引用本文： 刘鲁亮, 郭福林, 顾博宇. BMP-4基因T538C多态性与非综合征性唇腭裂相关性的Meta分析. 中国循证医学杂志, 2015, 15(6): 633-638. doi: 10.7507/1672-2531.20150106 复制
先天性唇腭裂可分为综合征性唇腭裂（syndromic cleft lip with or without cleft palate，SCL/P）和非综合征性唇腭裂（non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）。非综合征性唇腭裂又分为唇裂伴或不伴腭裂及单纯性腭裂。NSCL/P是人类最常见的先天性畸形之一，全世界发病率为1‰～2‰，在我国发病率约为1.42‰[1]，且不同种族中发病率也不尽相同。目前认为，NSCL/P是一种多基因、多因素的疾病，是基因与环境相互作用的结果[2]。已有研究表明，NSCL/P与妊娠期吸烟[3]、饮酒[4]、病毒感染[5]等因素密切相关，同时，遗传因素[6-9]也至关重要。越来越多的流行病学研究显示，NSCL/P的发病与许多基因有关，如TGF-α、TGF-β、TGF-2、MSX1、MTHFR、IRF-6、BCL-3、SUMO-1、TBX22等。
骨形成蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP-4）基因，位于14号染色体 （14q22-q23）上，是近年来新发现的NSCL/P的候选基因之一。而538T/C是BMP-4基因中研究最多的单核苷酸多态性位点。有研究结果显示，BMP-4 T538C多态性与NSCL/P的发病存在关联，但现有研究结果不尽相同，且单个研究样本量较小，缺乏说服力。因此，本研究采用Meta分析方法对BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P的相关性进行评价。
1 资料与方法
1.1 纳入与排除标准
1.1.1 研究类型
病例-对照研究。文种限中、英文。
1.1.2 研究对象
经临床明确诊断为NSCL/P。
1.1.3 暴露因素
BMP-4基因T538C多态性。
1.1.4 结局指标
NSCL/P的发病风险。
1.1.5 排除标准
① 原始数据无法提取；② 重复发表的文献；③ 仅有摘要而未找到全文的文献；④ 对照组基因型频率分布不符合哈迪温伯格平衡（H-W平衡）。
1.2 检索策略
计算机检索The Cochrane Library、PubMed、EMbase、CBM、CNKI、VIP以及WanFang Data数据库，搜集已发表的BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P易感性关系的病例-对照研究，检索时限均为从建库到2014年11月。此外，追溯纳入文献的参考文献，以补充获取相关文献。英文检索词包括BMP-4、polymorphism、variant、non-syndromic cleft lip with or without cleft palate （NSCL/P）；中文检索词包括BMP-4基因、多态性、非综合征性唇腭裂（NSCL/P）。以PubMed为例，其具体检索策略见框1。
框 1 PubMed检索策略
#1 polymorphism #2 variant #3 #1 OR #2 #4 BMP4 OR bone morphogenetic protein 4 #5 NSCL/P OR nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate #6 #3 AND #4 AND #5
1.3 文献筛选与资料提取
由2位研究者独立按照纳入与排除标准筛选文献，并交叉核对，如遇分歧，则咨询第三方协助判断，缺乏的资料尽量与作者联系予以补充。文献筛选时，首先阅读文题，如符合纳入标准，则进一步阅读摘要、全文，符合纳入标准后纳入。
采用自制的资料提取表提取资料，提取内容主要包括：研究题目、作者和发表时间，研究对象所属国家及其种族，总样本量，病例组和对照组不同基因型分布频数，基因分型方法及对照组H-W平衡检验结果等。
1.4 纳入研究的偏倚风险评价
由2名评价者独立按照NOS量表（Newcastle-Ottawa Scale）评价纳入研究的偏倚风险，并交叉核对，如遇分歧，讨论解决。评价内容包括研究对象的选择、组间可比性及暴露因素的测量3个部分，共8个条目，满分为9分。其中0～4分为低质量研究，5～9分为高质量研究。
1.5 统计分析
采用RevMan 5.1软件进行Meta分析。首先对纳入研究的对照组基因型进行H-W平衡检验，若P＜0.05，则对照组基因型不符合H-W平衡。然后分别计算5种遗传模型（C vs. T、CT vs. TT、CC vs. TT、CC vs. CT+TT、CC+CT vs. TT）下的基因型分布。采用OR值及其95%CI为合并分析效应量，以α=0.05为Meta分析的检验水准。纳入研究结果间的异质性采用χ2检验进行分析（检验水准设为α=0.1），并结合I2定量判断异质性的大小。若各研究结果间无统计学异质性，采用固定效应模型进行Meta分析；若各研究结果间存在统计学异质性，在排除明显临床异质性的影响后，采用随机效应模型进行Meta分析。明显的临床异质性采用亚组分析（如按人种的不同进行亚组分析）进行处理，或只行描述性分析。发表偏倚检测采用STATA10.0软件。
