引用本文： 李萍, 郭广玲, 董斯睿, 赵淑颖, 张超. 脐带间充质干细胞移植治疗卵巢早衰有效性动物实验的Meta分析. 中国循证医学杂志, 2022, 22(9): 1041-1047. doi: 10.7507/1672-2531.202110138 复制
卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是妇科内分泌领域的常见病，且近年来发病率呈上升趋势。其在普通妇女中的发病率约为1%，在原发性闭经妇女中高达10%～28%，继发性闭经妇女中高达4%～18%[1]。POF是指女性在40岁以前由于遗传性、自身免疫性、医源性、环境和心理因素等引起的卵巢功能衰退，以血清促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）和黄体生成素（luteinizing hormone，LH）浓度升高及雌二醇（estradiol，E2）浓度降低为特征，导致患者出现更年期综合征、月经不调、雌孕激素水平降低、闭经、不孕等各类症状，且对神经、心脑血管、内分泌、骨骼等全身多器官系统构成影响，严重影响患者的身心健康。
目前治疗POF的主要措施包括激素补充治疗、中医药治疗、免疫调节、卵泡体外激活、卵巢组织冻存移植、胚胎冻存移植等[2]，但疗效均不确切，部分治疗方法存在伦理争议和潜在不良反应。近年来，国内外对干细胞移植治疗多种疾病的研究日趋热烈，目前已有多种干细胞制剂用于治疗移植物抗宿主病、急性心肌梗死、骨性关节炎等[3-4]，且都取得了很好的临床效果。同时已有多种间充质干细胞应用于POF治疗，包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）等[5-7]，为POF的治疗带来可能。人UCMSCs具有取材方便、来源广泛、相对纯净、较为原始及分化能力强等特点，具有自我更新和向多组织细胞分化潜能，此外，其不表达主要组织相容性复合物Ⅱ型或低表达主要组织相容性复合物Ⅰ型特征，使其免疫原性低，减弱了同种异体移植免疫排斥反应，适宜于不同个体间的移植治疗[8]，具有广阔的应用前景。本研究系统评价UCMSCs治疗POF有效性动物实验，以期为后续研究与临床应用提供间接依据。
1 资料与方法
1.1 纳入与排除标准
1.1.1 研究类型
随机或半随机的动物实验。
1.1.2 研究对象
POF造模成功的鼠。
1.1.3 干预措施
实验组采用UCMSCs尾静脉或卵巢原位移植治疗；对照组采用空白对照、生理盐水或PBS缓冲液。
1.1.4 结局指标
① 始基卵泡数目；② 初级卵泡数目；③ 次级卵泡数目；④ 窦状卵泡数目；⑤ E2浓度；⑥ FSH浓度。
1.1.5 排除标准
① 重复发表的文献；② 非中、英文文献；③ 无原始数据或数据不全，无法进行分析的研究；④ UCMSCs联合使用其他治疗方法。
1.2 文献检索策略
计算机检索CNKI、WanFang Data、SinoMed、PubMed和EMbase数据库，搜集关于UCMSCs治疗POF的动物实验，检索时限均从建库起至2021年9月17日。检索采用主题词与自由词相结合的方式进行，并根据各数据库特点进行调整。同时检索纳入研究的参考文献，以补充获取相关资料。英文检索词包括：premature ovarian failure、primary ovarian insufficiency、premature menopause、ovarian dysgenesis、human umbilical cord mesenchymal stem cells、POF等；中文检索词包括：卵巢早衰、原发性卵巢功能不全、过早绝经、卵巢发育不全、脐带间充质干细胞等。以PubMed为例，其具体检索策略见框1。
1.3 文献筛选与资料提取
由2名研究者独立筛选文献、提取资料并交叉核对。如有分歧，则通过讨论或与第三方协商解决。文献筛选时首先阅读文题，在排除明显不相关的文献后，进一步阅读摘要和全文以确定是否纳入。如有需要，通过邮件、电话联系原始研究作者获取未确定但对本研究非常重要的信息。资料提取内容包括：① 纳入研究的基本信息：研究题目、第一作者、发表期刊等；② 研究动物种属、例数和干预措施；③ 偏倚风险评价的关键要素；④ 所关注的结局指标和结果测量数据。
1.4 纳入研究的偏倚风险评价
由2名研究者独立评价纳入研究的偏倚风险，并交叉核对结果。动物实验偏倚风险评价采用SYRCLE偏倚风险评价工具[9]。
1.5 统计分析
