引用本文： 解媛媛, 舒怡, 龙泓羽, 肖波. 颞叶癫痫小鼠海马CA3区微血管变化的探讨. 癫痫杂志, 2016, 2(4): 329-332. doi: 10.7507/2096-0247.20160058 复制
癫痫是一种大脑神经元异常高度同步化放电活动所引发的发作性疾病，临床以颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy，TLE)最为常见。癫痫持续状态(Status epilepticus，SE)和痫性发作在损害神经元的同时，可刺激神经元新生和胶质增生等组织重塑[1]，此时机体需要大量氧气和营养物质到受损区域，随即可出现脑血流量增加，血脑屏障通透性改变以及微血管密度增加和微血管重构。目前已经证实在癫痫发生后人和动物脑内可出现血管形态以及与调节血管再生相关基因的明显变化[2-4]。体外实验进一步发现在此过程中海马神经元可迅速释放血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，诱导VEGF受体-2表达升高，而给予抗VEGF抗体后血管重构过程被抑制[5]。以上结果提示血管的重塑过程存在于癫痫大脑内。免疫组织化学染色是目前较为常用的显示海马微血管构筑的方法之一。利用不同类型标记物分别标记内皮细胞或基底膜，均可以清楚地显示海马微血管形态和走行。本实验将首次采用血小板内皮细胞黏附分子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)标记内皮细胞，研究TLE后小鼠海马微血管的分布和形态变化。
材料与方法
1 动物与分组
选5～6周龄健康雄性SPF C57BL/6小鼠18只，体重18～21g；由中南大学动物部提供。该动物实验通过中南大学湘雅医院伦理委员会的审批。将小鼠随机分为正常对照组(n=9)与实验组(n=9)。两组动物分别在模型成功建立后7、28和56 d行多聚甲醛灌注取脑，行PECAM-1免疫组织化学染色(每个时间点每组各3只)。
2 颞叶癫痫模型建立
向小鼠腹腔注射氢溴酸东莨菪碱(1 mg/kg)，30 min后腹腔注射匹罗卡品320～340 mg/kg (美国Sigma公司)，待小鼠进入SE 2 h后腹腔注射地西泮7.5 mg/kg终止发作。发作程度按Racine标准分级，2 h内3～5级发作发生3次以上的小鼠进入SE，并归于致痫成功组。正常对照组除注射与匹罗卡品等剂量的生理盐水外，余处理均同模型组。在其后的实验时间内观察小鼠的行为学。
3 冰冻切片标本制备
腹腔注射10%水合氯醛(5 mL/kg)，麻醉各时间点小鼠。沿小鼠胸骨旁线剪开胸腹腔，暴露心脏和肝脏，取灌注针自心尖向右上45°进针至主动脉起始端，固定针头，剪开右心耳，快速灌注4℃生理盐水50 mL至肝脏变白，自右心耳流出的液体清亮后接着灌注4℃ 4%多聚甲醛，先快后慢，约50 mL至小鼠四肢强直僵硬后停止灌注。沿枕骨剪下头部，仔细剪开头皮及颅骨，充分暴露并完整剥离脑组织，置于4℃ 4%多聚甲醛后固定12～16 h，0.1 mol/L PBS充分泡洗后移入4℃ 30%蔗糖溶液沉底。冰冻切片机温度调至-18～-20℃，将蔗糖溶液中的脑组织取出，修块、包埋后，行脑组织冠状位连续切片(德国Leica公司)，切片厚30 μm。切片按顺序放入低温防护液0.1 mol/L PBS中含25%甘油和30%乙二醇)中，-20℃保存备用。
4 免疫组织化学检测
切片从低温防护液中取出后，0.1 mol/L PBS(PH7.5)漂洗30 min；1% H2O2室温孵育30 min以灭活内源性过氧化物酶；柠檬酸微波修复抗原20 min；含10%正常兔血清、抗生物素蛋白溶液(200 μL/mL，美国Vector Lab公司)和0.3% Triton混合液中室温孵育2 h；含生物素(200 μL /mL，美国Vector Lab公司)和一抗大鼠源PECAM-1多克隆抗体(1：25，美国BD公司)的0.1 mol/L PBS(PH7.5)溶液中室温孵育48 h；生物素化山羊抗大鼠二抗(1：200，美国KPL公司)的0.1 mol/L PBS(PH7.5)溶液中室温孵育1 h；VECTASTAIN® ABC kit(美国Vector Lab公司)，室温下孵育1 h；DAB室温显色10～15 min；每步骤间用0.1 M(mol/L) PBS漂洗3次，每次15 min；将切片轻柔铺片于载玻片上，自然风干30 min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明和封片。阴性对照采用PBS代替一抗，余同上述操作。所有步骤均在摇床上进行。