2 结果
2.1 文献检索结果
初检索出相关文献126篇，经逐层筛选，最终纳入6篇文献[10-15]，包括926例NSCL/P患者和1 110例对照。文献筛选流程及结果见图 1。
图1
文献筛选流程及结果
2.2 纳入研究的基本特征与偏倚风险评价结果
纳入研究的基本特征见表 1，偏倚风险评价结果见表 2。由表 2可见，纳入研究的NOS得分均＞5分，提示纳入研究质量均较高。
表1
纳入研究的基本特征
表2
纳入研究的偏倚风险评价
2.3 Meta分析结果
2.3.1 C vs. T
共纳入6个研究（926例NSCL/P患者，1 110例对照）。随机效应模型Meta分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险无相关性[OR=1.14，95%CI=（0.78，1.66），P=0.51]。根据种族进行的亚组分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性在亚洲人群可能增加NSCL/P的发病风险[OR=1.54，95%CI（1.26，1.87），P＜0.001]，但在拉美人群可能降低NSCL/P的发病风险[OR=0.69，95%CI（0.50，0.96），P=0.03]（图 2）。
图2
BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险相关性的Meta分析（C vs. T）
2.3.2 CT vs. TT
共纳入6个研究（926例NSCL/P患者，1 110例对照）。随机效应模型Meta分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险无相关性[OR=0.75，95%CI（0.50，1.11），P=0.15]。根据种族进行的亚组分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与亚洲人群NSCL/P发病风险无关[OR=0.99，95%CI（0.65，1.52），P=0.97]，但可能降低拉美人群NSCL/P的发病风险[OR=0.52，95%CI（0.40，0.68），P＜0.001]（表 3）。
表3
BMP-4基因T538C因多态性与NSCL/P发病风险相关性的Meta分析
2.3.3 CC vs. TT
共纳入6个研究（926例NSCL/P患者，1 110例对照）。随机效应模型Meta分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险无相关性[OR=1.53，95%CI（0.69，3.37），P=0.29]。根据种族进行的亚组分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性在亚洲人群可能增加NSCL/P的发病风险[OR=2.91，95%CI（1.88，4.52），P＜0.001]，但与拉美人群NSCL/P的发病风险无关[OR=0.55，95%CI（0.24，1.26），P=0.16]（表 3）。
2.3.4 CC vs. CT+TT
共纳入6个研究（926例NSCL/P患者，1 110例对照）。随机效应模型Meta分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险无相关性[OR=1.80，95%CI（0.96，3.38），P=0.07]。根据种族进行的亚组分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性在亚洲人群可能增加NSCL/P的发病风险[OR=2.99，95%CI（1.99，4.49），P＜0.001]，但与拉美人群NSCL/P的发病风险无关[OR=0.83，95%CI（0.45，1.54），P=0.55]（表 3）。
2.3.5 CC+CT vs. TT
共纳入6个研究（926例NSCL/P患者，1 110例对照）。随机效应模型Meta分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险无相关性[OR=0.90，95%CI（0.57，1.43），P=0.65]。根据种族进行的亚组分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与亚洲人群NSCL/P发病风险无关[OR=1.32，95%CI（1.00，1.74），P＞0.05]，但在拉美人群可能降低NSCL/P的发病风险[OR=0.52，95%CI（0.35，0.78），P=0.001]（表 3）。
2.4 发表偏倚
采用Begg's漏斗图和Egger's线性回归模型进行发表偏倚分析。以CC+CT vs. TT为例，漏斗图结果显示图形对称性较好（图 3），Egger线性回归分析结果（Egger’s test=0.458）进一步证实无明显发表偏倚。
图3
BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险相关性的漏斗图（CC+CT vs. TT）
3 讨论
