生酮饮食（Ketogenic diet，KD）是一种高脂肪、低碳水化合物，适量蛋白质、维生素和矿物质的饮食。KD用于治疗癫痫已有很长的历史，其疗效明确但作用机制尚不清楚。基于临床观察和研究，最初人们认为KD的作用机制与脱水、酸中毒相关。近几年，基于越来越多的动物实验和临床研究，人们逐渐提出了更多假说。KD减少了葡萄糖的摄入，机体利用葡萄糖受限，而酮体、脂肪酸升高，这可能与其产生抗癫痫作用相关。此外研究发现，KD的抗癫痫机制可能与神经递质、神经元兴奋性及突触传递有关。KD还有神经保护功能，如抗炎、氧化应激等，这与其抗癫痫作用也有关联。但是上述机制并不明确，目前关于KD的抗癫痫机制仍在探索之中。
引用本文： 徐秦岚, 朱飞, 郭安臣, 王群. 生酮饮食治疗癫痫作用机制研究进展. 癫痫杂志, 2016, 2(4): 338-343. doi: 10.7507/2096-0247.20160060 复制
生酮饮食(Ketogenic diet，KD)是一个高脂肪、低碳水化合物、适量蛋白质、维生素和矿物质的饮食。早在19世纪20年代，人们就开始使用KD治疗癫痫，但在30年代晚期，由于抗癫痫药物(AEDs)苯妥英钠的发现，KD疗法迅速退出了临床治疗的舞台。随着时间的推移，越来越多的AEDs被发现并运用于临床，但仍有近1/3的患者通过药物治疗后仍不能控制发作。上世纪90年代人们重新开始关注KD，并将其重新运用于临床，尤其是儿童的耐药性癫痫。多年来，KD的抗惊厥作用在大量急性和慢性癫痫动物模型中被证实。基于大量的临床试验，几乎任何KD方案导致的酮症以及血糖水平降低均可起到抗惊厥作用。在啮齿类动物中，KD治疗1～2周后控制发作的效果最佳。同样在大部分患者中，KD治疗的临床疗效在2周后达到最佳。但值得强调的是，如果在KD治疗期间摄入碳水化合物含量较高的食物，可能会迅速导致突破发作(Breakthrough seizure)，酮症消失。因此，为保证临床疗效，应严格执行KD方案。经典的KD方案中，脂肪和碳水化合物加蛋白质的比例为3：1～4：1，＞90%的热量是由脂肪提供的。在临床应用中，癫痫的饮食治疗通常是在一段时间的禁食之后逐渐增加热量的摄入，最后达到KD的3：1～4：1的比例。一般KD治疗需要住院进行，期间需严密监测血糖、尿酮体和其他代谢指标。
KD治疗的临床功效已广泛认可，但人们对它潜在的作用机制却了解甚少。早期人们认为KD的作用机制与脱水、酸中毒相关，但目前尚无确切证据。部分学者认为KD引起的PH值变化可能直接影响离子通道和神经递质受体以发挥作用[1]。目前，越来越多的因素被发现可能与KD的抗癫痫机制相关，包括膜电位、离子通道、脂肪酸、神经递质和神经保护等。
1 酮体
在饥饿状态下，肝脏代谢脂肪酸生成酮体供能。脂肪酸在肝内进行β-氧化产生大量乙酰辅酶A(Acetyle coenzyme A, CoA)进入三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle, TCA)，其余部分则转变成酮体。正常情况下，丙酮生成的量很少，可经肺呼出，而乙酰乙酸(Acetoxyacetic acid, ACA)和β-羟丁酸(β-Hydroxybutyrate, β-HB)进入血液循环为肝外组织供能。酮体作为KD的主要代谢产物，在抗癫痫作用中发挥了重要的角色。酮体可能通过多种机制发挥作用，它可能影响神经元膜电位、神经递质及其受体等。目前认为酮体可以对ATP敏感的钾(KATP)通道发挥作用。KATP通道在胰岛β细胞中调控胰岛素分泌，细胞内的ATP抑制了KATP通道，当代谢抑制及ATP消耗时, KATP通道激活并产生超极化电位，摄入碳水化合物后，血糖升高，细胞内ATP升高促使该通道关闭，产生动作电位并促进胰岛素分泌。KATP通道在大脑神经元中广泛表达。在低糖培养基培养的神经元中，KATP在小鼠海马CA3神经元超极化的过程中起了重要作用[2]。在进一步的研究中，体外培养的小鼠海马齿状回神经元，加入β-HB后，内向整流KATP通道开放的基础水平升高，刺激诱发KATP通道开放的数目增加[3]。而在活体实验中，KD喂养的大鼠，其海马齿状回处的长时程增强减弱，与神经元抑制相一致[4]。KATP可能是负反馈机制中的一部分，有内在的癫痫保护作用。它的调定点由糖酵解的水平决定，能被酮体代谢操控。也有人认为ACA及其代谢产物丙酮可能激活一种K+泄露通道，K2P通道，一个非排他性的、可选择的KD靶点，它与KATP分属不同的K+通道[5]。它能使细胞膜处于超极化状态以调控突触前及突触后的膜兴奋性。PH值、渗透性、温度变化及特定脂肪酸均能调控该离子通道[6]。但是，酮体的升高与K2P通道之间的联系仍需进一步探索[7]。
