外伤后癫痫(Post-traumatic epilepsy, PTE)是创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)后的一个主要的并发症, 但遗传变异在调节PTE发生中的作用尚不清楚。假设TBI诱导的炎症可能是导致癫痫发生的原因, 对白细胞介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)基因的遗传变异情况, 脑脊液和血清中IL-1β水平和IL-1β的脑脊液/血清比值能否预测TBI后PTE的发生进行了评估。共调查了256例中度至重度TBI后患PTE的成年白种人。对IL-1β标记和功能性单核苷酸多态性(SNPs)进行基因分型。对遗传变异性和PTE的发生进行评估。在调查患者中抽取一部分患者(n=59)在其外伤后1周内收集血清和脑脊液的IL-1β, 并评估它们与IL-1β基因变异及PTE的关系。临时配对IL-1β的脑脊液/血清比值以反映血清IL-1β水平对脑脊液IL-1β的影响。多变量分析显示随着时间推移, 高脑脊液/血清IL-1β比值与PTE风险增加有关(P=0.008)。rs1143634的多变量分析揭示了CT基因型与PTE风险增加有关(P=0.005)。CT基因型组其血清IL-1β水平较低(P=0.014), 脑脊液/血清IL-1β比值较高(P=0.093)。这是第一个揭示PTE风险中的IL-1β基因变异, 及TBI后IL-1β基因变异与血清IL-1β水平的关系和IL-1β比值与PTE风险的关系。根据这些发现, 提出基因和IL-1β比值与PTE的相关性可能归因于TBI恢复期的血脑屏障完整性的生物变异性包括。为进一步的研究提供了理论依据, 验证遗传变异性对TBI后IL-1β产生的影响, 评估造成脑脊液/血清IL-1β比值与PTE相关性的基因介导的信号传导机制, 及评估减少PTE的靶向IL-1β治疗。
引用本文： 徐秦岚, 杨华俊, 王群. 白细胞介素-1β与外伤后癫痫发生的联系——一个遗传学和生物标记物的队列研究. 癫痫杂志, 2015, 1(3): 261-271. doi: 10.7507/2096-0247.20150044 复制
外伤后癫痫(Post-traumatic epilepsy，PTE)在人群中占症状性癫痫的20%和所有癫痫的5%。在贯通性头外伤、硬膜下血肿(Subdural hematoma，SDH)或凹陷性颅骨骨折的患者中，超过20%患者出现了PTE。外伤至首次癫痫发作的时间差异很大，有报道在外伤后＞10年才出现临床发作的病例。PTE患者与无PTE患者相比，其死亡率增加，死亡年龄提前。PTE患者在身体、认知和心理社会方面也处于明显的劣势，这对结局也产生了不利的影响。尽管有证据否定有效的PET预防性治疗，创伤性脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)的患者仍常常接受长期的抗惊厥治疗，常导致有害的副作用，并且需要定期监测。因此，为癫痫发生和PTE风险预后确定可靠的生物标记物来对于TBI的治疗和恢复具有显著的临床意义。
越来越多的证据表明，急性痫性发作后神经胶质细胞的激活及随后细胞因子的产生在癫痫发生中起了重要的作用。有趣的是，在TBI后也观察到了类似的神经胶质细胞和细胞因子反应。在癫痫发生中研究最广泛的生物标记物之一就是白细胞介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)，IL-1β是一个促炎因子，在中枢神经系统由活化的小胶质细胞和星形胶质细胞产生，也在外周由巨噬细胞和其他免疫细胞产生。在TBI后，受损组织增加细胞外三磷酸腺苷，而三磷酸腺苷则介导中枢神经系统(Central nervous system，CNS)小胶质细胞活化及IL-1β加工和释放。已有研究报道，TBI后1年内IL-1β表达增加，小胶质细胞活化和细胞死亡，提示IL-1β可能是慢性炎症的一个有用的标记物，可促进和延续PTE风险。
TBI后IL-1β产生增加，通过可能导致癫痫发生的Ca2+、谷氨酸能和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)能机制提高中枢神经系统过度兴奋性和兴奋毒性。有趣的的是，在啮齿类动物模型中，给予外源性IL-1β可增加各种致痫药物诱发的癫痫发作。此外，通过IL-1β转化酶(ICE/caspase-1)抑制剂阻断IL-1β的生物合成途径可导致化学诱导的首次癫痫发作的时间延迟，频率减少。对热性惊厥(FS)和颞叶癫痫(TLE)人群中血浆和脑脊液IL-1β水平的研究显示了多种不同的结果，但的确暗示了IL-1β与病理学有关。然而，目前尚没有研究来评估IL-1β水平与TBI后癫痫发生和PTE风险之间的相关性。
癫痫相关的遗传变异是另一种预测PTE发生的可行的生物标记物途径。先前研究已经确定了多个单核苷酸多态性(SNPs)与TBI后与癫痫发作的风险增加有关。编码IL-1β的基因(IL-1β)位于2号染色体长臂的2q12-13区域。1个普遍研究的IL-1β单核苷酸多态性，rs16944，位于启动子区域的-511位点，被报道可增加TLE常见类型的易感性。有趣的是，在这个相同SNP中的变异使脂多糖(LPS)诱导产生的IL-1β增加了2~3倍。基于IL-1β在炎症和非外伤性癫痫风险中的已知作用，本研究的目的是为了确定在TBI人群中IL-1β基因的遗传变异和脑脊液相对于血清中IL-1β生物标记物的概况是否与PTE风险有关。
方法
1 研究设计和受试者
本研究经匹兹堡大学机构审查委员会批准，并通过伦理审查委员会许可。本研究对单学术医学中心354例受试者进行筛选，作为评估遗传学和生物标记物对TBI患者结局影响的大型研究的一部分。基于从数据库获得的单核苷酸多态性(dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)的等位基因频率信息，本纵向回顾性队列研究仅限于白种人，并且有32例受试者从分析中被排除。受试者均在18~70岁，有中度到重度的TBI[格拉斯哥昏迷(GCS)评分≤12]，有阳性CT结果明确TBI，并且TBI前无癫痫发作史。有13例受试者GCS＞12，但根据阳性的CT结果将其纳入了中度TBI组。6例受试者筛选出TBI前有癫痫发作，将其排除。剩下的受试者(n=316)在种族、年龄、病史和损伤上符合入组标准，并根据PTE分析的标准进行进一步筛选。
2 IL-1β遗传学人群
首次癫痫发作的时间是我们感兴趣的主要变量，将队列进一步限制为接近PTE的标准。PTE定义为外伤第1周以后的首次癫痫发作。因此，外伤后1周内出现首次发作(n=20)或死亡(n=40)的病例被排除。3例死亡病例在死亡前有PTE的记录，因此将其纳入分析。最终队列由256例受试者组成。PTE发生的时间过程可因死亡状态不同而多种多样，且能影响与PTE状态以及首次癫痫发作时间的遗传学关系。除应用Kaplan-Meier(KM)方法评估首次癫痫发作时间之外，还通过双变量类别分析，去除外伤1周后死亡但无癫痫发作的受试者，对死亡状态进行处理，剩余206例幸存者。死亡时间通过多变量模型应用Cox回归分析处理(见统计学方法)。
3 IL-1β水平人群
该组纳入IL-1β遗传学人群中59例受试者，这些受试者均在外伤后1周内有≥2份暂时性匹配的脑脊液与血清样本可用于IL-1β定量(血清和脑脊液样本量，n=143)。与IL-1β遗传学队列类似，去除1周后死亡但无发作的受试者，剩余幸存者46例进行IL-1β与PTE相关性的双变量分析。在相关的多变量人群分析中对死亡时间进行调整。
