrogen 12-0291-81),CD45抗体(Invitrogen 67-0451-82),CD34抗体(Invitrogen 11-0341-81),BCA蛋白定量试剂盒(凯基KGPBCA),RIPA强效裂解液(碧云天P0013B),丙烯酰胺/电泳缓冲液/过硫酸铵(上海国药),蛋白预染Marker(Thermo 26616),NLRP3(ABclonal A5652),pro-Caspase-1(ABclonal A0964),Caspase-1(ABclonal A0964),pro-IL-1β(CST 12242S),GAPDH(proteintech 60004-1-Ig),辣根酶标记山羊抗兔IgG(中杉金桥 ZB2301),辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(中杉金桥 ZB2305),肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(Elabscience E-EL-M0049c),白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)(Elabscience E-EL-M0037c),IL-10(Elabscience E-EL-M0046c),IL-18(Elabscience E-EL-M0730c),PGE2(酶联生物)。
实验仪器:细胞培养箱(Thermo Scientific 8000),荧光倒置显微镜(OLYMPUS,IX71),光学显微镜(XDS-1A),离心机(Eppendorf),流式细胞仪(BD-FACSVerse),低温冷冻离心机 (Sigma 3K15), Real-time检测仪(ABI-7500),电泳仪(BIORAD),酶标仪(ThermoMK3)等。
1.2 方法
1.2.1 支气管肺泡灌洗获取巨噬细胞并检测纯度
取健康SPF级成年雄性BALB/c小鼠,麻醉后暴露气管并气管插管,用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)进行双肺灌洗,回收获得支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。BALF离心重悬后获得肺泡巨噬细胞,在巨噬细胞培养液中加入DIL-ac-LDL,避光孵育并拍照。
1.2.2 分离及流式细胞术鉴定BMSC
用颈椎脱位法处死小鼠后,用手术剪打开骨髓腔,冲洗、离心、重悬并培养出BMSC。将分离的BMSC收集培养,每孔分别加入200 μL的染色缓冲液,以及CD90、CD29、CD45和CD34抗体。避光孵育30 min后洗涤重悬。流式细胞术定量检测并分析。
1.2.3 建立稳定的慢病毒转染BMSC细胞株
(1)观察慢病毒MOI:商业合成ptges(Gene ID:64292)合成3条干扰慢病毒,1条过表达慢病毒。将病毒按照MOI为10、50、100感染BMSC,48 h后荧光显微镜下观察病毒感染效率。(2)筛选出最佳敲降慢病毒:细胞内总RNA的抽提采用Trizol提取试剂盒(Invitrogen),采用第一链cDNA合成试剂盒(天根),SYBRGreen PCR试剂盒(Thermo F-415XL)以及逆转录试剂盒(Thermo K1622)等完成实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)。逆转录PCR所使用的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0软件设计、合成。根据RT-PCR反应体系配制反应液。在PCR反应管(20 μL)中分别加入ddH2O 7 μL、SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、cDNA模板1 μL,充分混匀。94℃ 10 min,以及94℃ 20 s,55℃ 20s,72℃ 20 s共40个循环。PCR扩增后,以管家基因GAPDH为内参,采用2–△△CT法分析目的基因在对照组和各实验组之间的表达差异。筛选出最佳效率的敲降慢病毒序列。(3)采用慢病毒转染ptges及ptges shRNA至BMSC,建立稳定的ptges过表达BMSC细胞株[BMSC-PGE2(+)]及ptges沉默的BMSC细胞株[BMSC-PGE2(–)]。调整细胞数为1×106/mL接种于6孔板培养中,吸取上清,PBS冲洗3次,加入含有慢病毒的无血清培养基3 mL后继续培养、传代并继续下一步实验。
1.2.4 Western blot检测巨噬细胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达水平
(1)样品准备:肺泡巨噬细胞以2×106/mL接种在Transwell上室中,随机分为5组,即对照组、LPS组、LPS+BMSC组、LPS+BMSC-PGE2(+)组、LPS+BMSC-PGE2(–)组。共培养的3组中将BMSC/BMSC-PGE2(+)/BMSC-PGE2(–)以1×106/mL接种在Transwell下室。根据分组将肺泡巨噬细胞与BMSC/BMSC-PGE2(+)/BMSC-PGE2(–)置入Transwell共培养体系,LPS组及共培养体系组予以终浓度为10 ng/mL LPS的无血清培养基共培养5 h,然后以终浓度为5 mmol/L的ATP的无血清培养基共培养1 h。(2)收集细胞,向细胞样本中加入预冷的已加PMSF的RIPA裂解液,混匀,冰上充分裂解离心后收集蛋白。(3)进行SDS-PAGE凝胶电泳。上样,电泳,切胶,“三明治”法转膜,漂洗并封闭。加入NLRP3(1∶1 000)、pro-Caspase-1(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)、pro-IL-1β(1∶1 000)及GAPDH(1∶5 000)抗体,4℃孵育,漂洗后加入兔二抗或鼠二抗(1∶5 000)。加入ECL发光液显色拍照。
1.2.5 RT-PCR检测巨噬细胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平
收集各组细胞,加入Trizol试剂,提取细胞中的总RNA。随后按照第一链cDNA合成试剂盒(天根)说明书合成cDNA,按照SYBRGreen PCR试剂盒(Thermo F-415XL)说明书配制RT-PCR反应体系,反应程序为:94℃ 10 min,以及94℃ 20s,55℃ 20 s,72℃ 20 s共40个循环。以管家基因GAPDH为内参,采用2–△△CT法计算NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平。
1.2.6 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2水平
采用TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2 ELISA试剂盒说明书。
1.3 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件分析,呈正态分布的计量数据以均数±标准差(x±s)表示,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,方差不齐时采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成功获取并培养肺泡巨噬细胞
采用原位支气管肺泡灌洗法收集的BALF中90%的是肺泡巨噬细胞,红细胞、中性粒细胞及淋巴细胞等经纯化培养被去除。获得的肺泡巨噬细胞呈圆形,伪足不明显,贴壁后,肺泡巨噬细胞铺展开,逐渐伸出伪足(图1a)。荧光显微镜下观察肺泡巨噬细胞内有大量DIL-ac-LDL,提示巨噬细胞吞噬活性良好(图1b)。