采用RevMan 5.4.1软件进行Meta分析。连续性变量采用标准化均数差（standardized mean difference，SMD）[10]为效应分析统计量，并提供其95%可信区间（confidence interval，CI）。纳入研究结果间的异质性采用χ2检验进行分析（检验水准为α=0.1），同时结合I2定量判断异质性大小。若各研究结果间无统计学异质性，则采用固定效应模型进行Meta分析；若各研究结果间存在统计学异质性，则进一步分析异质性来源，在排除明显临床异质性的影响后，采用随机效应模型进行Meta分析。Meta分析的水准设为α=0.05。明显的临床异质性采用亚组分析或敏感性分析等方法进行处理，或只行描述性分析。
2 结果
2.1 文献筛选流程及结果
初检共获得相关文献477篇，经逐层筛选，最终纳入9个研究[11-19]。文献筛选流程及结果见图1。
图1
文献筛选流程及结果
*所检索的数据库及检出文献数具体如下：CNKI（
2.2 纳入研究的基本特征及偏倚风险评价结果
表1
纳入研究的基本特征
表2
纳入研究的偏倚风险评价结果
2.3 Meta分析结果
2.3.1 始基卵泡数目
共6个研究[11-14,16,18]报道了UCMSCs移植对始基卵泡数目的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可提高始基卵泡数目［SMD=1.51，95%CI（0.80，2.22），P<0.000 1］（表3）。
表3
脐带间充质干细胞移植治疗卵巢早衰有效性的Meta分析结果
2.3.2 初级卵泡数目
共6个研究[11-14,16,18]报道了UCMSCs移植对初级卵泡数目的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可提高初级卵泡数目［SMD=1.43，95%CI（0.76，2.09），P<0.000 1］（表3）。
2.3.3 次级卵泡数目
共6个研究[11-14,16,18]报道了UCMSCs移植对次级卵泡数目的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可提高次级卵泡数目［SMD=1.39，95%CI（0.78，2.01），P<0.000 01］（表3）。
2.3.4 窦状卵泡数目
共5个研究[11-14,16]报道了UCMSCs移植对窦状卵泡数目的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可提高窦状卵泡数目［SMD=1.15，95%CI（0.49，1.82），P=0.000 7］（表3）。
2.3.5 E2浓度
共6个研究[11-13,15,17,19]报道了UCMSCs移植对E2浓度的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可提高E2浓度［SMD=2.38，95%CI（1.75，3.01），P<0.000 01］（表3）。
2.3.6 FSH浓度
共6个研究[11-13,15,17,19]报道了UCMSCs移植对FSH浓度的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可降低FSH浓度［SMD=−1.98，95%CI（−2.80，−1.17），P<0.000 01］（表3）。
2.3.7 亚组分析结果
由于纳入研究间存在较大异质性，故按移植部位、体重、移植时机和干细胞浓度进行亚组分析，结果显示大部分亚组的合并结果未发生方向性改变，但异质性仍较高（表3）。
3 讨论
POF是妇科常见病及疑难病，其发病率呈逐渐升高和年轻化趋势。POF发病原因及发病机理十分复杂，且尚未明确。最新研究发现，无论何种原因导致的POF，均伴有颗粒细胞凋亡[20]，说明颗粒细胞异常与POF有直接关系。许多基因发生突变也可能会导致POF的发生，例如脆性X智力障碍基因、抗苗勒管激素基因（anti Mullerian hormonegene，AMH）[21]、生长分化因子9基因、叉头框因子-1基因和LRPPRC基因等[22]。另外，线粒体功能异常也可能通过影响mtDNA的复制而导致POF[23]。