另外，对健康成人对照组血清和脑脊液IL-1β水平进行了评估。在健康对照组中，脑脊液通过腰椎穿刺获得(n=13)，血清通过静脉穿刺获得(n=11)。对照组年龄19~60岁，既往和目前无血液系统疾病、脑损伤及神经系统疾病病史。排除目前怀孕、服用口服避孕药或使用激素替代治疗的女性。
4 重度TBI的重症监护管理
10年间将已评估的受试者收入神经创伤重症监护室，并按照重型颅脑损伤的管理指南(Guidelines for the management of severe head injury)进行治疗。标准治疗包括最初的脑室外引流置管，中心静脉和动脉置管。必要时对占位性病变行外科手术减压。对临床上可疑有癫痫活动的患者间断行脑电图(EEG)检测。按照之前发表的研究，重度TBI患者在外伤后第1周给予PTE预防性治疗。
5 人口统计学和损伤数据
对患者的人口统计学变量包括年龄和性别进行记录。回顾医疗记录和匹兹堡大学医学中心(UPMC)创伤登记数据，提取有关GCS评分、损伤机制、凹陷性颅骨骨折、硬膜下血肿(Subdural hematoma，SDH)、创伤严重程度评分(ISS)、孤立颅脑损伤状态(Isolated head injury，IHI)和患者的住院时间的临床信息。对外伤后第一个24 h最高的GCS评分进行记录。凹陷性颅骨骨折和/或SDH根据影像学报告确定。仅当医疗记录中记录用于癫痫预防时对有关抗癫痫药物(AEDs)的信息进行记录。
ISS和IHI根据简明损伤量表(AIS)评分系统来确定，该评分系统根据特定损伤后的存活能力确定其损伤的严重程度。AIS将身体某个部位的损伤程度分成1~6，6代表损伤致命的几率最高。ISS是衡量大脑结构损伤严重程度的方法，定义为3个受累最严重的身体区域的得分的平方和。IHI状态基于头部AIS得分来评定，≥3考虑为重度TBI。所有受试者的头部AIS评分均≥3。孤立TBI(IHI)定义为头部AIS评分≥3而除头部外的3个损伤最重的身体区域的AIS评分均＜3。非孤立性TBI定义为头部AIS评分≥3，除头部外至少有一个身体区域的AIS评分≥3。
6 癫痫发作的评估
对电子医疗记录中关于PTE和首次癫痫发作时间的信息进行回顾。从患者的病史和查体，急救车、急诊室记录，EEG报告及出院/转院小结和住院/门诊的病程记录来确定患者是否患PTE。所有在外伤后第一周内提及癫痫发作、惊厥或癫痫持续状态的均考虑为PTE的证据。PTE随访至外伤后3年停止，在随访期间所有受试者的PTE状态均完全确定。在本研究中，受试者之间EEG采集和正常护理标准之间无差异。
7 DNA提取，SNP选择和基因分型
从每例受试者的全血和脑脊液两个来源之一中提取DNA。全血收集在乙二胺四乙酸(EDTA)真空管中，加工提取暗黄色表层，用简易盐析法提取DNA。脑脊液通过被动引流收集，应用用于从体液中提取的QIAamp DNA提取法提取白细胞中的DNA(Qiagen corporation venlo, 荷兰，芬洛Qiagen公司)。标记单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)中的rs1143633, rs1143634和rs3136558，其中至少20%的较小等位基因频率是基于人类基因组单体型图数据库(HapMap database)(International HapMap Project国际单体型测绘计划：http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)和核苷酸多态性数据库(dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)数据筛选出来的。基于build 36中的数据，这些tSNPs捕获到了基因变异，包括从5′游至启动子区的1 000个碱基。rs1143634也被认为是一个功能性SNP。此外，功能性SNPs的rs1143627和rs16944也被筛选用于基因分型。
基因分型通过应用TaqMan等位基因分辨技术和市售的5′外切酶Assay-on-Demand TaqMan assays(Applied biosystems incorporated foster city, CA, USA加州福斯特城应用生物系统公司)来完成。运用AB17000和SDS 2.0软件(Applied biosystems，应用生物系统公司)进行基因扩增和基因型的分配。每一个SNP均进行双盲基因型分配，并应用原始数据或重新进行基因分型来处理每个差异。哈迪温伯格平衡验证了所有SNPs，表明基因型分布在预期的比例。每个SNP调用比值＞95%。
8 脑脊液和血清IL-1β收集和定量
脑脊液样本在外伤后前6 d每隔12 h收集一次，血清每天收集一次。脑脊液样本从脑室外引流(EVD)收集袋中获得，血液样本通过外周静脉穿刺获取。然后收集的样本经离心、分装，并保存于-80℃中，直至进行化验。用Luminex微珠阵列技术(Milliplex Human High Sensitivity 9-plex; Millipore Billerica, MA, USA)来检测脑脊液和血清中的IL-1β水平。对可用的脑脊液和血清样本进行IL-1β水平检测。IL-1β测定的方差系数＜10%。
9 统计学分析
运用SPSS20.0版本(Chicago, IL, USA，伊利诺伊州芝加哥市)和SAS(Cary, NC, USA，北卡罗来纳州卡瑞镇)进行统计学分析。汇总统计平均数、中位数、频率及均数的标准差(SEM)。运用独立样本t检验，合适时应用曼-惠特尼检验来评估PTE组和连续变量间的差异。运用χ2分析，合适时应用Fisher精确检验来评估PTE与分类变量包括IL-1βSNP基因型间的差异。
为在PTE的环境下分析血清和脑脊液IL-1β，外伤后第一周根据每天的IL-1β水平计算出周平均值。每日数值＞3个标准差高于/低于总体均值被认为是异常值，排除在分析之外(脑脊液n=8，血清n=7)。考虑到外周单核细胞和中枢神经系统小胶质细胞均能诱导激活巨噬细胞，我们假设中枢神经系统IL-1β水平代表中枢神经系统生成的和外周生成转运至中枢神经系统的IL-1β的总和。为了表达血清对CSF中IL-1β水平的相对贡献，通过划分暂时匹配的CSF/血清样本计算IL-1β比值，而后每日比值取平均值获得IL-1β的周比值。为确定基因和其它变量与细胞因子比例间的关系，通过多变量模型对显著的双变量相关性(P＜0.05)进行分析。
对于患PTE的受试者，运用Kaplan-meier生存分析，通过候选SNP变异来检验首次癫痫发作时间(8 d~3年)，并调整死亡时间。运用Cox比例风险模型检验IL-1β比值和在PTE风险方面显著不同基因型的SNPs。在Cox模型中，首次癫痫发作时间8 d~3年为独立变量，PTE发生率为感兴趣的事件。多变量Cox模型检验IL-1β的SNPs并对在双变量分析中与PTE状态有显著相关性的协变量进行调整。Cox模型对GCS和凹陷性颅骨骨折进行调整，考虑到它们明确与TBI严重程度和PTE有关。
结果
1 人群描述
1.1 IL-1β遗传学人群
共有256例患中度至重度TBI且基因型信息符合PTE分析标准的成年患者。接近81.6%的受试者为男性，18.4%为女性。平均年龄±标准差为(35.0±0.93)岁。GCS评分中位数为6，重症监护的住院时间(LOS)平均数为(22.5±0.68) d。最常见的损伤机制包括汽车事故(50.4%)，摩托车事故和跌落(11.3%)。249例(97.3%)给予AEDs来预防癫痫发作，其中42例发生PTE(16.4%)。确诊为PTE的患者，其中51.2%患者至少有一份临床发作时的EEG；34.1%患者在急性期治疗期间至少有一份EEG。70.7%患者在外伤后的1周~3年访视期间至少有一份EEG。