a. 镜下特征(×100,×200);b. 荧光显微镜下细胞特征(×500)。
2.2 成功提取、培养及鉴定BMSC
BMSC原代细胞在接种24 h后逐渐贴壁,细胞胞体小,大多为梭形,核居中,偶有宽大扁平的多边形,细胞折光性强。通过多次换液传代,可使BMSC更为均一,成梭形成纤维样(图2a)。利用流式细胞仪对第3代BMSC进行鉴定,其结果显示细胞CD29、CD90抗体阳性表达率均为99%,CD45、CD34抗体阳性表达率分别为1.39%和3.15%,提示CD29、CD90为阳性表达,CD45、CD34为阴性表达(图2b)。符合公认的BMSC免疫表型,提示提取BMSC培养并鉴定成功。

a. 小鼠BMSC的镜下特征(×200);b. 流式细胞仪鉴定结果:CD29阳性,CD90阳性,CD45阴性、CD34阴性。
2.3 确定慢病毒MOI值及感染效率最佳的序列
荧光显微镜下观察可见,沉默慢病毒当MOI值为50时,感染效率已达80%以上,故后续选择MOI值为50进行实验(图3a),而过表达慢病毒选择MOI为100进行后续实验(图3b)。RT-PCR实验结果显示,相比对照组,当分别感染沉默慢病毒后,目的基因表达水平均有不同程度的降低,其中慢病毒2效果最好(图3c),所以后期选择该靶向序列用于实验。

a. 沉默慢病毒的镜下特征(×50);b. 过表达慢病毒的镜下特征(×50);c. RT-PCR显示shRNA2沉默效率最高。与对照组比较,**
2.4 巨噬细胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达水平变化
Western blot结果显示,LPS组NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达量较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);LPS+BMSC组巨噬细胞与BMSC共培养后,NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达较LPS组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);LPS+BMSC-PGE2(+)组中巨噬细胞与BMSC-PGE2(+)共培养后,NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达进一步下降,差异有统计学意义(P<0.01);而LPS+BMSC-PGE2(–)组与LPS组无明显变化,差异无统计学意义(图4)。表明LPS刺激后的巨噬细胞中,BMSC通过分泌PGE2,进一步抑制下游NLRP3炎症小体的活化,减轻炎症反应。

a. NLRP3的表达水平;b. Caspase-1的表达水平;c. pro-Caspase-1的表达水平;d. pro-IL-1β的表达水平;e. NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达水平的代表性图像。与对照组比较,**
2.5 巨噬细胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表达水平变化
RT-PCR实验结果显示,LPS组NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量较对照组明显升高,差异显著,具有统计学意义(P<0.01);LPS+BMSC组巨噬细胞与BMSC共培养后,NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量较LPS组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);LPS+BMSC-PGE2(+)组中,巨噬细胞与BMSC-PGE2(+)共培养后,NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量进一步下降,差异有统计学意义(P<0.01);而LPS+BMSC-PGE2(–)组与LPS组无明显变化,差异无统计学意义(图5)。

与对照组比较,**
2.6 细胞上清液中相关炎症因子的水平变化
ELISA结果显示,培养液上清中TNF-α、IL-1β及IL-18含量在LPS组中最高,显著高于对照组、LPS+BMSC组和LPS+BMSC-PGE2(+)组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。培养液上清中IL-10和PGE2含量,LPS组较对照组有升高趋势,LPS+BMSC组和LPS+BMSC-PGE2(+)组进一步增加,与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),LPS+BMSC-PGE2(–)组与LPS组没有显著差异(图6)。