BMP-4是骨形态生产蛋白家族成员，也是分泌信号分子的转化生长因子β（TGF-β）的成员[16]，在胚胎发育中起着重要作用。在颅面部（尤其是上、下颌骨和软骨）及四肢的发育中，BMP-4都有显著表达。Foppiano等[17]在鸡胚中进行了BMP-4功能分析，研究发现，BMP-4基因对于胚胎的发育至关重要，缺乏BMP-4的鸡胚影响了面部的正常发育。Juriloff等[18]的研究发现，BMP-4缺乏的转基因小鼠模型中，转基因小鼠出现了单纯性唇裂。此外，Line等[19]首次发现BMP-4和人类唇腭裂存在一定的相关性。许多的流行病学研究表明，BMP-4对于上唇及腭部的发育尤其重要，被认为是NSCL/P发病的重要候选基因。
BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险的相关性是目前NSCL/P病因学研究的热点。T538C单核苷酸可影响BMP-4基因的转录、相关蛋白的合成，从而影响BMP-4基因的表达。目前，多项研究结果表明，BMP-4基因T538C位点是导致NSCL/P发生的危险因素，然而有学者发现NSCL/P与BMP-4基因T538C多态性并无显著相关性。因而，我们对BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险的相关性进行了Meta分析。
本次Meta分析对等位基因模型、杂合子模型、纯合子模型、隐形模型以及显性模型共5种基因模型进行了分析，结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P的发病风险无显著相关性。由于研究间异质性较大，我们按种族的不同进行了亚组分析，结果显示：对亚洲人群，在等位基因模型、纯合子模型及隐形模型下，BMP-4基因T538C多态性可能增加NSCL/P的发病风险；然而，对于拉美人群，在等位基因模型、杂合子模型及显性基因模型下，BMP-4基因T538C多态性可能降低NSCL/P的发病风险。由此可见，种族是研究BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P易感性相关性必须考虑的重要因素。
本研究也存在一定的局限性。首先，纳入研究数和样本量均较少，可能无法提供足够的检验效能（尤其是亚组分析）而影响Meta分析结果的可靠性。其次，各纳入研究基因分型方法不尽相同，有一项研究采用的是Taqman法，其余均为PCR-RFLP法，这可能是Meta分析结果异质性的来源之一。再次，纳入研究均为已发表文献，不排除阴性结果的研究研究未发表而未纳入本Meta分析，因此可能对Meta分析结果产生影响。另外，NSCL/P的发生是基因与环境相互作用的结果，我们的分析仅考虑了单基因，无法排除其他基因及环境因素对结果产生的影响。
综上所述，现有证据表明，BMP-4基因T538C多态性可能增加亚洲人群NSCL/P发病风险，但可能降低拉美人群NSCL/P发病风险。受纳入研究数量和质量所限，上述结论尚需开展更多研究予以验证。
先天性唇腭裂可分为综合征性唇腭裂（syndromic cleft lip with or without cleft palate，SCL/P）和非综合征性唇腭裂（non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）。非综合征性唇腭裂又分为唇裂伴或不伴腭裂及单纯性腭裂。NSCL/P是人类最常见的先天性畸形之一，全世界发病率为1‰～2‰，在我国发病率约为1.42‰[1]，且不同种族中发病率也不尽相同。目前认为，NSCL/P是一种多基因、多因素的疾病，是基因与环境相互作用的结果[2]。已有研究表明，NSCL/P与妊娠期吸烟[3]、饮酒[4]、病毒感染[5]等因素密切相关，同时，遗传因素[6-9]也至关重要。越来越多的流行病学研究显示，NSCL/P的发病与许多基因有关，如TGF-α、TGF-β、TGF-2、MSX1、MTHFR、IRF-6、BCL-3、SUMO-1、TBX22等。
骨形成蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP-4）基因，位于14号染色体 （14q22-q23）上，是近年来新发现的NSCL/P的候选基因之一。而538T/C是BMP-4基因中研究最多的单核苷酸多态性位点。有研究结果显示，BMP-4 T538C多态性与NSCL/P的发病存在关联，但现有研究结果不尽相同，且单个研究样本量较小，缺乏说服力。因此，本研究采用Meta分析方法对BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P的相关性进行评价。
1 资料与方法
1.1 纳入与排除标准
1.1.1 研究类型
病例-对照研究。文种限中、英文。
1.1.2 研究对象
经临床明确诊断为NSCL/P。
1.1.3 暴露因素
BMP-4基因T538C多态性。
1.1.4 结局指标
NSCL/P的发病风险。
1.1.5 排除标准
① 原始数据无法提取；② 重复发表的文献；③ 仅有摘要而未找到全文的文献；④ 对照组基因型频率分布不符合哈迪温伯格平衡（H-W平衡）。
1.2 检索策略