表 1提供了基于PTE状态的人群分类列表。ISS评分较低的患者更易患PTE (P=0.026)。IHI状态(P=0.033)和SDH (P=0.002)也与PTE有关。死亡率与PTE显著相关，死亡患者的PTE发生率较低。因此创建了一个死亡率调整后的PTE人群(n=206)。未调整和死亡率调整后的PTE人群在损伤或人口统计学信息方面无明显差异(数据未列出)。
表1
人口统计数据表
1.2 IL-1β水平人群
有59例中度至重度TBI及具急性细胞因子信息的患者，评估其IL-1β比值和PTE的影响因素(表 1)。相比于那些更严重的颅外创伤，IHI状态与较高水平的IL-1β相关(P=0.047)。SDH也和较高水平的IL-1β比值有关(P=0.037)。较低水平的血清IL-1β与IHI状态(P=0.007)及SDH (P=0.022)均具有相关性。较高的ISS和较高水平的血清IL-1β具有相关性(P=0.006)。在存活者中PTE患者(n=46)的IL-1β水平和比值比较在损伤和人口统计学信息方面未显示出显著差异(数据未列出)。
1.3 健康对照人群
健康对照人群成员均为白种人，其中61.5%为男性(n=8)。平均年龄为(24.62±11.16)岁。关于年龄和性别分布的敏感性分析显示TBI与对照队列之间有显著差异。鉴于有报道称TBI后的炎症反应可能有性别差异，我们对对照组内是否存在性别差异进行评估，发现IL-1β在血清(女性0.361±0.230，男性0.072±0.036；P=0.257)，CSF(女性0.030±0.005，男性0.026±0.003；P=0.171)，和其比值(女性0.400±0.667，男性0.441±0.263；P=0.257)中均无显著差异。在对照组内，年龄与IL-1β的血清，CSF，或比值水平无明显相关(P=0.686，0.733，0.788)。
2 急性期IL-1β水平
对TBI存活者组和健康对照组的CSF和血清IL-1β的日平均值和周平均值进行比较。TBI组中CSF IL-1β水平的日平均值和周平均值高于对照组(所有比较中均为P≤0.001)(图 1a)；外伤后第3天的CSF/血清IL-1β比值更高(P=0.025)，且周平均值水平相比于对照组有更高的趋势(P=0.070)(图 1b)；血清IL-1β水平与对照组无差异(图 1c)。IL-1β的血清水平(女性0.377±0.543，男性0.550±1.719；P=0.722)，CSF水平(女性0.088±0.109，男性0.123±0.167；P=0.454)，和比值(女性0.766±0.565，男性1.699±3.771；P=0.589)的周平均值在性别上无明显差异。
图1
存活者(n=46)中IL-1β水平 a 与健康对照(n=13)相比较的CSF中IL-1β水平(各时间点P＜0.001)；b 与健康对照(n=11)相比较的CSF/血清IL-1β比值(第3日P=0.025, 周平均P=0.070);c 与健康对照(n)=11相比较的血清IL-1β比较(所有比较P＞0.05)
3 急性期IL-1β水平和PTE发生
在存活者中，PTE患者相比于无PTE者其周IL-1β比值更高(PTE=3.794±2.274；无PTE=0.8207±0.1495；P=0.020)，见图 2a。血清IL-1β在PTE组更低[PTE=(0.200 7±0.129 0) pg/mL；无PTE=(0.723 9±0.3501) pg/mL；P=0.016], 见图 2b。PTE组中的CSF IL-1β水平无差异(PTE=0.1964±0.0901；无PTE=0.0876±0.0159；P=0.864)，见图 2c。表 1显示了IL-1β水平人群的Cox模型，并对死亡时间、ISS、GCS、SDH和凹陷性颅骨骨折进行调整，显示随着时间的推移，高水平的IL-1β比值与PTE风险升高相关[风险比=1.341；可信区间(CI)(1.081-1.665)；P=0.008]，见表 3，图 3a。类似的Cox模型显示血清IL-1β和PTE风险无相关性(数据未列出)。
图2
存活者(n=46)PTE状态在外伤后第一周平均IL-1β水平 PET的CSF/血清IL-1β比值(P=0.020)；b PTE的血清IL-1β水平(P=0.016);c PTE的CSF IL-1β水平(P＞0.05)
表3
Cox比例风险
图3
Cox比例风险累积PTE风险 a 基于平均CSF/血清IL-1β比值并针对死亡时间(以日记)、年龄、性别、ISS、GCS、SDH及凹陷性颅骨骨折进行调整(P=0.008)的Cox比例风险累积PET风险；b 针对死亡时间(以日记)、年龄、性别、ISS、GCS、SDH及凹陷性颅骨骨折进行调整的rs1143634基因型(P=0.005)的Cox比例风险累积PTE风险
4 rs1143634 S与PTE发生的相关性
表 2描述了所有SNP等位基因频率和入组的所有人群中死亡率调整后亚组的双变量相关性。不管是否进行死亡率调整，PTE和rs1143633，rs3136558，rs1143627，rs16944之间无明显双变量相关性。但是，双变量评估显示rs1143634和PTE风险相关。罹患PTE的患者中，17.6%为CC基因型，47.7%为CT基因型，无TT基因型(P=0.008)。与之前的研究一致，位于rs1143634上的TT基因型患者(n=13)只占所有患者中的很小的百分比。分组基因型分析显示杂合子(CT)相比纯合子患PTE的风险更大(P=0.005)。进行死亡率调整后的Kaplan-Meier生存分析显示杂合子的首次癫痫发作时间比纯合子更早[CT平均值为854.37 d，CI(759.28-949.46)；CC+TT平均值为1010.51 d，CI(959.40-1061.62)；P=0.006]。Cox比例风险模型针对死亡时间、年龄、性别、GCS、ISS、SDH和凹陷性颅骨骨折进行了调整，显示CT基因型相比纯合子与PTE风险增加相关[风险比=2.845；CI (1.372-5.900)；P=0.005，见表 3，图 3b。
表2
双变量IL-1β标记SNP结果
5 rs1143634和IL-1β水平的相关性
在死亡率调整后的IL-1β水平人群中，rs1143633、rs1143627、rs3136558和rs16944的受试者IL-1β比值，血清或CSF水平无明显双变量相关性。血清IL-1β水平有统计学差异(P=0.014)，且基于rs1143634基因型，IL-1β比值显示出一个趋势(P=0.093)。分组基因型分析显示杂合子比纯合子的血清IL-1β水平更低［CT平均值=(0.1571±0.0552) pg/mL；CC+TT平均值=(0.9661±0.5048) pg/mL；P=0.009]。杂合子比纯合子的pIL-1β比值也更高[CT平均值=(2.615±1.583)；CC+TT平均值=(0.8251±0.2094)；P=0.062]。rs3136558倾向于和血清IL-1β水平相关(P=0.058)，但进一步分析显示在我们的人群中rs3136558和rs1143634间存在高度的连锁不平衡(P≤0.001)。
讨论