5 图像分析和统计学方法
莱卡DM 5000 B显微镜拍摄免疫组化图片。采用盲法使用Imaging-Pro Plus 6.0软件(IPP 6.0，Media Cybernetics，USA)对图片进行分析，计算小鼠海马CA3区微血管密度。微血管平均密度(Numbers/Area)=微血管数目/已知总面积(根据IPP 6.0计算)。所有纵向的微血管均纳入计算。血管的分支被认为是独立的血管。在脑片上显示横截面的血管不纳入计算。每组每只小鼠分析3张距前囟不同距离的脑片。
采用Graph Pad Prism 5.01软件分析实验数据。实验数据用均数±标准差表示，对照组与实验组组间比较采用两因素χ2分析，组间比较采用Bonferroni post test检验，P值＜0.05为差异有统计学意义。
结果
在实验期间，所有小鼠毛发光洁，自由摄食饮水，无死亡。
1 正常对照组小鼠海马CA3区微血管形态
采用PECAM-1标记对照组小鼠海马微血管的内皮细胞，可清楚显示微血管呈浅褐色-深褐色，血管分支少；组织中细胞核被苏木素复染为蓝色，海马微血管呈层状分布，与神经细胞构筑表现一致；海马CA3区微血管以始层分布最为密集，辐射层次之，锥体细胞层最为稀疏。各时间点小鼠海马CA3区微血管的形态和分布基本一致(图 1)。
图1
对照组小鼠海马CA3区PECAM-1免疫组化染色(×100) a~c.分别为7、28和56d，浅褐色-深褐色为PECAM-1标记的微血管，蓝色为苏木素复染的细胞核
Figure1.
Immunohistochemistry staining of PECAM-1 in hippocampal CA3 region in normal control mice (×100) a~c. represents 7 d, 28dand 56drespectively (light brown-dark brown showed PECAM-1 labeled capillaries, blue showed hematoxylin labeled nucleus)
2 实验组小鼠海马CA3区微血管形态
匹罗卡品致痫后7d海马CA3区微血管排列方向紊乱，平行神经元顶树突排列的血管减少，片段状血管开始出现；28 d微血管排列明显紊乱，血管呈片段状散乱分布在海马CA3区；56 d微血管数目较前下降，血管排列分散，仍可见片段状微血管(图 2)。
图2
实验组小鼠海马CA3区PECAM-1免疫组化染色(×100) a~c.分别为致痫后7、28和56d，浅褐色-深褐色为PECAM-1标记的微血管，蓝色为苏木素复染的细胞核
Figure2.
Immunohistochemistry staining of PECAM-1 in hippocampal CA3 region in experimental mice (×100) a~c. represents 7 d, 28dand 56drespectively (light brown-dark brown showed PECAM-1 labeled capillaries, blue showed hematoxylin labeled nucleus)
3 颞叶癫痫后微血管密度变化
对照组、实验组小鼠致痫后7、28和56d海马CA3区微血管密度(Microvessels density，MVD)如表 1所示。Bonferroni post test检验显示致痫后28 d组MVD较对照组上升，差异有统计学意义(t=5.628，P＜0.001)。其它各实验组与对照组之间均无统计学差异。
表1
两组小鼠海马CA3区微血管密度
Table1.