计算机检索The Cochrane Library、PubMed、EMbase、CBM、CNKI、VIP以及WanFang Data数据库，搜集已发表的BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P易感性关系的病例-对照研究，检索时限均为从建库到2014年11月。此外，追溯纳入文献的参考文献，以补充获取相关文献。英文检索词包括BMP-4、polymorphism、variant、non-syndromic cleft lip with or without cleft palate （NSCL/P）；中文检索词包括BMP-4基因、多态性、非综合征性唇腭裂（NSCL/P）。以PubMed为例，其具体检索策略见框1。
框 1 PubMed检索策略
#1 polymorphism #2 variant #3 #1 OR #2 #4 BMP4 OR bone morphogenetic protein 4 #5 NSCL/P OR nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate #6 #3 AND #4 AND #5
1.3 文献筛选与资料提取
由2位研究者独立按照纳入与排除标准筛选文献，并交叉核对，如遇分歧，则咨询第三方协助判断，缺乏的资料尽量与作者联系予以补充。文献筛选时，首先阅读文题，如符合纳入标准，则进一步阅读摘要、全文，符合纳入标准后纳入。
采用自制的资料提取表提取资料，提取内容主要包括：研究题目、作者和发表时间，研究对象所属国家及其种族，总样本量，病例组和对照组不同基因型分布频数，基因分型方法及对照组H-W平衡检验结果等。
1.4 纳入研究的偏倚风险评价
由2名评价者独立按照NOS量表（Newcastle-Ottawa Scale）评价纳入研究的偏倚风险，并交叉核对，如遇分歧，讨论解决。评价内容包括研究对象的选择、组间可比性及暴露因素的测量3个部分，共8个条目，满分为9分。其中0～4分为低质量研究，5～9分为高质量研究。
1.5 统计分析
采用RevMan 5.1软件进行Meta分析。首先对纳入研究的对照组基因型进行H-W平衡检验，若P＜0.05，则对照组基因型不符合H-W平衡。然后分别计算5种遗传模型（C vs. T、CT vs. TT、CC vs. TT、CC vs. CT+TT、CC+CT vs. TT）下的基因型分布。采用OR值及其95%CI为合并分析效应量，以α=0.05为Meta分析的检验水准。纳入研究结果间的异质性采用χ2检验进行分析（检验水准设为α=0.1），并结合I2定量判断异质性的大小。若各研究结果间无统计学异质性，采用固定效应模型进行Meta分析；若各研究结果间存在统计学异质性，在排除明显临床异质性的影响后，采用随机效应模型进行Meta分析。明显的临床异质性采用亚组分析（如按人种的不同进行亚组分析）进行处理，或只行描述性分析。发表偏倚检测采用STATA10.0软件。
2 结果
2.1 文献检索结果
初检索出相关文献126篇，经逐层筛选，最终纳入6篇文献[10-15]，包括926例NSCL/P患者和1 110例对照。文献筛选流程及结果见图 1。
图1
文献筛选流程及结果
2.2 纳入研究的基本特征与偏倚风险评价结果
纳入研究的基本特征见表 1，偏倚风险评价结果见表 2。由表 2可见，纳入研究的NOS得分均＞5分，提示纳入研究质量均较高。
表1
纳入研究的基本特征
表2
纳入研究的偏倚风险评价
2.3 Meta分析结果
2.3.1 C vs. T
共纳入6个研究（926例NSCL/P患者，1 110例对照）。随机效应模型Meta分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险无相关性[OR=1.14，95%CI=（0.78，1.66），P=0.51]。根据种族进行的亚组分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性在亚洲人群可能增加NSCL/P的发病风险[OR=1.54，95%CI（1.26，1.87），P＜0.001]，但在拉美人群可能降低NSCL/P的发病风险[OR=0.69，95%CI（0.50，0.96），P=0.03]（图 2）。
图2
BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险相关性的Meta分析（C vs. T）
2.3.2 CT vs. TT
共纳入6个研究（926例NSCL/P患者，1 110例对照）。随机效应模型Meta分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险无相关性[OR=0.75，95%CI（0.50，1.11），P=0.15]。根据种族进行的亚组分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与亚洲人群NSCL/P发病风险无关[OR=0.99，95%CI（0.65，1.52），P=0.97]，但可能降低拉美人群NSCL/P的发病风险[OR=0.52，95%CI（0.40，0.68），P＜0.001]（表 3）。
表3
BMP-4基因T538C因多态性与NSCL/P发病风险相关性的Meta分析
2.3.3 CC vs. TT