PTE是TBI的主要并发症，导致伤残增加，且患者需长期AEDs治疗。PTE和癫痫发生的潜在机制尚不清楚，尽管PTE有特征性的临床危险因素，但并非所有存在这些危险因素的患者都发生PTE。在某些个体中，遗传变异和TBI相关的生物反应可解释增加的PTE发病率。最新的癫痫基准研究进展报告基于最新发表的研究结果将IL-1β列为癫痫潜在的生物标记物。我们实验室此前的工作显示每日服用左乙拉西坦，一种广谱的AED，可减少实验性TBI动物局部脑组织IL-1β的表达，这可能是其在TBI中抗癫痫作用潜在的原因。该观察结果连同其它显示IL-1β和非外伤性癫痫关系的资料，为研究IL-1β和PTE的发生提供了理论基础。
IL-1β于中枢神经系统和外周产生。在健康个体中，CNS IL-1β水平很低，且有助于诸如记忆形成和睡眠等生理过程。而TBI与IL-1β表达增加相关，这种表达增加可在外伤后持续数月。IL-1β水平升高与早期神经元死亡和兴奋性毒性有关，提示了在TBI恢复期IL-1β调控的重要性。基于这些研究结果及已知的IL-1β诱发癫痫的效应，我们假设TBI引起的早期IL-1β水平变化可能与PTE产生相关。鉴于TBI后血脑屏障(BBB)破坏和外周炎症反应，以及CSF IL-1β水平很可能由CNS和外周产生的总产物，我们也发现CSF/血清IL-1β比值可作为反映血清IL-1β对CSF IL-1β水平贡献的指标尽管我们的数据显示PTE组CSF IL-1β水平升高，但是相比与对照组，PTE组和无PTE组的CSF IL-1β平均值均无明显差异。血清IL-1β水平也与对照组无明显差异。但是，PTE组血清IL-1β水平显著低于无PTE组，表明两组间血清IL-1β的相对差值转移到了CNS中。有意思的是，外伤后第1周高CSF/血清IL-1β比值的患者其PTE风险显著升高，表明尽管TBI后CSF IL-1β绝对值升高，但外周的IL-1β的相对贡献是最终PTE发生最为敏感的测量指标。这个相关性很有趣，并且对于早期筛查有一定意义，但仍需要开展进一步工作来确定血清IL-1β和比值的关系是否/如何反映有关持续的外周炎症状态，第1年内中度至重度损伤临床人群的特点，可能在长期过程中导致癫痫发作和PTE发生。多变量Cox模型显示只有IL-1β比值与PTE风险显著相关，表明CSF/血清比值似乎增加了外周炎症对CNS病理的贡献的特性。
有意思的是，在一报道中提到II型IL-1β转运蛋白可通过涉及脑微血管内皮细胞的体外途径穿过BBB将IL-1β由血液转运至脑。尽管临床TBI研究表明，某些细胞因子顺脑到血液的转运梯度进行转运，但类似的研究并不能确定这样的IL-1β转运梯度。我们的结果显示相对于CSF，在对IL-1β血液到脑梯度有提示意义的IL-1β水平的队列中存在高血清IL-1β浓度(图 1)。此外，PTE组中的高CSF/血清比值也支持IL-1β血液到脑转运的假设(图 2)。这一发现，与rs1143634和血清水平及比值的关系，也表明遗传变异影响IL-1β转运至CNS能力，可作为进一步探索IL-1β病理学如何影响PTE风险的合理的生物学机制。
但目前仍需要进一步研究来确证为何TBI后高IL-1β比例可以预测外伤后几个月到几年时间里PTE的发生。增强的急性炎症反应可能可以预测可导致癫痫和PTE发生的长期慢性(CNS和外周)炎症及BBB功能障碍。要强调的是，血清细胞因子水平在中度至重度TBI后其水平升高至少维持1年，可能继而导致BBB功能障碍和持续的CNS炎症。在某些细胞中，包括激活的小胶质细胞，IL-1β可诱导IL-1βmRNA产生，导致一个积极的反馈系统使CNS炎症持续存在。有意思的是，临床影像学研究表明在TBI后小胶质细胞的激活可持续数年，同时伴随进行性白质变性。此外，研究表明TBI后多达1年的时间里都存在进行性细胞死亡，提示与细胞凋亡相关的细胞外ATP的升高可能慢性激活了产生IL-1β所需的炎症小体。
PTE组中高急性期CSF/血清IL-1β比值可能预示着多种与慢性炎症有关的长期生理变化，这些变化可促进癫痫发作。脑室内IL-1β可激活下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感神经系统，减少外周细胞的免疫反应，抑制巨噬细胞分泌IL-1β。因此，正如本研究中报道，PTE患者中该神经免疫调节系统急性过度活化，导致血清IL-1β水平降低。研究显示IL-1β升高和/或IL-1β受体拮抗剂减少(IL-1α)明显的改变了化学诱发癫痫发作的频率、持续时间和发作阈值。有关点燃模型研究中癫痫发作过程延迟抑制了神经生长因子(NGF)。值得注意的是，IL-1β同时上调体外和体内的NGF，在TBI大鼠模型中应用IL-1α抑制了NGF-介导的可塑性。但仍需要进一步工作来辨别CSF/血清IL-1β比值是否能反应这些生理状态的改变。
IL-1β基因变异分析显示了rs1143634基因型，PTE，血清IL-1β水平和CSF/血清IL-1β比值的关系。rs1143634上为CT基因型的患者PTE风险明显升高，且首次癫痫发作的时间明显缩短(平均缩短5个月)，表明局部的变异促使了癫痫发生。尽管该SNP的最小等位基因频率(MAF)为0.25，但仅有13例受试者为TT纯合子。有意思的是，这几位受试者均未患PTE。虽然TT组样本量较小，可能受样本偏差影响，但数据提示了TT纯合子对PTE起相对保护作用，而CT杂合子则为独特的风险组。而且，将来的验证研究不太可能产生剂量反应与PTE风险的关系。
杂合子关联分析出现编码膜受体的基因变异，可导致多重作用影响有趣的表现型(如受体蛋白异二聚体对比二聚体膜运输的差别效应)。我们之前的研究报道与PTE有关的rs10920573杂合子位于ADORA1基因位点。该基因虽然不是膜受体，但可推测不同的IL-1β亚型混合的细胞外环境，理论上对于靶受体结合、激活和导致PTE风险增加的炎症途径的下游信号可有不同的作用。考虑到rs1143634上的杂合子也和血清IL-1β减少有关，IL-1β可影响BBB渗透性，因此与IL-1β生理机制相关的位于rs1143634上的杂合子可不同程度促进血清IL-1β转运至CSF。IL-1β调节其表达和BBB载体转运蛋白如ATP结合盒式(ABC)转运蛋白的流出功能，而在TBI中基因变异可能对于IL-1β水平和其他分子如皮质醇有差别效应。值得注意的是，ABC转运蛋白也促进了激活的巨噬细胞释放IL-1β，该作用可能与慢性激活的小胶质细胞12释放IL-1β导致PTE发生特别相关。最后，TBI后主要的普遍的表观遗传修饰被人们所知，鉴于之前有关IL-1β启动子如何产生表观遗传变异的报告，这可能是进一步研究rs1143634与PTE风险增加的相关机制的另一领域。
rs1143634的SNP位于IL-1β基因的外显子5的编码区域，但其功能仍然是有争议的。研究表明等位基因T与IL-1β产生增加有关，而其他人发现IL-1β的释放并无差异。rs1143634标记了2号染色体上IL-1β基因的将近1kb的区域，其中该区域也包括错义的SNPs rs141525736，rs139843362和rs114640380(HapMap phase 3；hapmap.org)。但是这些SNPs并不是高度变异的，且尚无报道其相关功能文献。此外，目前尚不清楚LD衰减位于rs1143634标记的哪个区域，因此代表rs1143634的DNA区额外的基因分型对更好的了解功能影响的变化包括该区域的杂合性可能有一定帮助。
ISS，IHI和SDH均与PTE有关。若患者ISS评分较低，或患有IHI、SDH更有可能患PTE。由于ISS是一种总体的解剖损伤严重程度评分，因此IHI患者同时ISS评分较低也不足为奇。但根据多变量分析，ISS或IHI并不是主要的PTE预测因素。我们的结果也支持先前显示SDH能增加PTE风险的研究。