Microvessels density in hippocampal CA3 of normal control group and experimental group
讨论
免疫组织化学染色作为目前常用的显示海马微血管的方法，通过不同类型的标记物分别标记内皮细胞或基底膜，清楚显示海马微血管形态和走行。内皮屏障抗原(Endothelial barrier antigen，EBA)表达于血管管腔面的内皮细胞，海马各区均观察到EBA标记的微血管，以齿状回分子层最为密集。EBA标记的血管多呈管状，直径在6~12 μm之间[6]。EBA是一种屏障类型的内皮细胞标记物，可标记出非血管的内皮细胞；但其表达也不稳定，当组织受损后EBA表达立即下降，因此受损脑部采用EBA标记可能会导致结果出现误差[7]。兔内皮细胞抗原-1(Rat endothelial cell antigen-1，RECA-1)可特异地标记实验鼠所有类型的内皮细胞，较EBA更全面显示海马血管。RECA-1标记的微血管也大多呈管状，直径在6～12 μm之间[6]。但RECA-1主要标记大鼠内皮细胞，限制其应用范围[8]。本实验采用PECAM-1标记内皮细胞，发现小鼠海马微血管分布与神经细胞分层具有相对应的层次性，海马CA3区微血管以始层分布最为密集，辐射层次之，锥体细胞层最为稀疏；微血管走行多与神经元顶树突方向平行，与海马长轴垂直。该结果与上述研究较为一致，PECAM-1能够较好显示小鼠海马微血管分布及形态。
目前对癫痫后海马的微血管重塑进行研究已成为研究TLE发生发展机制的热点之一。Rigau研究小组发现各种病因导致的TLE患者以及匹罗卡品诱导的癫痫大鼠海马血管密度均有增加，而且以微血管为主，该小组还发现海马微血管密度与癫痫发作频率呈正相关[9]。Nicoletti等[10]进一步研究发现癫痫鼠脑海马CA3区VEGF表达明显升高。更有研究发现采用MRI研究癫痫鼠脑血容量(Cerebral blood volume，CBV)和脑血流量(Cerebral blood flow，CBF)，发现癫痫后虽CBF改变不明显，但CBV明显上升，SE后14dCBV较SE后2 d上升178%，较对照组上升124% [6]。本实验结果首次发现匹罗卡品致痫小鼠海马PECAM-1标记微血管形态随着致痫后时间推移，微血管在海马CA3区冠状切面上碎片状改变越发明显，提示血管扭曲程度加重，分支增多；微血管走行方向发生变化，从平行走行逐渐演变成横穿颗粒细胞层，提示海马CA3区可能逐渐形成异常血管丛，与神经元增生、胶质增生和轴突生长等有关[6]。
然而，目前也有研究认为癫痫后微血管变化并不是真正的血管重塑过程。采用胶原蛋白IV标记TLE人脑海马血管，发现在硬化的CA1区血管大多已萎缩，血管表面有许多小棘样突起，较正常血管表面粗糙。进一步利用电镜分析发现，这些突起来源于基底膜，是血管的异常出芽。并在缩小的血管管腔里发现活化的星形胶质细胞。研究者认为这些特点提示此类血管是由正常血管崩解形成[11, 12]，但没有证据表明此类血管也存在于硬化海马的其他区域以及癫痫后非硬化的海马组织中，也未能分析该类血管与癫痫的关系。因此，这种血管变化是否具有普适性，目前尚无进一步证据支持。
匹罗卡品诱导的TLE小鼠海马CA3区存在微血管分布和形态的损害，提示微血管重塑可能参与癫痫后异常神经网络的形成，为进一步解释TLE的发病机制提供实验依据。
癫痫是一种大脑神经元异常高度同步化放电活动所引发的发作性疾病，临床以颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy，TLE)最为常见。癫痫持续状态(Status epilepticus，SE)和痫性发作在损害神经元的同时，可刺激神经元新生和胶质增生等组织重塑[1]，此时机体需要大量氧气和营养物质到受损区域，随即可出现脑血流量增加，血脑屏障通透性改变以及微血管密度增加和微血管重构。目前已经证实在癫痫发生后人和动物脑内可出现血管形态以及与调节血管再生相关基因的明显变化[2-4]。体外实验进一步发现在此过程中海马神经元可迅速释放血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，诱导VEGF受体-2表达升高，而给予抗VEGF抗体后血管重构过程被抑制[5]。以上结果提示血管的重塑过程存在于癫痫大脑内。免疫组织化学染色是目前较为常用的显示海马微血管构筑的方法之一。利用不同类型标记物分别标记内皮细胞或基底膜，均可以清楚地显示海马微血管形态和走行。本实验将首次采用血小板内皮细胞黏附分子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)标记内皮细胞，研究TLE后小鼠海马微血管的分布和形态变化。
材料与方法
1 动物与分组
选5～6周龄健康雄性SPF C57BL/6小鼠18只，体重18～21g；由中南大学动物部提供。该动物实验通过中南大学湘雅医院伦理委员会的审批。将小鼠随机分为正常对照组(n=9)与实验组(n=9)。两组动物分别在模型成功建立后7、28和56 d行多聚甲醛灌注取脑，行PECAM-1免疫组织化学染色(每个时间点每组各3只)。
2 颞叶癫痫模型建立