静脉注入丙酮和ACA能阻止急性诱发的癫痫发作。在活体实验中，早期研究发现ACA和丙酮确实具有抗癫痫作用，但并没有证据证明其直接调控突触传递或神经兴奋性。在海马CA1区体细胞的电生理实验中也没有发现其影响主要的离子通道来调控神经元兴奋和抑制的证据。在大鼠海马和皮质中，也未发现β-HB或ACA调控γ-氨基丁酸A(GABAA)受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid, AMPA)受体或N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受体。Bough等[8]也发现KD并不改变皮层、海马或小脑的谷氨酸转运蛋白EAAC1。在离体膜片钳实验中，在细胞外给予大鼠海马神经元2mM β-HB或1mM ACA，突触后膜GABAA受体活动没有明显的变化[9]。但在爪蟾卵母细胞中，经过10mM β-HB或50mM ACA孵化5min后，GABAA受体活动显著增加[10]。因此，酮体是否引起神经递质受体变化仍有待验证。
2 脂肪酸
KD中的高脂肪部分可能发挥了抗癫痫作用，其中已有多个实验发现多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)存在抗惊厥作用。PUFA可能通过多种机制来体现其抗惊厥作用，比如调整中枢神经系统细胞膜成分，刺激细胞核内的受体蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferatoractivated receptors, PPARs)的产生，减少炎症作用等。
广泛认可的是，红细胞细胞膜的组成成分能精确反应PUFA的摄入量。在其他组织中也能观察到这种现象，但在大脑中这种调整的机率可能低于其他器官[11]。卵磷脂(Docosahexaenoic acid，DHA)通过血浆从肝脏和脂肪组织转移到大脑可能提高癫痫的发作阈[12]。但是，在大脑细胞膜磷脂中，DHA浓度并没有显著升高，这可能是由于脂质分析在发作后完成，这会导致DHA从细胞膜中释放而引起丢失，也有可能是技术上的误差所导致的[13]。
PPARs是一组神经核受体蛋白，其作用是作为转录因子调控基因的表达。它在细胞的分化、生长和代谢调节中起重要作用。PPARs调节脂质代谢的多个方面，包括脂肪酸氧化、脂肪细胞发育、脂蛋白代谢和保持葡萄糖稳态。PPARs在多种疾病的病理生理过程中表达和调节，包括动脉粥样硬化、炎症、肥胖、糖尿病和免疫反应，被认为是控制癫痫的潜在药物靶点。PPARs通过结合配体改变其配体结合区的形态从而修整PPARs的功能[14]。有意思的是，PPAR-α和PPAR-γ都能被PUFA及其类二十烷酸衍生物和合成的配体如贝他类药物激活。PPRAs的激活刺激涉及脂肪酸氧化的基因转录，通过异二聚体转录因子与维甲酸-X-受体复合物完成[15]。PPRAs有三种亚型：α，β，γ。丙氨酸(Alanine, ALA)和亚麻酸(Linolenic acid, LA)相较于二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)或DHA与PPAR-α有更好的亲合力[16]。动物研究表明选择性兴奋PPAR-α或PPAR-γ可提高发作阈[17]。非诺贝特，一种PPAR-α的强诱导物，对于尾部注射戊四唑和匹鲁卡因的大鼠可增加其惊厥阈值[18]。
N-3 PUFA, 特别是EPA和DHA，还具有抗炎作用，主要通过其羟基化的代谢产物，如脂质调节剂resolvins和protectin D1(PD1)。EPA和DHA与中性粒细胞结合，通过剂量依赖的方式减少了促炎性的前列腺素E2(Prostaglandins, PGE2)的生成。癫痫发作和炎症因子有一定联系，化学刺激或电刺激引起癫痫发作或持续状态，炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等的表达增加，而减少这些炎症因子的药物也能终止癫痫发作[19]。在大鼠中，一些抗炎药物也发挥了一定抗惊厥作用，如环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)抑制剂和IL-1受体拮抗剂[20]。炎症可以引起不成熟的大脑的癫痫发作易感性改变，但这种变化只有在炎症伴随体温升高时出现[21]。在给予COX抑制剂(阿司匹林、萘普生、尼美舒利、罗非考昔)预处理的实验中也显示了上述抑制剂对戊四唑诱发的癫痫发作具有剂量依赖性的抑制作用，选择性的COX-2抑制剂比非选择性的更有效[22]。PD1是由DHA派生的具有共轭三烯结构的生物活性物质，而resolvins又根据其前体不同分为resolvins E(RvEs)，和resolvins D(RvDs)，二者均具有很强的抗炎和炎症修复活性。PDs、RvEs和RvDs分别由DHA和EPA经过COX-2和不同脂氧酶(Lipoxidase，LOX)共同作用而合成的，目前对resolvins和PD1的抗炎机制进行的研究发现，RvE1通过作用ChemR23或BTL1受体发挥抗炎活性，RvD1通过脂氧素A4受体(ALX受体)发挥抗炎作用，而PD1抗炎活性可能与细胞凋亡有关。N-3 PUFA作为resolvins和PD1的内源性前体，在膳食中提高N-3 PUFA的含量，会促进resolvins和PD1的生成，减轻炎症反应[23]。但目前这两者的抗炎机制仍在探索之中，而其是否具抗癫痫作用亟待发掘。