尽管有了IL-1β与PTE之间联系的一些有前景的发现，也必须考虑到一些局限性。病历资料摘要很难准确评估癫痫复发和PTE的严重性。因此，我们研究中没有追踪癫痫复发。此外，插管和镇静的受试者可能错过其外伤1周以后的亚临床发作或无抽搐发作。且本次研究的样本只包含中度至重度损伤的白种人，从而限制了不同种族背景人群的普遍性。此外，总体的样本大小适合遗传相关的研究，但生物标志物和基因分析的人群是目前所能获得的最大的中度至重度TBI人群。虽然如此，就目前所知，这是第一个研究报道提示血清IL-1β对CSF IL-1β水平有贡献，以及PTE与IL-1β基因变异有关。但仍需要进一步在多个独立的群体中来重复这些发现以更好的理解与这些关系相关的机制。这些研究结果如果被证实，可能激起进一步的研究来检验靶向IL-1β预防和治疗PTE；也可支持未来工作配合EEG筛查和临床护理途径评估遗传筛查的实用性，通过筛查进行风险分层的方式来治疗和预防PTE。另外，探索基因变异和TBI引起的炎症反应有关的其它生物标志物水平与PTE的发生也是十分必要的。
外伤后癫痫(Post-traumatic epilepsy，PTE)在人群中占症状性癫痫的20%和所有癫痫的5%。在贯通性头外伤、硬膜下血肿(Subdural hematoma，SDH)或凹陷性颅骨骨折的患者中，超过20%患者出现了PTE。外伤至首次癫痫发作的时间差异很大，有报道在外伤后＞10年才出现临床发作的病例。PTE患者与无PTE患者相比，其死亡率增加，死亡年龄提前。PTE患者在身体、认知和心理社会方面也处于明显的劣势，这对结局也产生了不利的影响。尽管有证据否定有效的PET预防性治疗，创伤性脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)的患者仍常常接受长期的抗惊厥治疗，常导致有害的副作用，并且需要定期监测。因此，为癫痫发生和PTE风险预后确定可靠的生物标记物来对于TBI的治疗和恢复具有显著的临床意义。
越来越多的证据表明，急性痫性发作后神经胶质细胞的激活及随后细胞因子的产生在癫痫发生中起了重要的作用。有趣的是，在TBI后也观察到了类似的神经胶质细胞和细胞因子反应。在癫痫发生中研究最广泛的生物标记物之一就是白细胞介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)，IL-1β是一个促炎因子，在中枢神经系统由活化的小胶质细胞和星形胶质细胞产生，也在外周由巨噬细胞和其他免疫细胞产生。在TBI后，受损组织增加细胞外三磷酸腺苷，而三磷酸腺苷则介导中枢神经系统(Central nervous system，CNS)小胶质细胞活化及IL-1β加工和释放。已有研究报道，TBI后1年内IL-1β表达增加，小胶质细胞活化和细胞死亡，提示IL-1β可能是慢性炎症的一个有用的标记物，可促进和延续PTE风险。
TBI后IL-1β产生增加，通过可能导致癫痫发生的Ca2+、谷氨酸能和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)能机制提高中枢神经系统过度兴奋性和兴奋毒性。有趣的的是，在啮齿类动物模型中，给予外源性IL-1β可增加各种致痫药物诱发的癫痫发作。此外，通过IL-1β转化酶(ICE/caspase-1)抑制剂阻断IL-1β的生物合成途径可导致化学诱导的首次癫痫发作的时间延迟，频率减少。对热性惊厥(FS)和颞叶癫痫(TLE)人群中血浆和脑脊液IL-1β水平的研究显示了多种不同的结果，但的确暗示了IL-1β与病理学有关。然而，目前尚没有研究来评估IL-1β水平与TBI后癫痫发生和PTE风险之间的相关性。
癫痫相关的遗传变异是另一种预测PTE发生的可行的生物标记物途径。先前研究已经确定了多个单核苷酸多态性(SNPs)与TBI后与癫痫发作的风险增加有关。编码IL-1β的基因(IL-1β)位于2号染色体长臂的2q12-13区域。1个普遍研究的IL-1β单核苷酸多态性，rs16944，位于启动子区域的-511位点，被报道可增加TLE常见类型的易感性。有趣的是，在这个相同SNP中的变异使脂多糖(LPS)诱导产生的IL-1β增加了2~3倍。基于IL-1β在炎症和非外伤性癫痫风险中的已知作用，本研究的目的是为了确定在TBI人群中IL-1β基因的遗传变异和脑脊液相对于血清中IL-1β生物标记物的概况是否与PTE风险有关。
方法
1 研究设计和受试者
本研究经匹兹堡大学机构审查委员会批准，并通过伦理审查委员会许可。本研究对单学术医学中心354例受试者进行筛选，作为评估遗传学和生物标记物对TBI患者结局影响的大型研究的一部分。基于从数据库获得的单核苷酸多态性(dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)的等位基因频率信息，本纵向回顾性队列研究仅限于白种人，并且有32例受试者从分析中被排除。受试者均在18~70岁，有中度到重度的TBI[格拉斯哥昏迷(GCS)评分≤12]，有阳性CT结果明确TBI，并且TBI前无癫痫发作史。有13例受试者GCS＞12，但根据阳性的CT结果将其纳入了中度TBI组。6例受试者筛选出TBI前有癫痫发作，将其排除。剩下的受试者(n=316)在种族、年龄、病史和损伤上符合入组标准，并根据PTE分析的标准进行进一步筛选。
2 IL-1β遗传学人群
首次癫痫发作的时间是我们感兴趣的主要变量，将队列进一步限制为接近PTE的标准。PTE定义为外伤第1周以后的首次癫痫发作。因此，外伤后1周内出现首次发作(n=20)或死亡(n=40)的病例被排除。3例死亡病例在死亡前有PTE的记录，因此将其纳入分析。最终队列由256例受试者组成。PTE发生的时间过程可因死亡状态不同而多种多样，且能影响与PTE状态以及首次癫痫发作时间的遗传学关系。除应用Kaplan-Meier(KM)方法评估首次癫痫发作时间之外，还通过双变量类别分析，去除外伤1周后死亡但无癫痫发作的受试者，对死亡状态进行处理，剩余206例幸存者。死亡时间通过多变量模型应用Cox回归分析处理(见统计学方法)。
3 IL-1β水平人群
该组纳入IL-1β遗传学人群中59例受试者，这些受试者均在外伤后1周内有≥2份暂时性匹配的脑脊液与血清样本可用于IL-1β定量(血清和脑脊液样本量，n=143)。与IL-1β遗传学队列类似，去除1周后死亡但无发作的受试者，剩余幸存者46例进行IL-1β与PTE相关性的双变量分析。在相关的多变量人群分析中对死亡时间进行调整。
另外，对健康成人对照组血清和脑脊液IL-1β水平进行了评估。在健康对照组中，脑脊液通过腰椎穿刺获得(n=13)，血清通过静脉穿刺获得(n=11)。对照组年龄19~60岁，既往和目前无血液系统疾病、脑损伤及神经系统疾病病史。排除目前怀孕、服用口服避孕药或使用激素替代治疗的女性。
4 重度TBI的重症监护管理
10年间将已评估的受试者收入神经创伤重症监护室，并按照重型颅脑损伤的管理指南(Guidelines for the management of severe head injury)进行治疗。标准治疗包括最初的脑室外引流置管，中心静脉和动脉置管。必要时对占位性病变行外科手术减压。对临床上可疑有癫痫活动的患者间断行脑电图(EEG)检测。按照之前发表的研究，重度TBI患者在外伤后第1周给予PTE预防性治疗。
5 人口统计学和损伤数据