共纳入6个研究（926例NSCL/P患者，1 110例对照）。随机效应模型Meta分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险无相关性[OR=1.53，95%CI（0.69，3.37），P=0.29]。根据种族进行的亚组分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性在亚洲人群可能增加NSCL/P的发病风险[OR=2.91，95%CI（1.88，4.52），P＜0.001]，但与拉美人群NSCL/P的发病风险无关[OR=0.55，95%CI（0.24，1.26），P=0.16]（表 3）。
2.3.4 CC vs. CT+TT
共纳入6个研究（926例NSCL/P患者，1 110例对照）。随机效应模型Meta分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险无相关性[OR=1.80，95%CI（0.96，3.38），P=0.07]。根据种族进行的亚组分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性在亚洲人群可能增加NSCL/P的发病风险[OR=2.99，95%CI（1.99，4.49），P＜0.001]，但与拉美人群NSCL/P的发病风险无关[OR=0.83，95%CI（0.45，1.54），P=0.55]（表 3）。
2.3.5 CC+CT vs. TT
共纳入6个研究（926例NSCL/P患者，1 110例对照）。随机效应模型Meta分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险无相关性[OR=0.90，95%CI（0.57，1.43），P=0.65]。根据种族进行的亚组分析结果显示，BMP-4基因T538C多态性与亚洲人群NSCL/P发病风险无关[OR=1.32，95%CI（1.00，1.74），P＞0.05]，但在拉美人群可能降低NSCL/P的发病风险[OR=0.52，95%CI（0.35，0.78），P=0.001]（表 3）。
2.4 发表偏倚
采用Begg's漏斗图和Egger's线性回归模型进行发表偏倚分析。以CC+CT vs. TT为例，漏斗图结果显示图形对称性较好（图 3），Egger线性回归分析结果（Egger’s test=0.458）进一步证实无明显发表偏倚。
图3
BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险相关性的漏斗图（CC+CT vs. TT）
3 讨论
BMP-4是骨形态生产蛋白家族成员，也是分泌信号分子的转化生长因子β（TGF-β）的成员[16]，在胚胎发育中起着重要作用。在颅面部（尤其是上、下颌骨和软骨）及四肢的发育中，BMP-4都有显著表达。Foppiano等[17]在鸡胚中进行了BMP-4功能分析，研究发现，BMP-4基因对于胚胎的发育至关重要，缺乏BMP-4的鸡胚影响了面部的正常发育。Juriloff等[18]的研究发现，BMP-4缺乏的转基因小鼠模型中，转基因小鼠出现了单纯性唇裂。此外，Line等[19]首次发现BMP-4和人类唇腭裂存在一定的相关性。许多的流行病学研究表明，BMP-4对于上唇及腭部的发育尤其重要，被认为是NSCL/P发病的重要候选基因。
BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险的相关性是目前NSCL/P病因学研究的热点。T538C单核苷酸可影响BMP-4基因的转录、相关蛋白的合成，从而影响BMP-4基因的表达。目前，多项研究结果表明，BMP-4基因T538C位点是导致NSCL/P发生的危险因素，然而有学者发现NSCL/P与BMP-4基因T538C多态性并无显著相关性。因而，我们对BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P发病风险的相关性进行了Meta分析。
本次Meta分析对等位基因模型、杂合子模型、纯合子模型、隐形模型以及显性模型共5种基因模型进行了分析，结果显示，BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P的发病风险无显著相关性。由于研究间异质性较大，我们按种族的不同进行了亚组分析，结果显示：对亚洲人群，在等位基因模型、纯合子模型及隐形模型下，BMP-4基因T538C多态性可能增加NSCL/P的发病风险；然而，对于拉美人群，在等位基因模型、杂合子模型及显性基因模型下，BMP-4基因T538C多态性可能降低NSCL/P的发病风险。由此可见，种族是研究BMP-4基因T538C多态性与NSCL/P易感性相关性必须考虑的重要因素。
本研究也存在一定的局限性。首先，纳入研究数和样本量均较少，可能无法提供足够的检验效能（尤其是亚组分析）而影响Meta分析结果的可靠性。其次，各纳入研究基因分型方法不尽相同，有一项研究采用的是Taqman法，其余均为PCR-RFLP法，这可能是Meta分析结果异质性的来源之一。再次，纳入研究均为已发表文献，不排除阴性结果的研究研究未发表而未纳入本Meta分析，因此可能对Meta分析结果产生影响。另外，NSCL/P的发生是基因与环境相互作用的结果，我们的分析仅考虑了单基因，无法排除其他基因及环境因素对结果产生的影响。
综上所述，现有证据表明，BMP-4基因T538C多态性可能增加亚洲人群NSCL/P发病风险，但可能降低拉美人群NSCL/P发病风险。受纳入研究数量和质量所限，上述结论尚需开展更多研究予以验证。