3 神经递质和神经兴奋性
神经元在兴奋和抑制之间维持平衡，过度兴奋或过低的抑制可导致癫痫发作。谷氨酸和GABA是主要的兴奋性和抑制性神经递质，它们被认为是KD抗癫痫作用产生的可能的机制。在动物模型中，谷氨酸受体激动剂、GABA受体拮抗剂可诱发该动物痫性发作[24]。因此，有学者认为KD可能通过改变神经元的中间代谢产物来建立兴奋-抑制平衡。相关研究发现，在谷氨酸能神经元中，天冬氨酸与谷氨酸平衡受β-HB及葡萄糖影响。
葡萄糖和β-HB均能代谢生成CoA，但是葡萄糖主要通过糖酵解在胞浆代谢生成丙酮酸，丙酮酸进入线粒体代谢生成CoA，而β-HB则直接进入线粒体内代谢。当β-HB代谢时，糖酵解过程中的苹果酸-天冬氨酸穿梭(Malate-aspartate shuttle，MAS)活动减少，这一变化可影响细胞内神经兴奋性的氨基酸平衡，尤其是天冬氨酸与谷氨酸之间的平衡。Thrine等[25]的实验显示，在培养的谷氨酸能神经元中，β-HB作为代谢基质较葡萄糖相比，其天冬氨酸水平升高，而谷氨酸水平下降。胞质中的NADH在苹果酸脱氢酶催化下，使草酰乙酸还原成苹果酸，后者借助内膜上的苹果酸-α-酮戊二酸反向转运体进入线粒体并将α-酮戊二酸从线粒体基质中导出到胞浆中。苹果酸又在线粒体内苹果酸脱氢酶的催化下重新生成草酰乙酸和NADH。草酰乙酸经天冬氨酸氨基转移酶催化生成天冬氨酸，而生成天冬氨酸的氨基由谷氨酸提供，因此谷氨酸同时转变成了α-酮戊二酸。在β-HB存在时，苹果酸通过苹果酸-α-酮戊二酸反向转运体介导的穿梭活动减少，这使得更多的α-酮戊二酸进入TCA生成草酰乙酸，β-HB代谢时在ACA转变成CoA这一步时消耗了琥珀酰辅酶A，也进一步加速了TCA，加快的TCA使得合成谷氨酸的游离α-酮戊二酸减少，进而减少了谷氨酸合成(图 1)。有实验显示，当有糖转变为无糖条件时，胞质内的NADH活动减少、MAS受限，大鼠的大脑神经元突触小体及小脑颗粒细胞内的谷氨酸、天冬氨酸有类似的变化[26]。
图1
细胞质中的苹果酸脱氢酶减少及苹果酸与α-酮戊二酸交换的载体可能减少，更多的α-酮戊二酸进入三羧酸循环，草酰乙酸生成增多，并随之增加了天冬氨酸的生成。
注：βHB：β-羟丁酸；AcAc:乙酰乙酸；AcAc-CoA：乙酰化乙酰辅酶A；Ac-CoA：乙酰辅酶A
此外，ACA和β-HB可抑制囊泡谷氨酸转运体(Vesicular glutamate transporters, VGLUTs)，减少谷氨酸进入突触囊泡[27]。而谷氨酸进入突触囊泡的过程依赖于膜电位，现在认为该过程与囊泡外的氯离子有关。氯离子为其别构激活剂，通过改变氯离子依赖性的转运蛋白的结构从而抑制了这个过程，使囊泡外与蛋白结合的氯离子减少，游离氯离子浓度增加，最终减少谷氨酸进入囊泡。而酮体可竞争性抑制该别构激活剂，ACA的抑制作用比β-HB更强[27]。
GABA由谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸脱羧基形成，其在脑内浓度很高，作用是抑制突触传递。在过去的实验研究中发现，喂食KD的动物的前脑和小脑的中有较高水平的β-HB，其突触小体中GABA水平也相应升高。在临床研究中，使用KD的患者其脑脊液中的GABA水平增高，在MR波谱分析上也有相应的体现[28]。Suzuki等[29]发现在星形胶质细胞中，β-HB显著抑制了GABA转氨酶(GABA-transaminase，GABA-T)的活性，并抑制了mRNA的表达。GABA的降解主要由GABA-T催化, 脱氨基生成琥珀酸半醛, 再经琥珀酸半醛脱氢酶催化生成琥珀酸, 进入TCA[30]。因此较高的β-HB水平可能通过抑制其降解的过程最终使GABA水平升高。此外，GABA水平升高可刺激氯离子通道受体，增加氯离子内流，诱导细胞膜超极化，抑制了引起细胞兴奋的钠离子和钙离子通道。
去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)是一个内源性的，强有力的抗惊厥物质。脑内的蓝斑是肾上腺素能神经元的主要来源，刺激蓝斑或给予肾上腺素受体激动剂可抑制癫痫样活动；而蓝斑处如有病灶，NE耗损，或给予肾上腺素受体拮抗剂，可加剧细胞过度兴奋并引发癫痫发生。实验中发现，喂养KD的大鼠与正常饮食的大鼠相比，细胞外NE水平高出2倍。在进一步实验中，将敲除与NE合成有关的多巴胺β-HB(Dbh-/-)的小鼠及未敲除(Dbh+/-)的小鼠用KD及正常饮食分别喂养2周后，使其暴露于六氟二乙酯(flurothyl)中诱发癫痫发作，发现喂养KD的Dbh+/-小鼠的发作潜伏期延长。因此，可以推测KD可增加细胞外NE浓度。但目前该机制尚不清楚。David等[31]认为这种细胞外NE水平的调控可能与细胞膜上的NE转运蛋白(NET)相关。但在后来的实验中，敲除NET并喂食KD的小鼠给予最大电休克刺激时，并未观察到预期的抗惊厥效果。