对患者的人口统计学变量包括年龄和性别进行记录。回顾医疗记录和匹兹堡大学医学中心(UPMC)创伤登记数据，提取有关GCS评分、损伤机制、凹陷性颅骨骨折、硬膜下血肿(Subdural hematoma，SDH)、创伤严重程度评分(ISS)、孤立颅脑损伤状态(Isolated head injury，IHI)和患者的住院时间的临床信息。对外伤后第一个24 h最高的GCS评分进行记录。凹陷性颅骨骨折和/或SDH根据影像学报告确定。仅当医疗记录中记录用于癫痫预防时对有关抗癫痫药物(AEDs)的信息进行记录。
ISS和IHI根据简明损伤量表(AIS)评分系统来确定，该评分系统根据特定损伤后的存活能力确定其损伤的严重程度。AIS将身体某个部位的损伤程度分成1~6，6代表损伤致命的几率最高。ISS是衡量大脑结构损伤严重程度的方法，定义为3个受累最严重的身体区域的得分的平方和。IHI状态基于头部AIS得分来评定，≥3考虑为重度TBI。所有受试者的头部AIS评分均≥3。孤立TBI(IHI)定义为头部AIS评分≥3而除头部外的3个损伤最重的身体区域的AIS评分均＜3。非孤立性TBI定义为头部AIS评分≥3，除头部外至少有一个身体区域的AIS评分≥3。
6 癫痫发作的评估
对电子医疗记录中关于PTE和首次癫痫发作时间的信息进行回顾。从患者的病史和查体，急救车、急诊室记录，EEG报告及出院/转院小结和住院/门诊的病程记录来确定患者是否患PTE。所有在外伤后第一周内提及癫痫发作、惊厥或癫痫持续状态的均考虑为PTE的证据。PTE随访至外伤后3年停止，在随访期间所有受试者的PTE状态均完全确定。在本研究中，受试者之间EEG采集和正常护理标准之间无差异。
7 DNA提取，SNP选择和基因分型
从每例受试者的全血和脑脊液两个来源之一中提取DNA。全血收集在乙二胺四乙酸(EDTA)真空管中，加工提取暗黄色表层，用简易盐析法提取DNA。脑脊液通过被动引流收集，应用用于从体液中提取的QIAamp DNA提取法提取白细胞中的DNA(Qiagen corporation venlo, 荷兰，芬洛Qiagen公司)。标记单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)中的rs1143633, rs1143634和rs3136558，其中至少20%的较小等位基因频率是基于人类基因组单体型图数据库(HapMap database)(International HapMap Project国际单体型测绘计划：http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)和核苷酸多态性数据库(dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)数据筛选出来的。基于build 36中的数据，这些tSNPs捕获到了基因变异，包括从5′游至启动子区的1 000个碱基。rs1143634也被认为是一个功能性SNP。此外，功能性SNPs的rs1143627和rs16944也被筛选用于基因分型。
基因分型通过应用TaqMan等位基因分辨技术和市售的5′外切酶Assay-on-Demand TaqMan assays(Applied biosystems incorporated foster city, CA, USA加州福斯特城应用生物系统公司)来完成。运用AB17000和SDS 2.0软件(Applied biosystems，应用生物系统公司)进行基因扩增和基因型的分配。每一个SNP均进行双盲基因型分配，并应用原始数据或重新进行基因分型来处理每个差异。哈迪温伯格平衡验证了所有SNPs，表明基因型分布在预期的比例。每个SNP调用比值＞95%。
8 脑脊液和血清IL-1β收集和定量
脑脊液样本在外伤后前6 d每隔12 h收集一次，血清每天收集一次。脑脊液样本从脑室外引流(EVD)收集袋中获得，血液样本通过外周静脉穿刺获取。然后收集的样本经离心、分装，并保存于-80℃中，直至进行化验。用Luminex微珠阵列技术(Milliplex Human High Sensitivity 9-plex; Millipore Billerica, MA, USA)来检测脑脊液和血清中的IL-1β水平。对可用的脑脊液和血清样本进行IL-1β水平检测。IL-1β测定的方差系数＜10%。
9 统计学分析
运用SPSS20.0版本(Chicago, IL, USA，伊利诺伊州芝加哥市)和SAS(Cary, NC, USA，北卡罗来纳州卡瑞镇)进行统计学分析。汇总统计平均数、中位数、频率及均数的标准差(SEM)。运用独立样本t检验，合适时应用曼-惠特尼检验来评估PTE组和连续变量间的差异。运用χ2分析，合适时应用Fisher精确检验来评估PTE与分类变量包括IL-1βSNP基因型间的差异。
为在PTE的环境下分析血清和脑脊液IL-1β，外伤后第一周根据每天的IL-1β水平计算出周平均值。每日数值＞3个标准差高于/低于总体均值被认为是异常值，排除在分析之外(脑脊液n=8，血清n=7)。考虑到外周单核细胞和中枢神经系统小胶质细胞均能诱导激活巨噬细胞，我们假设中枢神经系统IL-1β水平代表中枢神经系统生成的和外周生成转运至中枢神经系统的IL-1β的总和。为了表达血清对CSF中IL-1β水平的相对贡献，通过划分暂时匹配的CSF/血清样本计算IL-1β比值，而后每日比值取平均值获得IL-1β的周比值。为确定基因和其它变量与细胞因子比例间的关系，通过多变量模型对显著的双变量相关性(P＜0.05)进行分析。
对于患PTE的受试者，运用Kaplan-meier生存分析，通过候选SNP变异来检验首次癫痫发作时间(8 d~3年)，并调整死亡时间。运用Cox比例风险模型检验IL-1β比值和在PTE风险方面显著不同基因型的SNPs。在Cox模型中，首次癫痫发作时间8 d~3年为独立变量，PTE发生率为感兴趣的事件。多变量Cox模型检验IL-1β的SNPs并对在双变量分析中与PTE状态有显著相关性的协变量进行调整。Cox模型对GCS和凹陷性颅骨骨折进行调整，考虑到它们明确与TBI严重程度和PTE有关。
结果
1 人群描述
1.1 IL-1β遗传学人群
共有256例患中度至重度TBI且基因型信息符合PTE分析标准的成年患者。接近81.6%的受试者为男性，18.4%为女性。平均年龄±标准差为(35.0±0.93)岁。GCS评分中位数为6，重症监护的住院时间(LOS)平均数为(22.5±0.68) d。最常见的损伤机制包括汽车事故(50.4%)，摩托车事故和跌落(11.3%)。249例(97.3%)给予AEDs来预防癫痫发作，其中42例发生PTE(16.4%)。确诊为PTE的患者，其中51.2%患者至少有一份临床发作时的EEG；34.1%患者在急性期治疗期间至少有一份EEG。70.7%患者在外伤后的1周~3年访视期间至少有一份EEG。
表 1提供了基于PTE状态的人群分类列表。ISS评分较低的患者更易患PTE (P=0.026)。IHI状态(P=0.033)和SDH (P=0.002)也与PTE有关。死亡率与PTE显著相关，死亡患者的PTE发生率较低。因此创建了一个死亡率调整后的PTE人群(n=206)。未调整和死亡率调整后的PTE人群在损伤或人口统计学信息方面无明显差异(数据未列出)。
表1
人口统计数据表
1.2 IL-1β水平人群
有59例中度至重度TBI及具急性细胞因子信息的患者，评估其IL-1β比值和PTE的影响因素(表 1)。相比于那些更严重的颅外创伤，IHI状态与较高水平的IL-1β相关(P=0.047)。SDH也和较高水平的IL-1β比值有关(P=0.037)。较低水平的血清IL-1β与IHI状态(P=0.007)及SDH (P=0.022)均具有相关性。较高的ISS和较高水平的血清IL-1β具有相关性(P=0.006)。在存活者中PTE患者(n=46)的IL-1β水平和比值比较在损伤和人口统计学信息方面未显示出显著差异(数据未列出)。