近年来采用间充质干细胞移植进行POF治疗并取得了一定效果。其机制可能与间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如VEGF、IGF-1、HGF、TGF-β和GM-CSF等，通过旁分泌途径参与卵巢颗粒细胞生长调节过程，抑制其凋亡有关[24]。此外，间充质干细胞促进损伤卵巢功能修复的机制可能是其通过腹腔血管进入血液循环到达损伤卵巢，利用其多向分化潜能[25]在体内选择性迁移和停留在机体受损伤的组织，通过MSCs表面表达的生长因子、细胞因子和细胞外基质受体驱使移植的间充质干细胞迁移到炎症部位[26]，分化发育成各级卵泡，分泌多种细胞外基质，促进损伤卵巢功能的修复。但目前采用UCMSCs移植治疗POF的临床研究仍然很少，因此本研究对相关动物实验进行Meta分析，为临床研究的开展提供间接依据。
本研究以各阶段卵泡（始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡及窦状卵泡）数目和E2、FSH浓度作为评价指标，并按照小鼠的体重、干细胞浓度、移植部位和移植时机进行亚组分析，Meta分析结果显示：UCMSCs移植治疗后，各级卵泡数目增加，E2浓度上升，FSH浓度降低，说明UCMSCs移植能修复卵巢组织，改善卵巢内分泌功能。其治疗机制可能为UCMSCs浓聚于卵巢局部，使得UCMSCs分泌的抗凋亡因子在局部形成较高水平，抑制颗粒细胞的凋亡[11]；UCMSCs中表达的血红素加氧酶-1通过激活JNK/Bcl-2信号通路，激活卵巢颗粒细胞自噬，增强其自身形成[27]；另外，UCMSCs还能分化为颗粒细胞和卵子细胞，促进卵巢表面上皮细胞增殖，重新修复白膜[28]，从而促进卵泡的形成，分泌性激素。亚组分析结果显示，尾静脉移植效果更好，可能因为其能使UCMSCs分布于全身多个器官，通过归巢效应[29]，到达损伤的卵巢部位进行修复，且尾静脉移植损伤更小，而卵巢表面覆盖着密集而交织的毛细血管网，卵巢注射时很容易导致其损伤出血，加剧卵巢炎症反应[19]。在移植时机方面，可能由于在造模早期，药物对鼠的卵巢组织损害较轻，故而移植时机≤造模后1天组的疗效明显优于移植时机>造模后1天组，提示早期治疗可能对POF更有效。
本研究的局限性：① 仅检索了中英文文献，存在符合纳入条件的其他语种文献未被纳入的可能，可能存在选择性偏倚；② 部分纳入研究未交待随机方法，所有研究均未描述分配隐藏和盲法实施，可能存在选择和实施偏倚；③ 纳入小鼠的基线特征水平不一致，导致部分结局指标可比性降低；④ 合并分析时存在较大异质性，亚组分析未能明显降低异质性，可能影响结果的准确性。
综上所述，当前证据显示，UCMSCs移植可修复小鼠卵巢组织，改善卵巢内分泌功能。受纳入研究数量和质量的限制，上述结论尚待更多高质量研究予以验证。
卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是妇科内分泌领域的常见病，且近年来发病率呈上升趋势。其在普通妇女中的发病率约为1%，在原发性闭经妇女中高达10%～28%，继发性闭经妇女中高达4%～18%[1]。POF是指女性在40岁以前由于遗传性、自身免疫性、医源性、环境和心理因素等引起的卵巢功能衰退，以血清促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）和黄体生成素（luteinizing hormone，LH）浓度升高及雌二醇（estradiol，E2）浓度降低为特征，导致患者出现更年期综合征、月经不调、雌孕激素水平降低、闭经、不孕等各类症状，且对神经、心脑血管、内分泌、骨骼等全身多器官系统构成影响，严重影响患者的身心健康。
目前治疗POF的主要措施包括激素补充治疗、中医药治疗、免疫调节、卵泡体外激活、卵巢组织冻存移植、胚胎冻存移植等[2]，但疗效均不确切，部分治疗方法存在伦理争议和潜在不良反应。近年来，国内外对干细胞移植治疗多种疾病的研究日趋热烈，目前已有多种干细胞制剂用于治疗移植物抗宿主病、急性心肌梗死、骨性关节炎等[3-4]，且都取得了很好的临床效果。同时已有多种间充质干细胞应用于POF治疗，包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）等[5-7]，为POF的治疗带来可能。人UCMSCs具有取材方便、来源广泛、相对纯净、较为原始及分化能力强等特点，具有自我更新和向多组织细胞分化潜能，此外，其不表达主要组织相容性复合物Ⅱ型或低表达主要组织相容性复合物Ⅰ型特征，使其免疫原性低，减弱了同种异体移植免疫排斥反应，适宜于不同个体间的移植治疗[8]，具有广阔的应用前景。本研究系统评价UCMSCs治疗POF有效性动物实验，以期为后续研究与临床应用提供间接依据。
1 资料与方法
1.1 纳入与排除标准
1.1.1 研究类型
随机或半随机的动物实验。
1.1.2 研究对象