近期研究发现，KD的抗癫痫机制可能与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)有关。mTOR是一个丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是一个重要的、特征性的细胞内代谢信号的整合蛋白。这一途径对于代谢的变化能直接作出反应，如饥饿、ATP/AMP比值下降和低血糖症，也可调节蛋白翻译，脂质合成，自体吞噬，线粒体生物合成等过程。mTOR蛋白位于突触，当其与雷帕霉素的结合受抑制时，会直接损害晚期的长时程增强和长时程抑制[32]。其过度活动具有病理性，会导致一些疾病，如结节性硬化、Cowden综合征以及某些癌症。在基因突变致该蛋白改变的小鼠模型中，抑制与雷帕霉素结合的靶蛋白可减少小鼠的自发性癫痫发作。在其他癫痫动物模型中，雷帕霉素也能减少它们的发作，如红藻氨酸(Kainicacid，KA)诱发大鼠自发性癫痫发作，普鲁卡品诱发的大鼠癫痫持续状态，低氧诱导的大鼠惊厥等，而这些模型中，mTOR蛋白较为活跃。另外，一个临床实验表明，依维莫司(everolimus)，一种雷帕霉素类似物，可以抑制结节性硬化患者的癫痫发作。因此，这为mTOR蛋白抑制剂用于临床治疗癫痫创造了一定的可能性[33]。mTOR蛋白作用机制可能与其改变神经元的兴奋性有关，可能通过改变树突棘的结构来改变突触功能，或改变神经递质释放, 离子通道表达, 或突触蛋白的表达等途径来发挥其作用[34-36]。目前发现，KD可抑制mTOR蛋白的激活，这可能是KD的抗癫痫机制之一[37]。但是，雷帕霉素和KD在急性动物模型中并没有表现出一致的效果。雷帕霉素对于6Hz电休克模型无效，而KD对其却有较好的疗效[38, 39]。因此，KD是否通过抑制mTOR蛋白来发挥其作用仍有待探究。
4 神经保护
癫痫的发生率随年龄增加而升高，而氧化应激是衰老及退行性病变的主要机制，提示氧化应激与癫痫发生相关。在KA所致的小鼠癫痫持续状态模型中，在注射KA 16 h后，TCA中的顺乌头酸酶明显灭活[40]。顺乌头酸酶是一个氧化还原敏感的酶，可作为细胞内O2-产生的标记物。此外，海马CA3区DNA氧化损伤及广泛的神经元死亡也在该模型中被观察到。而大量表达锰超氧化物岐化酶(MnSOD)的小鼠中，其神经元存活率提高。这提示O2-产生可能是癫痫持续状态中导致大量神经元死亡的原因[40]。也有研究也证明KA引起的癫痫持续状态中，线粒体氧化还原量发生了改变。在该研究中，大鼠海马的还原性谷胱甘肽水平下降而氧化性谷胱甘肽水平升高。此外，KA模型中的脂质过氧化反应产物增多，其主要产物异前列腺素的产生与线粒体氧化应激有关[41]。
KD可减少氧化损伤，起到抗癫痫作用。线粒体是ROS/RNS的主要来源，其呼吸链中的复合体Ⅰ/Ⅲ对于氧化调节较为敏感。有研究发现，创伤性脑损伤(TBI)可导致线粒体功能障碍，使复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活动受到抑制。而KD可改善复合体Ⅱ/Ⅲ的抑制，并显著改善了细胞质、线粒体中的氧化应激。Haces等[42]发现离体实验中，β-HB和ACA能直接清除OH-，ACA能直接清除次氯酸(HOCL)，ONOO-及单态氧。将β-HB、ACA分别加入含谷氨酸的神经元以及含钙离子的线粒体中，两者均抑制了O2-的聚积。在急性大鼠脑皮质切片中，这两种酮体也能减少H2O2引起的细胞死亡[43]。Greco等[44]发现超生理量浓度的酮体可直接清除自由基。在更进一步的研究中，给予低糖动物模型500 mg/kg的β-HB，检测到血浆β-HB浓度为0.371 mM，可显著减少脑内的氧化应激。除了直接清除自由基，KD也诱发了抗氧化蛋白的表达[42]。超氧歧化酶(SOD1/2)和萘醌(NQO1)均能清除O2-，并受Nrf2信号调控，而Nrf2已被发现能被酮体及KD激活。此外，喂养KD 4周以上的大鼠其海马中的线粒体明显高于对照组，因此，KD可能刺激了线粒体的生物合成[45]。在喂养KD 10～12 d后，小鼠海马内解偶联蛋白水平也被观察到升高，而这些小鼠的线粒体产生的ROS减少[46]。由此可推测KD可上调线粒体解偶联蛋白(Uncoupling proteins，UCPs)[47]。脂肪酸也可引起UCP表达增加，其机制可能是通过PPAR和FOX家族等转录因子的活化所致[48]。
最近研究发现，ACA和β-HB可通过线粒体渗透性转变(mitochondrial permeability transition，mPT)激活剂介导的氧化应激来阻止神经元死亡。ACA和β-HB有着与mPT阻滞剂环孢素A类似的作用——能提高钙离子诱导的mPT开放的阈值[43]。持续的癫痫样的活动可导致胶质细胞中的Mg2+降低，导致细胞膜去极化和mPT开放，致使细胞死亡，而环孢素A能抑制该过程，增加细胞的成活率[49]。有学者Kcna1基因突变的小鼠作为癫痫模型，观察KD和酮体(Ketone bodies, KB)对线粒体通透性转换孔和海马长时程增加的作用，数据表明KB具有抗癫痫发作及促智作用，其抗癫痫作用直接与mPT有关[50]。
5 结语