1.3 健康对照人群
健康对照人群成员均为白种人，其中61.5%为男性(n=8)。平均年龄为(24.62±11.16)岁。关于年龄和性别分布的敏感性分析显示TBI与对照队列之间有显著差异。鉴于有报道称TBI后的炎症反应可能有性别差异，我们对对照组内是否存在性别差异进行评估，发现IL-1β在血清(女性0.361±0.230，男性0.072±0.036；P=0.257)，CSF(女性0.030±0.005，男性0.026±0.003；P=0.171)，和其比值(女性0.400±0.667，男性0.441±0.263；P=0.257)中均无显著差异。在对照组内，年龄与IL-1β的血清，CSF，或比值水平无明显相关(P=0.686，0.733，0.788)。
2 急性期IL-1β水平
对TBI存活者组和健康对照组的CSF和血清IL-1β的日平均值和周平均值进行比较。TBI组中CSF IL-1β水平的日平均值和周平均值高于对照组(所有比较中均为P≤0.001)(图 1a)；外伤后第3天的CSF/血清IL-1β比值更高(P=0.025)，且周平均值水平相比于对照组有更高的趋势(P=0.070)(图 1b)；血清IL-1β水平与对照组无差异(图 1c)。IL-1β的血清水平(女性0.377±0.543，男性0.550±1.719；P=0.722)，CSF水平(女性0.088±0.109，男性0.123±0.167；P=0.454)，和比值(女性0.766±0.565，男性1.699±3.771；P=0.589)的周平均值在性别上无明显差异。
图1
存活者(n=46)中IL-1β水平 a 与健康对照(n=13)相比较的CSF中IL-1β水平(各时间点P＜0.001)；b 与健康对照(n=11)相比较的CSF/血清IL-1β比值(第3日P=0.025, 周平均P=0.070);c 与健康对照(n)=11相比较的血清IL-1β比较(所有比较P＞0.05)
3 急性期IL-1β水平和PTE发生
在存活者中，PTE患者相比于无PTE者其周IL-1β比值更高(PTE=3.794±2.274；无PTE=0.8207±0.1495；P=0.020)，见图 2a。血清IL-1β在PTE组更低[PTE=(0.200 7±0.129 0) pg/mL；无PTE=(0.723 9±0.3501) pg/mL；P=0.016], 见图 2b。PTE组中的CSF IL-1β水平无差异(PTE=0.1964±0.0901；无PTE=0.0876±0.0159；P=0.864)，见图 2c。表 1显示了IL-1β水平人群的Cox模型，并对死亡时间、ISS、GCS、SDH和凹陷性颅骨骨折进行调整，显示随着时间的推移，高水平的IL-1β比值与PTE风险升高相关[风险比=1.341；可信区间(CI)(1.081-1.665)；P=0.008]，见表 3，图 3a。类似的Cox模型显示血清IL-1β和PTE风险无相关性(数据未列出)。
图2
存活者(n=46)PTE状态在外伤后第一周平均IL-1β水平 PET的CSF/血清IL-1β比值(P=0.020)；b PTE的血清IL-1β水平(P=0.016);c PTE的CSF IL-1β水平(P＞0.05)
表3
Cox比例风险
图3
Cox比例风险累积PTE风险 a 基于平均CSF/血清IL-1β比值并针对死亡时间(以日记)、年龄、性别、ISS、GCS、SDH及凹陷性颅骨骨折进行调整(P=0.008)的Cox比例风险累积PET风险；b 针对死亡时间(以日记)、年龄、性别、ISS、GCS、SDH及凹陷性颅骨骨折进行调整的rs1143634基因型(P=0.005)的Cox比例风险累积PTE风险
4 rs1143634 S与PTE发生的相关性
表 2描述了所有SNP等位基因频率和入组的所有人群中死亡率调整后亚组的双变量相关性。不管是否进行死亡率调整，PTE和rs1143633，rs3136558，rs1143627，rs16944之间无明显双变量相关性。但是，双变量评估显示rs1143634和PTE风险相关。罹患PTE的患者中，17.6%为CC基因型，47.7%为CT基因型，无TT基因型(P=0.008)。与之前的研究一致，位于rs1143634上的TT基因型患者(n=13)只占所有患者中的很小的百分比。分组基因型分析显示杂合子(CT)相比纯合子患PTE的风险更大(P=0.005)。进行死亡率调整后的Kaplan-Meier生存分析显示杂合子的首次癫痫发作时间比纯合子更早[CT平均值为854.37 d，CI(759.28-949.46)；CC+TT平均值为1010.51 d，CI(959.40-1061.62)；P=0.006]。Cox比例风险模型针对死亡时间、年龄、性别、GCS、ISS、SDH和凹陷性颅骨骨折进行了调整，显示CT基因型相比纯合子与PTE风险增加相关[风险比=2.845；CI (1.372-5.900)；P=0.005，见表 3，图 3b。
表2
双变量IL-1β标记SNP结果
5 rs1143634和IL-1β水平的相关性
在死亡率调整后的IL-1β水平人群中，rs1143633、rs1143627、rs3136558和rs16944的受试者IL-1β比值，血清或CSF水平无明显双变量相关性。血清IL-1β水平有统计学差异(P=0.014)，且基于rs1143634基因型，IL-1β比值显示出一个趋势(P=0.093)。分组基因型分析显示杂合子比纯合子的血清IL-1β水平更低［CT平均值=(0.1571±0.0552) pg/mL；CC+TT平均值=(0.9661±0.5048) pg/mL；P=0.009]。杂合子比纯合子的pIL-1β比值也更高[CT平均值=(2.615±1.583)；CC+TT平均值=(0.8251±0.2094)；P=0.062]。rs3136558倾向于和血清IL-1β水平相关(P=0.058)，但进一步分析显示在我们的人群中rs3136558和rs1143634间存在高度的连锁不平衡(P≤0.001)。
讨论
PTE是TBI的主要并发症，导致伤残增加，且患者需长期AEDs治疗。PTE和癫痫发生的潜在机制尚不清楚，尽管PTE有特征性的临床危险因素，但并非所有存在这些危险因素的患者都发生PTE。在某些个体中，遗传变异和TBI相关的生物反应可解释增加的PTE发病率。最新的癫痫基准研究进展报告基于最新发表的研究结果将IL-1β列为癫痫潜在的生物标记物。我们实验室此前的工作显示每日服用左乙拉西坦，一种广谱的AED，可减少实验性TBI动物局部脑组织IL-1β的表达，这可能是其在TBI中抗癫痫作用潜在的原因。该观察结果连同其它显示IL-1β和非外伤性癫痫关系的资料，为研究IL-1β和PTE的发生提供了理论基础。