POF造模成功的鼠。
1.1.3 干预措施
实验组采用UCMSCs尾静脉或卵巢原位移植治疗；对照组采用空白对照、生理盐水或PBS缓冲液。
1.1.4 结局指标
① 始基卵泡数目；② 初级卵泡数目；③ 次级卵泡数目；④ 窦状卵泡数目；⑤ E2浓度；⑥ FSH浓度。
1.1.5 排除标准
① 重复发表的文献；② 非中、英文文献；③ 无原始数据或数据不全，无法进行分析的研究；④ UCMSCs联合使用其他治疗方法。
1.2 文献检索策略
计算机检索CNKI、WanFang Data、SinoMed、PubMed和EMbase数据库，搜集关于UCMSCs治疗POF的动物实验，检索时限均从建库起至2021年9月17日。检索采用主题词与自由词相结合的方式进行，并根据各数据库特点进行调整。同时检索纳入研究的参考文献，以补充获取相关资料。英文检索词包括：premature ovarian failure、primary ovarian insufficiency、premature menopause、ovarian dysgenesis、human umbilical cord mesenchymal stem cells、POF等；中文检索词包括：卵巢早衰、原发性卵巢功能不全、过早绝经、卵巢发育不全、脐带间充质干细胞等。以PubMed为例，其具体检索策略见框1。
1.3 文献筛选与资料提取
由2名研究者独立筛选文献、提取资料并交叉核对。如有分歧，则通过讨论或与第三方协商解决。文献筛选时首先阅读文题，在排除明显不相关的文献后，进一步阅读摘要和全文以确定是否纳入。如有需要，通过邮件、电话联系原始研究作者获取未确定但对本研究非常重要的信息。资料提取内容包括：① 纳入研究的基本信息：研究题目、第一作者、发表期刊等；② 研究动物种属、例数和干预措施；③ 偏倚风险评价的关键要素；④ 所关注的结局指标和结果测量数据。
1.4 纳入研究的偏倚风险评价
由2名研究者独立评价纳入研究的偏倚风险，并交叉核对结果。动物实验偏倚风险评价采用SYRCLE偏倚风险评价工具[9]。
1.5 统计分析
采用RevMan 5.4.1软件进行Meta分析。连续性变量采用标准化均数差（standardized mean difference，SMD）[10]为效应分析统计量，并提供其95%可信区间（confidence interval，CI）。纳入研究结果间的异质性采用χ2检验进行分析（检验水准为α=0.1），同时结合I2定量判断异质性大小。若各研究结果间无统计学异质性，则采用固定效应模型进行Meta分析；若各研究结果间存在统计学异质性，则进一步分析异质性来源，在排除明显临床异质性的影响后，采用随机效应模型进行Meta分析。Meta分析的水准设为α=0.05。明显的临床异质性采用亚组分析或敏感性分析等方法进行处理，或只行描述性分析。
2 结果
2.1 文献筛选流程及结果
初检共获得相关文献477篇，经逐层筛选，最终纳入9个研究[11-19]。文献筛选流程及结果见图1。
图1
文献筛选流程及结果
*所检索的数据库及检出文献数具体如下：CNKI（
2.2 纳入研究的基本特征及偏倚风险评价结果
表1
纳入研究的基本特征
表2
纳入研究的偏倚风险评价结果
2.3 Meta分析结果
2.3.1 始基卵泡数目
共6个研究[11-14,16,18]报道了UCMSCs移植对始基卵泡数目的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可提高始基卵泡数目［SMD=1.51，95%CI（0.80，2.22），P<0.000 1］（表3）。
表3
脐带间充质干细胞移植治疗卵巢早衰有效性的Meta分析结果
2.3.2 初级卵泡数目
共6个研究[11-14,16,18]报道了UCMSCs移植对初级卵泡数目的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可提高初级卵泡数目［SMD=1.43，95%CI（0.76，2.09），P<0.000 1］（表3）。
2.3.3 次级卵泡数目
共6个研究[11-14,16,18]报道了UCMSCs移植对次级卵泡数目的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可提高次级卵泡数目［SMD=1.39，95%CI（0.78，2.01），P<0.000 01］（表3）。
2.3.4 窦状卵泡数目