尽管KD应用于临床已有近百年的历史，但其抗癫痫机制仍不清楚。由于KD限制了葡萄糖的摄入，导致大脑中酮体和游离脂肪酸的含量增高。这种特殊的代谢状态如果长时间维持，可以转换能量产生的来源。酮体、脂肪酸成为主要的能量代谢来源，它们可能通过多种机制来发挥抗癫痫作用。神经递质、细胞膜电位变化、离子通道等多种因素最终导致细胞兴奋性的改变。线粒体通过氧化还原、渗透性转变等起到了神经保护作用。而最近发现的mTOR蛋白可作为药物靶点，为新药的研发提供了新方向。
生酮饮食(Ketogenic diet，KD)是一个高脂肪、低碳水化合物、适量蛋白质、维生素和矿物质的饮食。早在19世纪20年代，人们就开始使用KD治疗癫痫，但在30年代晚期，由于抗癫痫药物(AEDs)苯妥英钠的发现，KD疗法迅速退出了临床治疗的舞台。随着时间的推移，越来越多的AEDs被发现并运用于临床，但仍有近1/3的患者通过药物治疗后仍不能控制发作。上世纪90年代人们重新开始关注KD，并将其重新运用于临床，尤其是儿童的耐药性癫痫。多年来，KD的抗惊厥作用在大量急性和慢性癫痫动物模型中被证实。基于大量的临床试验，几乎任何KD方案导致的酮症以及血糖水平降低均可起到抗惊厥作用。在啮齿类动物中，KD治疗1～2周后控制发作的效果最佳。同样在大部分患者中，KD治疗的临床疗效在2周后达到最佳。但值得强调的是，如果在KD治疗期间摄入碳水化合物含量较高的食物，可能会迅速导致突破发作(Breakthrough seizure)，酮症消失。因此，为保证临床疗效，应严格执行KD方案。经典的KD方案中，脂肪和碳水化合物加蛋白质的比例为3：1～4：1，＞90%的热量是由脂肪提供的。在临床应用中，癫痫的饮食治疗通常是在一段时间的禁食之后逐渐增加热量的摄入，最后达到KD的3：1～4：1的比例。一般KD治疗需要住院进行，期间需严密监测血糖、尿酮体和其他代谢指标。
KD治疗的临床功效已广泛认可，但人们对它潜在的作用机制却了解甚少。早期人们认为KD的作用机制与脱水、酸中毒相关，但目前尚无确切证据。部分学者认为KD引起的PH值变化可能直接影响离子通道和神经递质受体以发挥作用[1]。目前，越来越多的因素被发现可能与KD的抗癫痫机制相关，包括膜电位、离子通道、脂肪酸、神经递质和神经保护等。
1 酮体
在饥饿状态下，肝脏代谢脂肪酸生成酮体供能。脂肪酸在肝内进行β-氧化产生大量乙酰辅酶A(Acetyle coenzyme A, CoA)进入三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle, TCA)，其余部分则转变成酮体。正常情况下，丙酮生成的量很少，可经肺呼出，而乙酰乙酸(Acetoxyacetic acid, ACA)和β-羟丁酸(β-Hydroxybutyrate, β-HB)进入血液循环为肝外组织供能。酮体作为KD的主要代谢产物，在抗癫痫作用中发挥了重要的角色。酮体可能通过多种机制发挥作用，它可能影响神经元膜电位、神经递质及其受体等。目前认为酮体可以对ATP敏感的钾(KATP)通道发挥作用。KATP通道在胰岛β细胞中调控胰岛素分泌，细胞内的ATP抑制了KATP通道，当代谢抑制及ATP消耗时, KATP通道激活并产生超极化电位，摄入碳水化合物后，血糖升高，细胞内ATP升高促使该通道关闭，产生动作电位并促进胰岛素分泌。KATP通道在大脑神经元中广泛表达。在低糖培养基培养的神经元中，KATP在小鼠海马CA3神经元超极化的过程中起了重要作用[2]。在进一步的研究中，体外培养的小鼠海马齿状回神经元，加入β-HB后，内向整流KATP通道开放的基础水平升高，刺激诱发KATP通道开放的数目增加[3]。而在活体实验中，KD喂养的大鼠，其海马齿状回处的长时程增强减弱，与神经元抑制相一致[4]。KATP可能是负反馈机制中的一部分，有内在的癫痫保护作用。它的调定点由糖酵解的水平决定，能被酮体代谢操控。也有人认为ACA及其代谢产物丙酮可能激活一种K+泄露通道，K2P通道，一个非排他性的、可选择的KD靶点，它与KATP分属不同的K+通道[5]。它能使细胞膜处于超极化状态以调控突触前及突触后的膜兴奋性。PH值、渗透性、温度变化及特定脂肪酸均能调控该离子通道[6]。但是，酮体的升高与K2P通道之间的联系仍需进一步探索[7]。
静脉注入丙酮和ACA能阻止急性诱发的癫痫发作。在活体实验中，早期研究发现ACA和丙酮确实具有抗癫痫作用，但并没有证据证明其直接调控突触传递或神经兴奋性。在海马CA1区体细胞的电生理实验中也没有发现其影响主要的离子通道来调控神经元兴奋和抑制的证据。在大鼠海马和皮质中，也未发现β-HB或ACA调控γ-氨基丁酸A(GABAA)受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid, AMPA)受体或N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受体。Bough等[8]也发现KD并不改变皮层、海马或小脑的谷氨酸转运蛋白EAAC1。在离体膜片钳实验中，在细胞外给予大鼠海马神经元2mM β-HB或1mM ACA，突触后膜GABAA受体活动没有明显的变化[9]。但在爪蟾卵母细胞中，经过10mM β-HB或50mM ACA孵化5min后，GABAA受体活动显著增加[10]。因此，酮体是否引起神经递质受体变化仍有待验证。