a. TNF-α的表达水平;b. IL-1β的表达水平;c. PGE2的表达水平;d. IL-10的表达水平;e. IL-18的表达水平。与对照组比较,*
3 讨论
ALI和ARDS起病急,病情非常凶险,病死率高,是严重威胁人类健康的呼吸系统急危重症[5]。其本质是由多种炎性介质和效应细胞共同参与,呈瀑布样级联放大的炎症反应,发病过程中涉及炎症、凋亡、氧化应激等一系列信号通路。肺泡巨噬细胞的激活是ALI/ARDS进程中的始动环节[6],在受到内外致病因素的刺激下,一方面分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein 2,MIP-2)等促炎因子,后者募集大量中性粒细胞,启动和维持肺部炎症反应,造成肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤;另一方面,肺泡巨噬细胞还可以分泌IL-4、IL-10等抗炎因子,后者促进免疫细胞吞噬坏死组织细胞和凋亡的中性粒细胞,促进炎症消散和组织修复。因此,肺泡巨噬细胞介导的促炎和抗炎失衡是ALI/ARDS发生发展的关键性因素。
近年来许多研究证实了BMSC可调节肺部炎症反应,恢复细胞因子网络之间的平衡,减少促炎因子的分泌,增加抗炎标志物和细胞因子的释放[7]。在我们的研究中,通过流式细胞仪得到CD29、CD90为阳性表达,而CD45、CD34为阴性表达的较为纯化的BMSC,可以用于进一步实验。在LPS诱导的ALI模型中,肺泡巨噬细胞相关炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18的表达明显增加,而BMSC能够明显逆转这些促炎因子的表达并增强抗炎因子IL-10 的表达水平。同时,与BMSC相比,过表达PGE2的BMSC可进一步抑制炎症反应,表明过表达PGE2可增强BMSC对LPS诱导的肺泡巨噬细胞损伤的保护作用。
NLRP3是一种模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)[8],主要在中性粒细胞和巨噬细胞的细胞质中表达,其组成部分包括先天免疫受体蛋白NLRP3、炎性蛋白酶Caspase-1与衔接蛋白ASC。作为机体固有免疫的重要组成部分[9-10],NLRP3蛋白可被病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)识别并激活,如NLRP3炎症小体可以被细菌LPS、活性氧、K+外流、Ca2+信号、毒素、颗粒物质、病毒RNA和溶酶体破坏等。NLRP3炎症小体激活机制有三种不同信号通路:经典NLRP3炎性体激活、非经典NLRP3炎性体激活和替代NLRP3 炎性体激活(也称为一步NLRP3 炎性体激活)[11-12]。NLRP3炎性体的激活将诱导pro-Caspase-1的自我切割和激活,从而促进包括IL-1β和IL-18在内的多种促炎性细胞因子的剪切和分泌[13],另一方面活化的Caspase-1还将切割消皮素D(gasdermin D,GSDMD)并释放其N端结构域,这一结构域将转移并在细胞膜处形成孔,从而释放细胞内容物,进而调节程序性细胞焦亡(pyroptosis),诱导细胞在炎性和应激的病理条件下死亡[3,14-17]。研究表明在小鼠ALI模型中,NLRP3炎症小体可被激活,而抑制NLRP3炎症小体可以显著抑制TNF-α、IL-1β的合成和分泌,改善脓毒症所致的肺泡上皮细胞通透性的增加[18]。因此,NLRP3炎症小体的活化在ALI的发生发展中起到重要作用。
其中,包括PGE2在内的许多因子都与NLRP3炎症小体通路激活密切相关[4,19]。PGE合酶(PGE synthase,PTGES)作为PGE2合成中的终末限速酶,参与PGE2的合成[20]。PGE2通过前列腺素E受体(prostaglandin E receptor,EP)家族的4种不同受体发出信号:EP1、EP2、EP3和EP4[21]。研究发现NLRP3炎症体的快速激活被蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)直接抑制,PKA直接磷酸化胞浆受体NLRP3,减弱其ATP酶功能。而PKA是由PGE2通过PGE2受体EP4信号传导诱导的[1]。还有研究发现PGE2通过促进抗炎因子IL-10的分泌,能够抑制中性粒细胞的黏附和内皮细胞激活,对NLRP3炎性小体有拮抗作用[22-23]。阻断巨噬细胞IL-10受体可促进NLRP3炎性体的激活[24],NLRP3炎症小体的活化也可以抑制单核细胞中IL-10的分泌[25]。IL-10基因敲除的小鼠在LPS刺激后,NLRP3、pro-Caspase-1和pro-IL-1β水平均明显高于野生型[26],因此通过IL-10来抑制NLRP3炎症小体的活化可能是PGE2的作用机制之一。本研究中,BMSC可明显抑制NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β的表达,降低TNF-α、IL-1β表达水平,增加IL-10的表达水平,当给予过表达PGE2的BMSC后,PGE2可抑制NLRP3活化,与BMSC相比,对ALI的抑制作用进一步增强,从而发挥对ALI的治疗作用。
综上所述,研究结果从细胞层面表明,在LPS诱导的ALI发病过程中,BMSC通过携带并分泌PGE2来促进肺泡巨噬细胞中抗炎因子的释放,从而抑制肺泡巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化,减轻肺部炎性损害。本研究为运用BMSC来调控ALI时的炎症反应提供理论基础,为临床救治ALI患者提供新的治疗策略和重要的理论依据。
利益冲突:本研究不涉及任何利益冲突。