向小鼠腹腔注射氢溴酸东莨菪碱(1 mg/kg)，30 min后腹腔注射匹罗卡品320～340 mg/kg (美国Sigma公司)，待小鼠进入SE 2 h后腹腔注射地西泮7.5 mg/kg终止发作。发作程度按Racine标准分级，2 h内3～5级发作发生3次以上的小鼠进入SE，并归于致痫成功组。正常对照组除注射与匹罗卡品等剂量的生理盐水外，余处理均同模型组。在其后的实验时间内观察小鼠的行为学。
3 冰冻切片标本制备
腹腔注射10%水合氯醛(5 mL/kg)，麻醉各时间点小鼠。沿小鼠胸骨旁线剪开胸腹腔，暴露心脏和肝脏，取灌注针自心尖向右上45°进针至主动脉起始端，固定针头，剪开右心耳，快速灌注4℃生理盐水50 mL至肝脏变白，自右心耳流出的液体清亮后接着灌注4℃ 4%多聚甲醛，先快后慢，约50 mL至小鼠四肢强直僵硬后停止灌注。沿枕骨剪下头部，仔细剪开头皮及颅骨，充分暴露并完整剥离脑组织，置于4℃ 4%多聚甲醛后固定12～16 h，0.1 mol/L PBS充分泡洗后移入4℃ 30%蔗糖溶液沉底。冰冻切片机温度调至-18～-20℃，将蔗糖溶液中的脑组织取出，修块、包埋后，行脑组织冠状位连续切片(德国Leica公司)，切片厚30 μm。切片按顺序放入低温防护液0.1 mol/L PBS中含25%甘油和30%乙二醇)中，-20℃保存备用。
4 免疫组织化学检测
切片从低温防护液中取出后，0.1 mol/L PBS(PH7.5)漂洗30 min；1% H2O2室温孵育30 min以灭活内源性过氧化物酶；柠檬酸微波修复抗原20 min；含10%正常兔血清、抗生物素蛋白溶液(200 μL/mL，美国Vector Lab公司)和0.3% Triton混合液中室温孵育2 h；含生物素(200 μL /mL，美国Vector Lab公司)和一抗大鼠源PECAM-1多克隆抗体(1：25，美国BD公司)的0.1 mol/L PBS(PH7.5)溶液中室温孵育48 h；生物素化山羊抗大鼠二抗(1：200，美国KPL公司)的0.1 mol/L PBS(PH7.5)溶液中室温孵育1 h；VECTASTAIN® ABC kit(美国Vector Lab公司)，室温下孵育1 h；DAB室温显色10～15 min；每步骤间用0.1 M(mol/L) PBS漂洗3次，每次15 min；将切片轻柔铺片于载玻片上，自然风干30 min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明和封片。阴性对照采用PBS代替一抗，余同上述操作。所有步骤均在摇床上进行。
5 图像分析和统计学方法
莱卡DM 5000 B显微镜拍摄免疫组化图片。采用盲法使用Imaging-Pro Plus 6.0软件(IPP 6.0，Media Cybernetics，USA)对图片进行分析，计算小鼠海马CA3区微血管密度。微血管平均密度(Numbers/Area)=微血管数目/已知总面积(根据IPP 6.0计算)。所有纵向的微血管均纳入计算。血管的分支被认为是独立的血管。在脑片上显示横截面的血管不纳入计算。每组每只小鼠分析3张距前囟不同距离的脑片。
采用Graph Pad Prism 5.01软件分析实验数据。实验数据用均数±标准差表示，对照组与实验组组间比较采用两因素χ2分析，组间比较采用Bonferroni post test检验，P值＜0.05为差异有统计学意义。
结果
在实验期间，所有小鼠毛发光洁，自由摄食饮水，无死亡。
1 正常对照组小鼠海马CA3区微血管形态
采用PECAM-1标记对照组小鼠海马微血管的内皮细胞，可清楚显示微血管呈浅褐色-深褐色，血管分支少；组织中细胞核被苏木素复染为蓝色，海马微血管呈层状分布，与神经细胞构筑表现一致；海马CA3区微血管以始层分布最为密集，辐射层次之，锥体细胞层最为稀疏。各时间点小鼠海马CA3区微血管的形态和分布基本一致(图 1)。
图1
对照组小鼠海马CA3区PECAM-1免疫组化染色(×100) a~c.分别为7、28和56d，浅褐色-深褐色为PECAM-1标记的微血管，蓝色为苏木素复染的细胞核
Figure1.
Immunohistochemistry staining of PECAM-1 in hippocampal CA3 region in normal control mice (×100) a~c. represents 7 d, 28dand 56drespectively (light brown-dark brown showed PECAM-1 labeled capillaries, blue showed hematoxylin labeled nucleus)
2 实验组小鼠海马CA3区微血管形态
匹罗卡品致痫后7d海马CA3区微血管排列方向紊乱，平行神经元顶树突排列的血管减少，片段状血管开始出现；28 d微血管排列明显紊乱，血管呈片段状散乱分布在海马CA3区；56 d微血管数目较前下降，血管排列分散，仍可见片段状微血管(图 2)。
图2
实验组小鼠海马CA3区PECAM-1免疫组化染色(×100) a~c.分别为致痫后7、28和56d，浅褐色-深褐色为PECAM-1标记的微血管，蓝色为苏木素复染的细胞核
Figure2.