2 脂肪酸
KD中的高脂肪部分可能发挥了抗癫痫作用，其中已有多个实验发现多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)存在抗惊厥作用。PUFA可能通过多种机制来体现其抗惊厥作用，比如调整中枢神经系统细胞膜成分，刺激细胞核内的受体蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferatoractivated receptors, PPARs)的产生，减少炎症作用等。
广泛认可的是，红细胞细胞膜的组成成分能精确反应PUFA的摄入量。在其他组织中也能观察到这种现象，但在大脑中这种调整的机率可能低于其他器官[11]。卵磷脂(Docosahexaenoic acid，DHA)通过血浆从肝脏和脂肪组织转移到大脑可能提高癫痫的发作阈[12]。但是，在大脑细胞膜磷脂中，DHA浓度并没有显著升高，这可能是由于脂质分析在发作后完成，这会导致DHA从细胞膜中释放而引起丢失，也有可能是技术上的误差所导致的[13]。
PPARs是一组神经核受体蛋白，其作用是作为转录因子调控基因的表达。它在细胞的分化、生长和代谢调节中起重要作用。PPARs调节脂质代谢的多个方面，包括脂肪酸氧化、脂肪细胞发育、脂蛋白代谢和保持葡萄糖稳态。PPARs在多种疾病的病理生理过程中表达和调节，包括动脉粥样硬化、炎症、肥胖、糖尿病和免疫反应，被认为是控制癫痫的潜在药物靶点。PPARs通过结合配体改变其配体结合区的形态从而修整PPARs的功能[14]。有意思的是，PPAR-α和PPAR-γ都能被PUFA及其类二十烷酸衍生物和合成的配体如贝他类药物激活。PPRAs的激活刺激涉及脂肪酸氧化的基因转录，通过异二聚体转录因子与维甲酸-X-受体复合物完成[15]。PPRAs有三种亚型：α，β，γ。丙氨酸(Alanine, ALA)和亚麻酸(Linolenic acid, LA)相较于二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)或DHA与PPAR-α有更好的亲合力[16]。动物研究表明选择性兴奋PPAR-α或PPAR-γ可提高发作阈[17]。非诺贝特，一种PPAR-α的强诱导物，对于尾部注射戊四唑和匹鲁卡因的大鼠可增加其惊厥阈值[18]。
N-3 PUFA, 特别是EPA和DHA，还具有抗炎作用，主要通过其羟基化的代谢产物，如脂质调节剂resolvins和protectin D1(PD1)。EPA和DHA与中性粒细胞结合，通过剂量依赖的方式减少了促炎性的前列腺素E2(Prostaglandins, PGE2)的生成。癫痫发作和炎症因子有一定联系，化学刺激或电刺激引起癫痫发作或持续状态，炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等的表达增加，而减少这些炎症因子的药物也能终止癫痫发作[19]。在大鼠中，一些抗炎药物也发挥了一定抗惊厥作用，如环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)抑制剂和IL-1受体拮抗剂[20]。炎症可以引起不成熟的大脑的癫痫发作易感性改变，但这种变化只有在炎症伴随体温升高时出现[21]。在给予COX抑制剂(阿司匹林、萘普生、尼美舒利、罗非考昔)预处理的实验中也显示了上述抑制剂对戊四唑诱发的癫痫发作具有剂量依赖性的抑制作用，选择性的COX-2抑制剂比非选择性的更有效[22]。PD1是由DHA派生的具有共轭三烯结构的生物活性物质，而resolvins又根据其前体不同分为resolvins E(RvEs)，和resolvins D(RvDs)，二者均具有很强的抗炎和炎症修复活性。PDs、RvEs和RvDs分别由DHA和EPA经过COX-2和不同脂氧酶(Lipoxidase，LOX)共同作用而合成的，目前对resolvins和PD1的抗炎机制进行的研究发现，RvE1通过作用ChemR23或BTL1受体发挥抗炎活性，RvD1通过脂氧素A4受体(ALX受体)发挥抗炎作用，而PD1抗炎活性可能与细胞凋亡有关。N-3 PUFA作为resolvins和PD1的内源性前体，在膳食中提高N-3 PUFA的含量，会促进resolvins和PD1的生成，减轻炎症反应[23]。但目前这两者的抗炎机制仍在探索之中，而其是否具抗癫痫作用亟待发掘。
3 神经递质和神经兴奋性
神经元在兴奋和抑制之间维持平衡，过度兴奋或过低的抑制可导致癫痫发作。谷氨酸和GABA是主要的兴奋性和抑制性神经递质，它们被认为是KD抗癫痫作用产生的可能的机制。在动物模型中，谷氨酸受体激动剂、GABA受体拮抗剂可诱发该动物痫性发作[24]。因此，有学者认为KD可能通过改变神经元的中间代谢产物来建立兴奋-抑制平衡。相关研究发现，在谷氨酸能神经元中，天冬氨酸与谷氨酸平衡受β-HB及葡萄糖影响。