IL-1β于中枢神经系统和外周产生。在健康个体中，CNS IL-1β水平很低，且有助于诸如记忆形成和睡眠等生理过程。而TBI与IL-1β表达增加相关，这种表达增加可在外伤后持续数月。IL-1β水平升高与早期神经元死亡和兴奋性毒性有关，提示了在TBI恢复期IL-1β调控的重要性。基于这些研究结果及已知的IL-1β诱发癫痫的效应，我们假设TBI引起的早期IL-1β水平变化可能与PTE产生相关。鉴于TBI后血脑屏障(BBB)破坏和外周炎症反应，以及CSF IL-1β水平很可能由CNS和外周产生的总产物，我们也发现CSF/血清IL-1β比值可作为反映血清IL-1β对CSF IL-1β水平贡献的指标尽管我们的数据显示PTE组CSF IL-1β水平升高，但是相比与对照组，PTE组和无PTE组的CSF IL-1β平均值均无明显差异。血清IL-1β水平也与对照组无明显差异。但是，PTE组血清IL-1β水平显著低于无PTE组，表明两组间血清IL-1β的相对差值转移到了CNS中。有意思的是，外伤后第1周高CSF/血清IL-1β比值的患者其PTE风险显著升高，表明尽管TBI后CSF IL-1β绝对值升高，但外周的IL-1β的相对贡献是最终PTE发生最为敏感的测量指标。这个相关性很有趣，并且对于早期筛查有一定意义，但仍需要开展进一步工作来确定血清IL-1β和比值的关系是否/如何反映有关持续的外周炎症状态，第1年内中度至重度损伤临床人群的特点，可能在长期过程中导致癫痫发作和PTE发生。多变量Cox模型显示只有IL-1β比值与PTE风险显著相关，表明CSF/血清比值似乎增加了外周炎症对CNS病理的贡献的特性。
有意思的是，在一报道中提到II型IL-1β转运蛋白可通过涉及脑微血管内皮细胞的体外途径穿过BBB将IL-1β由血液转运至脑。尽管临床TBI研究表明，某些细胞因子顺脑到血液的转运梯度进行转运，但类似的研究并不能确定这样的IL-1β转运梯度。我们的结果显示相对于CSF，在对IL-1β血液到脑梯度有提示意义的IL-1β水平的队列中存在高血清IL-1β浓度(图 1)。此外，PTE组中的高CSF/血清比值也支持IL-1β血液到脑转运的假设(图 2)。这一发现，与rs1143634和血清水平及比值的关系，也表明遗传变异影响IL-1β转运至CNS能力，可作为进一步探索IL-1β病理学如何影响PTE风险的合理的生物学机制。
但目前仍需要进一步研究来确证为何TBI后高IL-1β比例可以预测外伤后几个月到几年时间里PTE的发生。增强的急性炎症反应可能可以预测可导致癫痫和PTE发生的长期慢性(CNS和外周)炎症及BBB功能障碍。要强调的是，血清细胞因子水平在中度至重度TBI后其水平升高至少维持1年，可能继而导致BBB功能障碍和持续的CNS炎症。在某些细胞中，包括激活的小胶质细胞，IL-1β可诱导IL-1βmRNA产生，导致一个积极的反馈系统使CNS炎症持续存在。有意思的是，临床影像学研究表明在TBI后小胶质细胞的激活可持续数年，同时伴随进行性白质变性。此外，研究表明TBI后多达1年的时间里都存在进行性细胞死亡，提示与细胞凋亡相关的细胞外ATP的升高可能慢性激活了产生IL-1β所需的炎症小体。
PTE组中高急性期CSF/血清IL-1β比值可能预示着多种与慢性炎症有关的长期生理变化，这些变化可促进癫痫发作。脑室内IL-1β可激活下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感神经系统，减少外周细胞的免疫反应，抑制巨噬细胞分泌IL-1β。因此，正如本研究中报道，PTE患者中该神经免疫调节系统急性过度活化，导致血清IL-1β水平降低。研究显示IL-1β升高和/或IL-1β受体拮抗剂减少(IL-1α)明显的改变了化学诱发癫痫发作的频率、持续时间和发作阈值。有关点燃模型研究中癫痫发作过程延迟抑制了神经生长因子(NGF)。值得注意的是，IL-1β同时上调体外和体内的NGF，在TBI大鼠模型中应用IL-1α抑制了NGF-介导的可塑性。但仍需要进一步工作来辨别CSF/血清IL-1β比值是否能反应这些生理状态的改变。
IL-1β基因变异分析显示了rs1143634基因型，PTE，血清IL-1β水平和CSF/血清IL-1β比值的关系。rs1143634上为CT基因型的患者PTE风险明显升高，且首次癫痫发作的时间明显缩短(平均缩短5个月)，表明局部的变异促使了癫痫发生。尽管该SNP的最小等位基因频率(MAF)为0.25，但仅有13例受试者为TT纯合子。有意思的是，这几位受试者均未患PTE。虽然TT组样本量较小，可能受样本偏差影响，但数据提示了TT纯合子对PTE起相对保护作用，而CT杂合子则为独特的风险组。而且，将来的验证研究不太可能产生剂量反应与PTE风险的关系。
杂合子关联分析出现编码膜受体的基因变异，可导致多重作用影响有趣的表现型(如受体蛋白异二聚体对比二聚体膜运输的差别效应)。我们之前的研究报道与PTE有关的rs10920573杂合子位于ADORA1基因位点。该基因虽然不是膜受体，但可推测不同的IL-1β亚型混合的细胞外环境，理论上对于靶受体结合、激活和导致PTE风险增加的炎症途径的下游信号可有不同的作用。考虑到rs1143634上的杂合子也和血清IL-1β减少有关，IL-1β可影响BBB渗透性，因此与IL-1β生理机制相关的位于rs1143634上的杂合子可不同程度促进血清IL-1β转运至CSF。IL-1β调节其表达和BBB载体转运蛋白如ATP结合盒式(ABC)转运蛋白的流出功能，而在TBI中基因变异可能对于IL-1β水平和其他分子如皮质醇有差别效应。值得注意的是，ABC转运蛋白也促进了激活的巨噬细胞释放IL-1β，该作用可能与慢性激活的小胶质细胞12释放IL-1β导致PTE发生特别相关。最后，TBI后主要的普遍的表观遗传修饰被人们所知，鉴于之前有关IL-1β启动子如何产生表观遗传变异的报告，这可能是进一步研究rs1143634与PTE风险增加的相关机制的另一领域。
rs1143634的SNP位于IL-1β基因的外显子5的编码区域，但其功能仍然是有争议的。研究表明等位基因T与IL-1β产生增加有关，而其他人发现IL-1β的释放并无差异。rs1143634标记了2号染色体上IL-1β基因的将近1kb的区域，其中该区域也包括错义的SNPs rs141525736，rs139843362和rs114640380(HapMap phase 3；hapmap.org)。但是这些SNPs并不是高度变异的，且尚无报道其相关功能文献。此外，目前尚不清楚LD衰减位于rs1143634标记的哪个区域，因此代表rs1143634的DNA区额外的基因分型对更好的了解功能影响的变化包括该区域的杂合性可能有一定帮助。
ISS，IHI和SDH均与PTE有关。若患者ISS评分较低，或患有IHI、SDH更有可能患PTE。由于ISS是一种总体的解剖损伤严重程度评分，因此IHI患者同时ISS评分较低也不足为奇。但根据多变量分析，ISS或IHI并不是主要的PTE预测因素。我们的结果也支持先前显示SDH能增加PTE风险的研究。
尽管有了IL-1β与PTE之间联系的一些有前景的发现，也必须考虑到一些局限性。病历资料摘要很难准确评估癫痫复发和PTE的严重性。因此，我们研究中没有追踪癫痫复发。此外，插管和镇静的受试者可能错过其外伤1周以后的亚临床发作或无抽搐发作。且本次研究的样本只包含中度至重度损伤的白种人，从而限制了不同种族背景人群的普遍性。此外，总体的样本大小适合遗传相关的研究，但生物标志物和基因分析的人群是目前所能获得的最大的中度至重度TBI人群。虽然如此，就目前所知，这是第一个研究报道提示血清IL-1β对CSF IL-1β水平有贡献，以及PTE与IL-1β基因变异有关。但仍需要进一步在多个独立的群体中来重复这些发现以更好的理解与这些关系相关的机制。这些研究结果如果被证实，可能激起进一步的研究来检验靶向IL-1β预防和治疗PTE；也可支持未来工作配合EEG筛查和临床护理途径评估遗传筛查的实用性，通过筛查进行风险分层的方式来治疗和预防PTE。另外，探索基因变异和TBI引起的炎症反应有关的其它生物标志物水平与PTE的发生也是十分必要的。