共5个研究[11-14,16]报道了UCMSCs移植对窦状卵泡数目的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可提高窦状卵泡数目［SMD=1.15，95%CI（0.49，1.82），P=0.000 7］（表3）。
2.3.5 E2浓度
共6个研究[11-13,15,17,19]报道了UCMSCs移植对E2浓度的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可提高E2浓度［SMD=2.38，95%CI（1.75，3.01），P<0.000 01］（表3）。
2.3.6 FSH浓度
共6个研究[11-13,15,17,19]报道了UCMSCs移植对FSH浓度的影响。随机效应模型Meta分析结果显示：UCMSCs移植可降低FSH浓度［SMD=−1.98，95%CI（−2.80，−1.17），P<0.000 01］（表3）。
2.3.7 亚组分析结果
由于纳入研究间存在较大异质性，故按移植部位、体重、移植时机和干细胞浓度进行亚组分析，结果显示大部分亚组的合并结果未发生方向性改变，但异质性仍较高（表3）。
3 讨论
POF是妇科常见病及疑难病，其发病率呈逐渐升高和年轻化趋势。POF发病原因及发病机理十分复杂，且尚未明确。最新研究发现，无论何种原因导致的POF，均伴有颗粒细胞凋亡[20]，说明颗粒细胞异常与POF有直接关系。许多基因发生突变也可能会导致POF的发生，例如脆性X智力障碍基因、抗苗勒管激素基因（anti Mullerian hormonegene，AMH）[21]、生长分化因子9基因、叉头框因子-1基因和LRPPRC基因等[22]。另外，线粒体功能异常也可能通过影响mtDNA的复制而导致POF[23]。
近年来采用间充质干细胞移植进行POF治疗并取得了一定效果。其机制可能与间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如VEGF、IGF-1、HGF、TGF-β和GM-CSF等，通过旁分泌途径参与卵巢颗粒细胞生长调节过程，抑制其凋亡有关[24]。此外，间充质干细胞促进损伤卵巢功能修复的机制可能是其通过腹腔血管进入血液循环到达损伤卵巢，利用其多向分化潜能[25]在体内选择性迁移和停留在机体受损伤的组织，通过MSCs表面表达的生长因子、细胞因子和细胞外基质受体驱使移植的间充质干细胞迁移到炎症部位[26]，分化发育成各级卵泡，分泌多种细胞外基质，促进损伤卵巢功能的修复。但目前采用UCMSCs移植治疗POF的临床研究仍然很少，因此本研究对相关动物实验进行Meta分析，为临床研究的开展提供间接依据。
本研究以各阶段卵泡（始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡及窦状卵泡）数目和E2、FSH浓度作为评价指标，并按照小鼠的体重、干细胞浓度、移植部位和移植时机进行亚组分析，Meta分析结果显示：UCMSCs移植治疗后，各级卵泡数目增加，E2浓度上升，FSH浓度降低，说明UCMSCs移植能修复卵巢组织，改善卵巢内分泌功能。其治疗机制可能为UCMSCs浓聚于卵巢局部，使得UCMSCs分泌的抗凋亡因子在局部形成较高水平，抑制颗粒细胞的凋亡[11]；UCMSCs中表达的血红素加氧酶-1通过激活JNK/Bcl-2信号通路，激活卵巢颗粒细胞自噬，增强其自身形成[27]；另外，UCMSCs还能分化为颗粒细胞和卵子细胞，促进卵巢表面上皮细胞增殖，重新修复白膜[28]，从而促进卵泡的形成，分泌性激素。亚组分析结果显示，尾静脉移植效果更好，可能因为其能使UCMSCs分布于全身多个器官，通过归巢效应[29]，到达损伤的卵巢部位进行修复，且尾静脉移植损伤更小，而卵巢表面覆盖着密集而交织的毛细血管网，卵巢注射时很容易导致其损伤出血，加剧卵巢炎症反应[19]。在移植时机方面，可能由于在造模早期，药物对鼠的卵巢组织损害较轻，故而移植时机≤造模后1天组的疗效明显优于移植时机>造模后1天组，提示早期治疗可能对POF更有效。
本研究的局限性：① 仅检索了中英文文献，存在符合纳入条件的其他语种文献未被纳入的可能，可能存在选择性偏倚；② 部分纳入研究未交待随机方法，所有研究均未描述分配隐藏和盲法实施，可能存在选择和实施偏倚；③ 纳入小鼠的基线特征水平不一致，导致部分结局指标可比性降低；④ 合并分析时存在较大异质性，亚组分析未能明显降低异质性，可能影响结果的准确性。
综上所述，当前证据显示，UCMSCs移植可修复小鼠卵巢组织，改善卵巢内分泌功能。受纳入研究数量和质量的限制，上述结论尚待更多高质量研究予以验证。