葡萄糖和β-HB均能代谢生成CoA，但是葡萄糖主要通过糖酵解在胞浆代谢生成丙酮酸，丙酮酸进入线粒体代谢生成CoA，而β-HB则直接进入线粒体内代谢。当β-HB代谢时，糖酵解过程中的苹果酸-天冬氨酸穿梭(Malate-aspartate shuttle，MAS)活动减少，这一变化可影响细胞内神经兴奋性的氨基酸平衡，尤其是天冬氨酸与谷氨酸之间的平衡。Thrine等[25]的实验显示，在培养的谷氨酸能神经元中，β-HB作为代谢基质较葡萄糖相比，其天冬氨酸水平升高，而谷氨酸水平下降。胞质中的NADH在苹果酸脱氢酶催化下，使草酰乙酸还原成苹果酸，后者借助内膜上的苹果酸-α-酮戊二酸反向转运体进入线粒体并将α-酮戊二酸从线粒体基质中导出到胞浆中。苹果酸又在线粒体内苹果酸脱氢酶的催化下重新生成草酰乙酸和NADH。草酰乙酸经天冬氨酸氨基转移酶催化生成天冬氨酸，而生成天冬氨酸的氨基由谷氨酸提供，因此谷氨酸同时转变成了α-酮戊二酸。在β-HB存在时，苹果酸通过苹果酸-α-酮戊二酸反向转运体介导的穿梭活动减少，这使得更多的α-酮戊二酸进入TCA生成草酰乙酸，β-HB代谢时在ACA转变成CoA这一步时消耗了琥珀酰辅酶A，也进一步加速了TCA，加快的TCA使得合成谷氨酸的游离α-酮戊二酸减少，进而减少了谷氨酸合成(图 1)。有实验显示，当有糖转变为无糖条件时，胞质内的NADH活动减少、MAS受限，大鼠的大脑神经元突触小体及小脑颗粒细胞内的谷氨酸、天冬氨酸有类似的变化[26]。
图1
细胞质中的苹果酸脱氢酶减少及苹果酸与α-酮戊二酸交换的载体可能减少，更多的α-酮戊二酸进入三羧酸循环，草酰乙酸生成增多，并随之增加了天冬氨酸的生成。
注：βHB：β-羟丁酸；AcAc:乙酰乙酸；AcAc-CoA：乙酰化乙酰辅酶A；Ac-CoA：乙酰辅酶A
此外，ACA和β-HB可抑制囊泡谷氨酸转运体(Vesicular glutamate transporters, VGLUTs)，减少谷氨酸进入突触囊泡[27]。而谷氨酸进入突触囊泡的过程依赖于膜电位，现在认为该过程与囊泡外的氯离子有关。氯离子为其别构激活剂，通过改变氯离子依赖性的转运蛋白的结构从而抑制了这个过程，使囊泡外与蛋白结合的氯离子减少，游离氯离子浓度增加，最终减少谷氨酸进入囊泡。而酮体可竞争性抑制该别构激活剂，ACA的抑制作用比β-HB更强[27]。
GABA由谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸脱羧基形成，其在脑内浓度很高，作用是抑制突触传递。在过去的实验研究中发现，喂食KD的动物的前脑和小脑的中有较高水平的β-HB，其突触小体中GABA水平也相应升高。在临床研究中，使用KD的患者其脑脊液中的GABA水平增高，在MR波谱分析上也有相应的体现[28]。Suzuki等[29]发现在星形胶质细胞中，β-HB显著抑制了GABA转氨酶(GABA-transaminase，GABA-T)的活性，并抑制了mRNA的表达。GABA的降解主要由GABA-T催化, 脱氨基生成琥珀酸半醛, 再经琥珀酸半醛脱氢酶催化生成琥珀酸, 进入TCA[30]。因此较高的β-HB水平可能通过抑制其降解的过程最终使GABA水平升高。此外，GABA水平升高可刺激氯离子通道受体，增加氯离子内流，诱导细胞膜超极化，抑制了引起细胞兴奋的钠离子和钙离子通道。
去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)是一个内源性的，强有力的抗惊厥物质。脑内的蓝斑是肾上腺素能神经元的主要来源，刺激蓝斑或给予肾上腺素受体激动剂可抑制癫痫样活动；而蓝斑处如有病灶，NE耗损，或给予肾上腺素受体拮抗剂，可加剧细胞过度兴奋并引发癫痫发生。实验中发现，喂养KD的大鼠与正常饮食的大鼠相比，细胞外NE水平高出2倍。在进一步实验中，将敲除与NE合成有关的多巴胺β-HB(Dbh-/-)的小鼠及未敲除(Dbh+/-)的小鼠用KD及正常饮食分别喂养2周后，使其暴露于六氟二乙酯(flurothyl)中诱发癫痫发作，发现喂养KD的Dbh+/-小鼠的发作潜伏期延长。因此，可以推测KD可增加细胞外NE浓度。但目前该机制尚不清楚。David等[31]认为这种细胞外NE水平的调控可能与细胞膜上的NE转运蛋白(NET)相关。但在后来的实验中，敲除NET并喂食KD的小鼠给予最大电休克刺激时，并未观察到预期的抗惊厥效果。