Immunohistochemistry staining of PECAM-1 in hippocampal CA3 region in experimental mice (×100) a~c. represents 7 d, 28dand 56drespectively (light brown-dark brown showed PECAM-1 labeled capillaries, blue showed hematoxylin labeled nucleus)
3 颞叶癫痫后微血管密度变化
对照组、实验组小鼠致痫后7、28和56d海马CA3区微血管密度(Microvessels density，MVD)如表 1所示。Bonferroni post test检验显示致痫后28 d组MVD较对照组上升，差异有统计学意义(t=5.628，P＜0.001)。其它各实验组与对照组之间均无统计学差异。
表1
两组小鼠海马CA3区微血管密度
Table1.
Microvessels density in hippocampal CA3 of normal control group and experimental group
讨论
免疫组织化学染色作为目前常用的显示海马微血管的方法，通过不同类型的标记物分别标记内皮细胞或基底膜，清楚显示海马微血管形态和走行。内皮屏障抗原(Endothelial barrier antigen，EBA)表达于血管管腔面的内皮细胞，海马各区均观察到EBA标记的微血管，以齿状回分子层最为密集。EBA标记的血管多呈管状，直径在6~12 μm之间[6]。EBA是一种屏障类型的内皮细胞标记物，可标记出非血管的内皮细胞；但其表达也不稳定，当组织受损后EBA表达立即下降，因此受损脑部采用EBA标记可能会导致结果出现误差[7]。兔内皮细胞抗原-1(Rat endothelial cell antigen-1，RECA-1)可特异地标记实验鼠所有类型的内皮细胞，较EBA更全面显示海马血管。RECA-1标记的微血管也大多呈管状，直径在6～12 μm之间[6]。但RECA-1主要标记大鼠内皮细胞，限制其应用范围[8]。本实验采用PECAM-1标记内皮细胞，发现小鼠海马微血管分布与神经细胞分层具有相对应的层次性，海马CA3区微血管以始层分布最为密集，辐射层次之，锥体细胞层最为稀疏；微血管走行多与神经元顶树突方向平行，与海马长轴垂直。该结果与上述研究较为一致，PECAM-1能够较好显示小鼠海马微血管分布及形态。
目前对癫痫后海马的微血管重塑进行研究已成为研究TLE发生发展机制的热点之一。Rigau研究小组发现各种病因导致的TLE患者以及匹罗卡品诱导的癫痫大鼠海马血管密度均有增加，而且以微血管为主，该小组还发现海马微血管密度与癫痫发作频率呈正相关[9]。Nicoletti等[10]进一步研究发现癫痫鼠脑海马CA3区VEGF表达明显升高。更有研究发现采用MRI研究癫痫鼠脑血容量(Cerebral blood volume，CBV)和脑血流量(Cerebral blood flow，CBF)，发现癫痫后虽CBF改变不明显，但CBV明显上升，SE后14dCBV较SE后2 d上升178%，较对照组上升124% [6]。本实验结果首次发现匹罗卡品致痫小鼠海马PECAM-1标记微血管形态随着致痫后时间推移，微血管在海马CA3区冠状切面上碎片状改变越发明显，提示血管扭曲程度加重，分支增多；微血管走行方向发生变化，从平行走行逐渐演变成横穿颗粒细胞层，提示海马CA3区可能逐渐形成异常血管丛，与神经元增生、胶质增生和轴突生长等有关[6]。
然而，目前也有研究认为癫痫后微血管变化并不是真正的血管重塑过程。采用胶原蛋白IV标记TLE人脑海马血管，发现在硬化的CA1区血管大多已萎缩，血管表面有许多小棘样突起，较正常血管表面粗糙。进一步利用电镜分析发现，这些突起来源于基底膜，是血管的异常出芽。并在缩小的血管管腔里发现活化的星形胶质细胞。研究者认为这些特点提示此类血管是由正常血管崩解形成[11, 12]，但没有证据表明此类血管也存在于硬化海马的其他区域以及癫痫后非硬化的海马组织中，也未能分析该类血管与癫痫的关系。因此，这种血管变化是否具有普适性，目前尚无进一步证据支持。
匹罗卡品诱导的TLE小鼠海马CA3区存在微血管分布和形态的损害，提示微血管重塑可能参与癫痫后异常神经网络的形成，为进一步解释TLE的发病机制提供实验依据。