近期研究发现，KD的抗癫痫机制可能与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)有关。mTOR是一个丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是一个重要的、特征性的细胞内代谢信号的整合蛋白。这一途径对于代谢的变化能直接作出反应，如饥饿、ATP/AMP比值下降和低血糖症，也可调节蛋白翻译，脂质合成，自体吞噬，线粒体生物合成等过程。mTOR蛋白位于突触，当其与雷帕霉素的结合受抑制时，会直接损害晚期的长时程增强和长时程抑制[32]。其过度活动具有病理性，会导致一些疾病，如结节性硬化、Cowden综合征以及某些癌症。在基因突变致该蛋白改变的小鼠模型中，抑制与雷帕霉素结合的靶蛋白可减少小鼠的自发性癫痫发作。在其他癫痫动物模型中，雷帕霉素也能减少它们的发作，如红藻氨酸(Kainicacid，KA)诱发大鼠自发性癫痫发作，普鲁卡品诱发的大鼠癫痫持续状态，低氧诱导的大鼠惊厥等，而这些模型中，mTOR蛋白较为活跃。另外，一个临床实验表明，依维莫司(everolimus)，一种雷帕霉素类似物，可以抑制结节性硬化患者的癫痫发作。因此，这为mTOR蛋白抑制剂用于临床治疗癫痫创造了一定的可能性[33]。mTOR蛋白作用机制可能与其改变神经元的兴奋性有关，可能通过改变树突棘的结构来改变突触功能，或改变神经递质释放, 离子通道表达, 或突触蛋白的表达等途径来发挥其作用[34-36]。目前发现，KD可抑制mTOR蛋白的激活，这可能是KD的抗癫痫机制之一[37]。但是，雷帕霉素和KD在急性动物模型中并没有表现出一致的效果。雷帕霉素对于6Hz电休克模型无效，而KD对其却有较好的疗效[38, 39]。因此，KD是否通过抑制mTOR蛋白来发挥其作用仍有待探究。
4 神经保护
癫痫的发生率随年龄增加而升高，而氧化应激是衰老及退行性病变的主要机制，提示氧化应激与癫痫发生相关。在KA所致的小鼠癫痫持续状态模型中，在注射KA 16 h后，TCA中的顺乌头酸酶明显灭活[40]。顺乌头酸酶是一个氧化还原敏感的酶，可作为细胞内O2-产生的标记物。此外，海马CA3区DNA氧化损伤及广泛的神经元死亡也在该模型中被观察到。而大量表达锰超氧化物岐化酶(MnSOD)的小鼠中，其神经元存活率提高。这提示O2-产生可能是癫痫持续状态中导致大量神经元死亡的原因[40]。也有研究也证明KA引起的癫痫持续状态中，线粒体氧化还原量发生了改变。在该研究中，大鼠海马的还原性谷胱甘肽水平下降而氧化性谷胱甘肽水平升高。此外，KA模型中的脂质过氧化反应产物增多，其主要产物异前列腺素的产生与线粒体氧化应激有关[41]。
KD可减少氧化损伤，起到抗癫痫作用。线粒体是ROS/RNS的主要来源，其呼吸链中的复合体Ⅰ/Ⅲ对于氧化调节较为敏感。有研究发现，创伤性脑损伤(TBI)可导致线粒体功能障碍，使复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活动受到抑制。而KD可改善复合体Ⅱ/Ⅲ的抑制，并显著改善了细胞质、线粒体中的氧化应激。Haces等[42]发现离体实验中，β-HB和ACA能直接清除OH-，ACA能直接清除次氯酸(HOCL)，ONOO-及单态氧。将β-HB、ACA分别加入含谷氨酸的神经元以及含钙离子的线粒体中，两者均抑制了O2-的聚积。在急性大鼠脑皮质切片中，这两种酮体也能减少H2O2引起的细胞死亡[43]。Greco等[44]发现超生理量浓度的酮体可直接清除自由基。在更进一步的研究中，给予低糖动物模型500 mg/kg的β-HB，检测到血浆β-HB浓度为0.371 mM，可显著减少脑内的氧化应激。除了直接清除自由基，KD也诱发了抗氧化蛋白的表达[42]。超氧歧化酶(SOD1/2)和萘醌(NQO1)均能清除O2-，并受Nrf2信号调控，而Nrf2已被发现能被酮体及KD激活。此外，喂养KD 4周以上的大鼠其海马中的线粒体明显高于对照组，因此，KD可能刺激了线粒体的生物合成[45]。在喂养KD 10～12 d后，小鼠海马内解偶联蛋白水平也被观察到升高，而这些小鼠的线粒体产生的ROS减少[46]。由此可推测KD可上调线粒体解偶联蛋白(Uncoupling proteins，UCPs)[47]。脂肪酸也可引起UCP表达增加，其机制可能是通过PPAR和FOX家族等转录因子的活化所致[48]。
最近研究发现，ACA和β-HB可通过线粒体渗透性转变(mitochondrial permeability transition，mPT)激活剂介导的氧化应激来阻止神经元死亡。ACA和β-HB有着与mPT阻滞剂环孢素A类似的作用——能提高钙离子诱导的mPT开放的阈值[43]。持续的癫痫样的活动可导致胶质细胞中的Mg2+降低，导致细胞膜去极化和mPT开放，致使细胞死亡，而环孢素A能抑制该过程，增加细胞的成活率[49]。有学者Kcna1基因突变的小鼠作为癫痫模型，观察KD和酮体(Ketone bodies, KB)对线粒体通透性转换孔和海马长时程增加的作用，数据表明KB具有抗癫痫发作及促智作用，其抗癫痫作用直接与mPT有关[50]。
5 结语
尽管KD应用于临床已有近百年的历史，但其抗癫痫机制仍不清楚。由于KD限制了葡萄糖的摄入，导致大脑中酮体和游离脂肪酸的含量增高。这种特殊的代谢状态如果长时间维持，可以转换能量产生的来源。酮体、脂肪酸成为主要的能量代谢来源，它们可能通过多种机制来发挥抗癫痫作用。神经递质、细胞膜电位变化、离子通道等多种因素最终导致细胞兴奋性的改变。线粒体通过氧化还原、渗透性转变等起到了神经保护作用。而最近发现的mTOR蛋白可作为药物靶点，为新药的研发提供了新方向。
